朱曉立，俞巍蔚

枯草芽孢桿菌產(chǎn)芽孢發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化研究

朱曉立1，俞巍蔚2

（1.廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與生物工程系，廣東廣州 510300；
2.廣州市蔚林生物科技有限公司，廣東廣州 510640）

在三角瓶培養(yǎng)條件下，采用單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)枯草芽孢桿菌 B53 發(fā)酵培養(yǎng)基碳源、氮源進(jìn)行了優(yōu)化。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了正交實(shí)驗(yàn)，確定了菌株B53最佳的產(chǎn)孢發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖25g/L、大豆蛋白胨14g/L、玉米漿17g/L、NaCl 3g/L，MgSO40.2g/ L。在最優(yōu)條件下發(fā)酵培養(yǎng)，芽孢濃度為9.6×109個(gè)/mL。

枯草芽孢桿菌；芽孢；發(fā)酵培養(yǎng)基；優(yōu)化

枯草芽孢桿菌是芽孢桿菌屬的一種，革蘭氏陽(yáng)性菌，芽孢（0.6～0.9）×（1.0～1.5）μm，橢圓到柱狀，位于菌體中央或稍偏，芽孢形成后菌體不膨大，生長(zhǎng)溫度：最高溫度45～55℃；最低溫度 5～20℃。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黃色，在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，常形成皺醭。枯草芽孢桿菌已廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)、酶制劑產(chǎn)業(yè)、病蟲害防治等領(lǐng)域［1］。通過提高枯草芽孢桿菌芽孢比例，使得活菌制劑的活菌數(shù)量得到保障［2］。芽孢具有較好的抗逆性，可以抵抗外界的環(huán)境壓力，可以提高活菌制劑的穩(wěn)定性，保證其使用效果［3］。

本研究用的枯草芽孢桿菌是能生產(chǎn)堿性蛋白酶的菌株，可有效降解飼料中的某些抗?fàn)I養(yǎng)因子，提高飼料轉(zhuǎn)化率。這株枯草芽孢桿菌具有廣闊的發(fā)展前景，能在農(nóng)業(yè)生物防治、畜牧、水產(chǎn)養(yǎng)殖等方面廣泛應(yīng)用，產(chǎn)生一定的社會(huì)效益和生態(tài)效益。

1　材料與方法

1.1菌株

枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis B53由廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與生物工程系保存。

1.2培養(yǎng)基

平板培養(yǎng)基：葡萄糖1g/L，酵母膏0.5g/L，大豆蛋白胨1g/L，MgSO40.2g/L，瓊脂20g/L

種子培養(yǎng)基：蛋白胨5g/L，酵母粉1g/L，可溶性淀粉5g/L，MgSO40.2g/L

搖瓶基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖10g/L，NaCl 3g/L，大豆蛋白胨5g/L，MgSO40.2g/L

以上培養(yǎng)基pH7.0～7.2，121℃滅菌20min。

1.3培養(yǎng)方法

種子培養(yǎng)：從斜面中勾取一環(huán)菌種接入裝有30mL種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，37℃，150r/min，振蕩培養(yǎng)24h。

搖瓶培養(yǎng)：取3mL種子液接入已裝有27mL搖瓶培養(yǎng)基的三角瓶中（接種量為10%），放在搖床中，150r/min，37℃振蕩培養(yǎng)6h后，每隔3h取一次樣進(jìn)行稀釋涂布，進(jìn)行單因素探究。

1.4菌體及芽孢計(jì)數(shù)

采用平板稀釋涂布法測(cè)菌數(shù)；80℃水浴15min，用平板稀釋法檢測(cè)芽孢生成量。

1.5單因素實(shí)驗(yàn)

1.5.1最佳碳源的確定

分別用玉米淀粉，果糖，木糖，乳糖，糖蜜，蔗糖等代替1.2中的搖瓶基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的葡萄糖，其中相對(duì)分子質(zhì)量保持一致，其他組分均相同，采用搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，用稀釋平板計(jì)數(shù)法來測(cè)定發(fā)酵液中菌數(shù)和芽孢數(shù)，確定最佳碳源。

