趙子明，葉建生，劉美劍，沈冬冬，黃世熠

(江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，泰州 225300)

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五個(gè)湖泊中華刺鰍(Mastacembelus sinensis)種群線粒體細(xì)胞色素b遺傳多樣性分析*

趙子明，葉建生，劉美劍，沈冬冬，黃世熠

(江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，泰州 225300)

采用特異性引物對(duì)中華刺鰍基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序，獲得了江蘇省5個(gè)湖泊的中華刺鰍種群線粒體cyt b基因767bp的序列. 分析表明，cyt b基因中A+T含量略高于G+C含量，144個(gè)中華刺鰍共獲得cyt b基因單倍型28個(gè)，變異位點(diǎn)38個(gè)，其中單倍型Hap1分布最為廣泛，可能為祖先型單倍型. 平均單倍型多樣性和平均核苷酸多樣性指數(shù)分別為0.58751和0.00214，遺傳多樣性較低. 群體間遺傳分化系數(shù)為 0.0356，絕大多數(shù)的遺傳變異都來自群體內(nèi)部，而群體間的遺傳分化極小. 構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹未出現(xiàn)明顯的以單個(gè)湖泊群體的聚簇，5個(gè)湖泊的種群間基因交流極其強(qiáng)烈. 研究結(jié)果表明，當(dāng)前5個(gè)湖泊的中華刺鰍遺傳多樣性水平比較低，亟待加強(qiáng)保護(hù).

中華刺鰍；線粒體DNA；cyt b；遺傳多樣性；淡水湖

中華刺鰍(Mastacembelus sinensis)屬于鱸形目(Perciformes)、刺鰍科(Mastacembelidae)、刺楸屬(Mastacembelus)，俗稱石鏟、刀鰍、鋼鰍等，是廣泛分布我國遼河、黃河、長江、錢塘江、珠江等水系的中小型淡水魚類[1]. 改革開放以來，由于人為活動(dòng)和江河環(huán)境污染，特別是農(nóng)作物秸稈向水體中拋置，導(dǎo)致水體污染嚴(yán)重，中華刺鰍野生資受到嚴(yán)重破壞. 目前，中華刺鰍資源量不斷下降.

cyt b基因作為常用線粒體DNA分子標(biāo)記，具有較強(qiáng)的中間解析和鑒別能力，廣泛應(yīng)用于動(dòng)物的群體遺傳結(jié)構(gòu)、物種鑒別和系統(tǒng)進(jìn)化的研究中[2-5]. 近年來，cyt b基因也越來越多地應(yīng)用于魚類遺傳多樣性研究. 趙凱等[6]分析了黃河上游和柴達(dá)木盆地托索湖的裸裂尻魚cyt b基因序列變異，初步認(rèn)為黃河和柴達(dá)木水系托索湖的裸裂尻魚未顯著分化，兩種群表現(xiàn)出較低水平的遺傳多樣性. 閻雪嵐等[7]采用cyt b序列分析了采自新疆克孜河3個(gè)群體的塔里木裂腹魚及1個(gè)斑重唇魚群體的種群遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示克孜河的塔里木裂腹魚和斑重唇魚均處于很低的遺傳多樣性水平，物種維持力較弱. 趙峰等[8]采用cyt b基因片段為遺傳標(biāo)記，對(duì)黃海南部和東海的6個(gè)銀鯧群體遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，結(jié)果表明6個(gè)群體均呈現(xiàn)出高單倍型多樣性和低核苷酸多樣性的特點(diǎn)，群體間具有高度的基因交流，是一個(gè)隨機(jī)交配群體. 田輝伍等[9]則利用cyt b基因研究了長江上游的長江干流、岷江、赤水河和嘉陵江的8個(gè)群體長薄鰍的遺傳結(jié)構(gòu)，表明長薄鰍種群內(nèi)的變異大于種群間的變異，種群基因交流十分頻繁. 目前，有關(guān)刺鰍的研究很少，僅有的幾篇報(bào)道主要集中于基礎(chǔ)生物學(xué)[10-15]、病害研究[16]以及分類地位討論[17-22]. 尤其是其分類地位一直存在爭議，存在刺鰍(Mastacembelus aculeatus)和中華光蓋刺鰍(Pararhynchobdlla sinensis)等多種學(xué)名，倪勇與伍漢霖先生[1]根據(jù)其形態(tài)特征比對(duì)，最終確定了其分類地位，學(xué)名為中華刺鰍(Mastacembelus sinensis). 本研究對(duì)采自江蘇省5個(gè)湖泊中華刺鰍種群cyt b片段進(jìn)行了測(cè)序與比較分析，研究5個(gè)湖泊中華刺鰍群體間的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)，以深入了解和掌握5個(gè)湖泊中華刺鰍種群當(dāng)前的種質(zhì)資源現(xiàn)狀，為其今后的保護(hù)與開發(fā)提供基礎(chǔ)分子生物學(xué)依據(jù).