1.5.2最佳碳源濃度的確定

在確定好最佳碳源后，選取碳源濃度分別為1%、2%、3%、4%、5%，進(jìn)行最佳碳源濃度的確定。培養(yǎng)方法同1.3，檢測(cè)方法同1.4。

1.5.3最佳氮源的確定

分別用尿素，硫酸銨，檸檬酸銨，酵母粉，玉米漿，NH4H2PO4，（NH4）2HPO4等代替1.2中的搖瓶基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的大豆蛋白胨，其中相對(duì)分子質(zhì)量保持一致，其他成分均相同，采用搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，用稀釋平板計(jì)數(shù)法來測(cè)定發(fā)酵液中菌數(shù)和芽孢數(shù)，確定最佳氮源。

1.5.4最佳氮源濃度的確定

在確定好最佳氮源后，選取氮源濃度分別為1%、2%、3%、4%、5%，進(jìn)行最佳氮源濃度的確定。培養(yǎng)方法同1.3，檢測(cè)方法同1.4。

1.6正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

利用篩選出的一種碳源，以及兩種氮源，設(shè)計(jì)三因素四水平。搖瓶培養(yǎng)到第24h取樣檢測(cè)。培養(yǎng)方法同1.3，檢測(cè)方法同1.4。

2　結(jié)果與討論

2.1單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1碳源種類及碳源濃度對(duì)芽孢數(shù)量的影響

7種碳源對(duì)枯草芽孢桿菌芽孢生成影響如表1所示。單糖容易利用，二糖和多糖要經(jīng)過微生物水解為單糖才可被微生物利用，所以在相同時(shí)間內(nèi)菌體生長(zhǎng)和芽孢生成的速度有所不同，單糖作為碳源時(shí)菌體生長(zhǎng)較快。

表1　不同碳源對(duì)菌體芽孢生成的影響

木糖和乳糖作為唯一碳源時(shí)，菌體芽孢生成很少，最高僅能達(dá)到106，說明這兩種碳源不能被菌體較好的利用，促進(jìn)菌體生長(zhǎng)和芽孢生成。糖蜜、果糖、蔗糖和玉米淀粉作為唯一碳源，菌體芽孢雖然能達(dá)到107，但是培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)。葡萄糖作為唯一碳源，菌體芽孢生成速率較快，12h達(dá)到108，15h峰值達(dá)到6.2×108個(gè)/mL。在7種碳源中，葡萄糖極易被菌體利用，有利于芽孢產(chǎn)生，是最佳碳源。

選取不同濃度葡萄糖進(jìn)行菌體芽孢生成結(jié)果，如表2所示。20g/L葡萄糖條件下，芽孢在15h達(dá)到9.3×108個(gè)/mL。隨著葡萄糖濃度增加，芽孢生成量總體下降，40g/L 和50g/L時(shí)，芽孢數(shù)量級(jí)僅達(dá)到107。葡萄糖濃度過高，對(duì)菌體芽孢的生成有抑制作用。因此，選取20g/L葡萄糖濃度進(jìn)行后續(xù)研究。

表2　不同碳源濃度對(duì)菌體芽孢生成的影響（葡萄糖）

2.1.2氮源種類及氮源濃度對(duì)芽孢數(shù)量的影響

9種氮源對(duì)枯草芽孢桿菌芽孢生成影響如表3所示。尿素、（NH4）2HPO4、檸檬酸銨做為唯一氮源，在培養(yǎng)期間最高芽孢濃度的數(shù)量級(jí)相對(duì)很低，說明多摩爾數(shù)的NH4+不利于菌體利用，生成芽孢。氯化銨和硫酸銨作為唯一氮源，芽孢濃度最高能達(dá)到107，NH4H2PO4作為唯一氮源達(dá)到2.1×108個(gè)/mL，但是相對(duì)有機(jī)氮源仍然較低。大豆蛋白胨、玉米漿、酵母粉做為作一氮源時(shí)，培養(yǎng)12h后芽孢濃度數(shù)量級(jí)均能達(dá)到108，大豆蛋白胨15h芽孢濃度達(dá)到最高的6.2×108個(gè)/mL，玉米漿18h芽孢濃度達(dá)到最高的7.5×108個(gè)/mL，而酵母粉芽孢最高濃度僅為3.0×108。大豆蛋白胨和玉米漿都富含蛋白質(zhì)和氨基酸，對(duì)菌體的生長(zhǎng)都起到很大的作用，是飼料行業(yè)較為理想的選擇，而玉米漿中含有生物素，在制藥行業(yè)中可用于抗生素的生產(chǎn)，對(duì)菌體的生長(zhǎng)也起到了很好的保障。因此，選取大豆蛋白胨和玉米漿作為最佳氮源。