1 材料和方法

1.1 研究材料

實(shí)驗(yàn)用中華刺鰍于2015年5-7月采集自江蘇省蘇中和蘇北地區(qū)的5個(gè)湖泊水域，分別為江蘇淮安的白馬湖(B)、高郵湖(G)、洪澤湖(H)、駱馬湖(L)以及江蘇泰州的溱潼湖(Q)，剪取尾鰭，無水乙醇固定后，-20℃ 冷凍保存?zhèn)溆?

1.2 DNA提取

基因組DNA采用試劑盒提取(SangonEzupColumnAnimalGenomicDNAPurificationKit). 總DNA經(jīng)檢測(cè)后稀釋至100ng/μl，-20℃冷凍保存?zhèn)溆?

1.3 PCR擴(kuò)增及測(cè)序

參照GenBank數(shù)據(jù)庫中大刺鰍(Mastacembelus armatus)的線粒體全序列(登入號(hào)：KJ184553)，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增cyt b 基因，引物序列為F：5’-ATCCCTCCTGGGACTCTGTC-3’；R：5’-CGTGTGGAGGATTGGGACAA-3’，引物由上海生工生物公司合成.PCR反應(yīng)體系為50μl：模板DNA50ng；2×PCRMix25μl(包含Taq酶 2.5U，dNTPs10μmol，MgCl20.1mmol)，上、下游引物(10μmol/L)各1μl，其余體積用水補(bǔ)足. 反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性2min，94℃變性45s，62℃退火1min，72℃延伸1min，經(jīng)35個(gè)循環(huán)后再72℃延伸10min.PCR產(chǎn)物經(jīng)割膠純化后，直接送上海生工生物公司利用正反引物進(jìn)行雙向測(cè)序.

1.4 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)測(cè)序峰圖對(duì)雙向測(cè)序序列進(jìn)行人工拼接，之后用BioEdit7.0.5[23]軟件比對(duì)獲得同源序列，MEGA6.0軟件[24]分析堿基的組成，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹.DnaSP軟件[25]統(tǒng)計(jì)變異位點(diǎn)類型與數(shù)目，計(jì)算單倍型種類、平均核苷酸差異數(shù)、單倍型多樣性指數(shù)和核苷酸多態(tài)性等，用Arlequin3.01 軟件[26]中的Kimura2-Parameters方法構(gòu)建5個(gè)種群間的遺傳距離，分子生物學(xué)方差分析(AMOVA)方法計(jì)算遺傳分化指數(shù)(Fst)及遺傳變異組成.

2 結(jié)果

2.1 序列分析

5個(gè)湖泊中華刺鰍種群144個(gè)個(gè)體的cyt b基因，經(jīng)拼接比對(duì)后，獲得長度為 767bp的同源序列.MEGA6軟件分析表明，T、C、A、G堿基組成平均為29.2%、30.1%、26.1%和14.6%，A+T含量為 55.3%，略高于G+C含量. 序列共發(fā)現(xiàn)多態(tài)性位點(diǎn)38個(gè)，占核苷酸總數(shù)的4.95%，其中包含18個(gè)單態(tài)突變位點(diǎn)和20個(gè)簡約信息位點(diǎn)，未檢測(cè)到堿基缺失. 144個(gè)個(gè)體中共檢出28個(gè)單倍型序列，所有單倍型序列已提交至GeneBank(登入號(hào)：KT448786～KT448813)，種群間共享單倍型共8個(gè)，其中單倍型Hap1 5個(gè)群體間都有分布且數(shù)量也大，可能是原始單倍型(表1). 5個(gè)種群的單倍型平均多樣性指數(shù)為0.58751，平均核苷酸差異數(shù)為1.63947，平均核苷酸多樣性指數(shù)為0.00214(表2). 5個(gè)湖泊的中華刺鰍群體中，高郵湖群體的單倍型多樣性指數(shù)最高，溱潼湖群體的核苷酸多樣性指數(shù)最高，而駱馬湖群體的單倍型多樣性指數(shù)和核苷酸多樣性指數(shù)均為最低.