表3　不同氮源對(duì)菌體芽孢生成的影響

表4　不同氮源濃度對(duì)菌體芽孢生成的影響（大豆蛋白胨）

表5　不同氮源濃度對(duì)菌體芽孢生成的影響（玉米漿）

15g/L玉米漿條件下，芽孢濃度在18h達(dá)到7.3×108個(gè)/mL。隨著玉米漿濃度增加到20g/L，芽孢生成量總體下降，芽孢最高濃度推達(dá)到3.7×108個(gè)/mL。因此，選取15g/L玉米漿濃度進(jìn)行后續(xù)研究。

2.2正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將篩選出的最優(yōu)碳源、兩個(gè)氮源為三因素，設(shè)計(jì)三因素四水平，其中葡萄糖：10g/L、15g/L、20g/L、25g/L，大豆蛋白棟8g/L、10g/L、12g/L、14g/L，玉米漿13g/L、15g/L、17g/L、19g/L，共16瓶，培養(yǎng)24h取樣進(jìn)行芽孢檢測(cè)。結(jié)果如表6所示。

表6　正交試驗(yàn)菌體芽孢生成量 　 g/L

從結(jié)果可以看出，三個(gè)因素對(duì)菌體芽孢生成量影響的順序?yàn)椋河衩诐{＞大豆蛋白＞葡萄糖經(jīng)過極差分析得出，有利于芽孢生成的因素組合：葡萄糖25g/L、大豆蛋白胨14g/L、玉米漿17g/L。

3　結(jié)論

采用單因素的探究和正交試驗(yàn)來對(duì)枯草芽孢桿菌進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，通過稀釋平板法來測(cè)定發(fā)酵液中芽孢數(shù)。單因素研究從7種碳源和9種氮源中選取葡萄糖、大豆蛋白胨和玉米漿。正交試驗(yàn)優(yōu)化后菌體芽孢最多的培養(yǎng)基為：葡萄糖25g/L、大豆蛋白胨14g/L、玉米漿17g/L，NaCl 3g/L，MgSO40.2g/L。在此條件下的重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，24h菌體芽孢達(dá)到9.6×109個(gè)/mL。

［1］ 趙朋超，王建華，權(quán)春善，等.枯草芽孢桿菌抗菌肽生物合成的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)生物工程雜志，2010，30（10）：108-113.

［2］ 甄靜，郭直岳，謝寶恩，等.枯草芽孢桿菌XK-1產(chǎn)芽孢條件的優(yōu)化［J］.中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2012，28（27）：146-151.

［3］ 郭夏麗，狄源寧，王巖，等.枯草芽孢桿菌產(chǎn)芽孢條件的優(yōu)化［J］.中國(guó)土壤與肥料，2012，（03）：99-103.

Study on Optimization of Spore Production in Fermentation Medium about Bacillus subtilis B53

Zhu Xiao-li，Yu Wei-wei

The carbon and nitrogen sources were optimized by single factor experiment under the condition of triangular flask culture.On the basis of the orthogonal experiment，the optimum fermentation medium of strain B53 was determined（glucose 25g/ L，soybean peptone 14g/L，corn syrup 17g/L，NaCl 3g/L，MgSO40.2g/L）.Under the optimum conditions，the spore concentration was9.6×109/m L.

Bacillus subtilis；spore；fermentation medium；optimization

S816.3

A

1003-6490（2016）06-0105-02

2016-06-06

廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院企業(yè)橫向項(xiàng)目（HX2011-002）。

朱曉立（1980—），男，河北唐山人，高級(jí)工程師，主要研究方向?yàn)闉榘l(fā)酵工程。