表2 5個(gè)湖泊的中華刺鰍種群的單倍型及遺傳多樣性參數(shù)Tab.2 Haplotypes and genetic diversity of spiny eel populations from five lakes

湖泊樣本數(shù)單倍型數(shù)多態(tài)位點(diǎn)數(shù)單倍型多樣性平均核苷酸差異數(shù)核苷酸多態(tài)性白馬湖30890.466670.901150.00117高郵湖2811210.714292.359790.00308洪澤湖2810110.671961.129630.00147駱馬湖29860.642860.817730.00107溱潼湖295160.421182.788180.00364合計(jì)14428380.587511.639470.00214

2.2 群體變異和遺傳結(jié)構(gòu)

將測(cè)序獲得的144個(gè)個(gè)體的cyt b基因序列輸入Arlequin軟件，使用Kimura2-Parameters方法構(gòu)建5個(gè)湖泊種群間的相對(duì)遺傳距離和Fst(表3). 5個(gè)種群的平均遺傳距離為0.00216，高郵湖種群與溱潼湖種群間的遺傳距離最遠(yuǎn)為0.00338，遺傳距離最近的是白馬湖和駱馬湖種群之間為0.00116. 而5個(gè)湖泊刺鰍種群內(nèi)部遺傳距離從大到小依次為：溱潼湖(0.00368)>高郵湖(0.00311)>洪澤湖(0.00148)>白馬湖(0.00118)>駱馬湖 (0.00107). 5個(gè)種群的平均Fst為0.03556，5個(gè)湖泊的中華刺鰍種群間存在一定的遺傳分化，但是種群間的Fst值均較低，種群間Fst顯著性檢驗(yàn)有近一半(P>0.05)，表明5個(gè)湖泊中華刺鰍種群間存在較大的基因流，遺傳分化差異較低(表4).

表3 5個(gè)湖泊的中華刺鰍種群間K 2-P遺傳距離和遺傳分化系數(shù)Tab.3 Average K 2-P distance and fixation indice between spiny eel populations from five lakes

*表示差異顯著(P<0.05)；**表示差異極顯著(P<0.01)；對(duì)角線上方數(shù)值表示種內(nèi)分化系數(shù)；對(duì)角線下方數(shù)值表示群體間遺傳距離.

表4 5個(gè)湖泊中華刺鰍種群間遺傳差異的AMOVA分析Tab.4 Analysis of AMOVA of spiny eelpopulations from five lakes

變異來源自由度平方和變異組成百分比%種群間46.5660.029363.56種群內(nèi)139110.6570.7960996.44合計(jì)143117.2220.35778

AMOVA法估算5個(gè)群體間遺傳變異結(jié)構(gòu)和來源的結(jié)果表明，種群間的變異占總變異的3.56%，而種群內(nèi)的變異對(duì)總變異的貢獻(xiàn)率達(dá)到96.44%(表4)，種群內(nèi)未出現(xiàn)遺傳分化. 另外，用DnaSP軟件分析單倍型數(shù)據(jù)所得遺傳分化系數(shù)(Gst)為0.01092，基因流(Nm)為22.65；而144個(gè)個(gè)體的Gst為0.05601，Nm為4.21，也表明種群間的基因交流很頻繁.

2.3 系統(tǒng)進(jìn)化分析

將144個(gè)中華刺鰍個(gè)體的cyt b基因序列輸入MEGA6軟件，對(duì)5個(gè)湖泊群體進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，得到UPGMA系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖1A). 5個(gè)中華刺鰍群體沒有明顯聚類，形成了單系類群，京杭大運(yùn)河水系連接的白馬湖、駱馬湖、洪澤湖和高郵湖群體首先聚類，最后與溱潼湖聚合. 而144個(gè)個(gè)體的構(gòu)建的UPGMA系統(tǒng)進(jìn)化樹則表明，5個(gè)群體的個(gè)體都沒有獨(dú)立聚類，相互散布在不同的地理群體中(圖1B).

圖1 5個(gè)湖泊中華刺鰍群體間(A)及個(gè)體間(B)的UPGMA系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 Dendrogram of spiny eel populations (A) and 144 individuals (B) from five lakes by UPGMA method based genetic distance

2.4 群體歷史動(dòng)態(tài)

用Fu’Fs檢驗(yàn)方法檢驗(yàn)5個(gè)湖泊中華刺鰍群體的中性突變，結(jié)果表明種群的整體Fs=-23.887(P<0.05)，顯著偏離中性突變，表明5個(gè)中華刺鰍群體整體上有一定的擴(kuò)張趨勢(shì)，但白馬湖、駱馬湖、高郵湖和洪澤湖群體的Fs值都小于0，而溱潼湖群體的Fs值大于0. 所有個(gè)體的線粒體cyt b基因序列進(jìn)行堿基歧點(diǎn)分布分析，個(gè)體間堿基歧點(diǎn)分布的觀測(cè)曲線與期望曲線大體一致，中間只有一個(gè)較低的凸起(圖2)，表明5個(gè)湖泊的中華刺鰍歷史上種群相對(duì)比較穩(wěn)定，經(jīng)歷過一個(gè)比較小的種群擴(kuò)張事件.

圖2 5個(gè)湖泊的中華刺鰍群體線粒體cyt b基因錯(cuò)配堿基分布Fig.2 The mismatch distribution of the Mitochondrial DNA cyt b of spiny eel populations from five lakes

3 討論

3.1 群體遺傳多樣性

本研究獲得了5個(gè)湖泊中華刺鰍群體的線粒體 cyt b 基因片段，序列堿基組分析表明，中華刺鰍線粒體cyt b 基因的A+T含量為55.3%，略高于G+C平均含量，而G含量顯著低于其他堿基，表現(xiàn)出反G偏倚，與其他動(dòng)物線粒體DNA的研究結(jié)果一致[27].

遺傳多樣性是一個(gè)物種長期生存和進(jìn)化的前提，物種的遺傳多樣性越高，該物種的進(jìn)化潛力也就越大，對(duì)環(huán)境變化的適應(yīng)能力也就越強(qiáng)[5]. 本研究獲得5個(gè)湖泊144 尾中華刺鰍cyt b基因767bp的序列，共獲得基因單倍型28個(gè)，變異位點(diǎn)38個(gè)，單倍型多樣性和核苷酸多樣性分別為0.58751 和0.00214，說明江蘇省5個(gè)湖泊的中華刺鰍單倍型多樣性和核苷酸多樣性都很低，遠(yuǎn)低于黃顙魚[4](0.945、0.00419)和福建近海竹莢魚[28](0.937、0.336)等經(jīng)濟(jì)魚類的cyt b基因單倍型多樣性和核苷酸多樣性，甚至低于野生瀕危物種鱇浪白魚[5](0.996、0.00434) cyt b基因的單倍型多樣性和核苷酸多樣性，僅與瀕危物種青海湖裸鯉[29](0.783、0.00205)、黃河裸體裂尻[6](0.700、0.0026)和長薄鰍[9](0.60852、0.00089) cyt b基因的單倍型多樣性和核苷酸多樣性相當(dāng)，高于怒江角魚[30](0.579、0.00070) cyt b基因單倍型多樣性和核苷酸多樣性. 如此低的遺傳多樣性，可能意味著中華刺鰍種群曾經(jīng)歷過“瓶頸效應(yīng)”的打擊[31]，說明當(dāng)前該物種的進(jìn)化潛力比較低，對(duì)環(huán)境變化的適應(yīng)能力很弱，存在著較大的滅絕風(fēng)險(xiǎn).

3.2 種群遺傳結(jié)構(gòu)

AMOVA分析表明，種群內(nèi)的遺傳變異顯著超過各種群間的遺傳變異，占全部遺傳變異的96.44%，這表明中華刺鰍群體間差異不顯著，群體間未出現(xiàn)遺傳分化.

Fst值可以反映群體之間的遺傳分化程度，當(dāng)Fst值介于 0～0.05時(shí)表示分化較弱. 本文中5個(gè)湖泊中華刺鰍群體的Fst值為0.0356，說明5個(gè)中華刺鰍種群間存遺傳分化較弱，不存在顯著的系統(tǒng)地理分化.Shaklee等[32]根據(jù)已發(fā)表的文獻(xiàn)認(rèn)為魚類在種群、種和屬三級(jí)水平上的遺傳距離D值分別為0.05、0.30和0.9. 中華刺鰍5個(gè)湖泊群體間遺傳距離為0.00216，說明中華刺鰍群體間的遺傳分化極低，遠(yuǎn)沒有達(dá)到種群的分化水平. 另外，與其他魚類群體間的遺傳距離相比較(0.035～0.019)[33]，中華刺鰍群體間遺傳距離(0.00116～0.00338)可以看出，中華刺鰍種群無論是群體間還是群體內(nèi)部序列差異都極小，說明其遺傳多樣性水平極低.Wright提出種群Nm>4時(shí)，群體就是一個(gè)隨機(jī)的單位[34]. 而本研究中單倍型間的Nm高達(dá)22.65，個(gè)體間的Nm為4.21，表明5個(gè)群體間基因流動(dòng)的相當(dāng)強(qiáng)烈，也進(jìn)一步說明中華刺鰍種群間未出現(xiàn)分化，應(yīng)作為一個(gè)整體進(jìn)行資源保護(hù). 系統(tǒng)進(jìn)化分析表明5個(gè)湖泊的中華刺鰍群體沒有明顯聚類，形成了單系類群. 以上結(jié)果都表明中華刺鰍5個(gè)湖泊群體在cyt b水平上未出現(xiàn)群體遺傳分化.Grant等依據(jù)單倍型多樣度h 和核苷酸多樣度π推測(cè)了魚類群體的4 種進(jìn)化情景[35]，本研究中5個(gè)湖泊的中華刺鰍種群遺傳多樣性低，遺傳沒有分化，接近于低h、低π情形，可能因?yàn)楹撮g地理距離近，水系連通，使得基因交流的可能性很大；同時(shí)，也可能存在建立者效應(yīng)，即5個(gè)湖泊的中華刺鰍群體都源于單一建立者；此外，江河等水體環(huán)境污染和人為活動(dòng)導(dǎo)致棲息地減少，致使中華刺鰍群體數(shù)量急劇下降，而群體變小后，瓶頸效應(yīng)和遺傳漂變可能在某種程度上導(dǎo)致其遺傳多樣性的降低，損失的遺傳變異也會(huì)增多.

遺傳多樣性是生命進(jìn)化的基礎(chǔ)，遺傳多樣性的缺失會(huì)威脅到種群的生存. 本研究以cyt b基因?yàn)楣ぞ?，研究?個(gè)湖泊中華刺鰍群體間的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)，以深入了解和掌握當(dāng)前中華刺鰍種質(zhì)資源現(xiàn)狀，為其今后的保護(hù)與開發(fā)提供基礎(chǔ)分子生物學(xué)依據(jù). 5個(gè)湖泊的中華刺鰍種群處于較低的遺傳多樣性水平，且未形成遺傳分化，物種維持力較弱. 本研究結(jié)果表明當(dāng)前5個(gè)湖泊的中華刺鰍資源現(xiàn)狀不容樂觀，亟待加強(qiáng)保護(hù). 種群一旦遭受破壞，就很難以復(fù)，這個(gè)寶貴物種也將面臨滅絕的危險(xiǎn). 同時(shí)，應(yīng)盡快對(duì)其他水域中華刺鰍遺傳多樣性現(xiàn)狀進(jìn)行研究，全面了解該物種種質(zhì)資源現(xiàn)狀.

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Genetic diversity of spiny eel (Mastacembelus sinensis) from five lakes based on Mitochondrial DNA cyt b gene

ZHAO Ziming， YE Jiansheng， LIU Meijian， SHEN Dongdong & HUANG Shiyi

(Jiangsu Agri-animal Husbandry Vocational College, Taizhou 225300, P.R.China)

ThemitochondrialDNAcyt bgene(767bp)ofspinyeelfromfivelakesinJiangsuProvincewasamplifiedandsequenced.TheaveragecontentsofA+TwerealittlehigherthanthoseofG+Cwhen38variablesitesweredetected,and28haplotypeswererecovered.Theaveragehaplotypediversity(0.58751)andnucleotidediversity(0.00214)demonstratedverylowgeneticdiversityofthespinyeelpopulationsinthefivelakes.Thefixationindiceofanalysisofmolecularvariancewas0.0356,whichshowednosignificantgeneticdifferenceamongpopulations.TheUPGMAphylogenetictreeofcyt bgenebuiltwithMEGA6.0showedthatfivepopulationswerenotclusteredintocladesbasedongeneticdistance.TherewasanextensivegeneralflowamongspinyeelpopulationsfromthefivelakesinJiangsuProvince.Theresultshowedthatspinyeelfromthefivelakeshadlowgeneticdiversityandgeneticallyhomogeneouspopulationstructure,indicatingtheirweakviabilitytomaintainpopulation.Thespinyeelneedtobewellprotected.

Mastacembelus sinensis;MitochondrialDNA; cyt b;geneticdiversity;freshwaterlakes

*江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院課題(NSFRC1304)資助. 2015-08-29收稿; 2015-11-13收修改稿. 趙子明(1962～), 男, 副教授;E-mail:zzm0282678@163.com.