張權(quán)娥　史文婷　陶　紅　何正梅　丁邦和　王春玲　于　亮　李玉峰南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)：血液科，江蘇淮安223300

兩種非整合載體重編程人臍帶血CD 34+細(xì)胞形成誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的研究

張權(quán)娥史文婷陶紅何正梅丁邦和王春玲于亮李玉峰
南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)：血液科，江蘇淮安223300

目的探索兩種非整合載體重編程人臍血來(lái)源的CD34+細(xì)胞形成誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（iPSCs）的方法。方法利用細(xì)胞核轉(zhuǎn)染儀分別將兩組非整合質(zhì)粒轉(zhuǎn)入短暫培養(yǎng)后的臍帶血CD34+細(xì)胞中，使其進(jìn)行重編程形成iPSCs，14 d后兩種方法均可觀察到2×106個(gè)臍帶血CD34+細(xì)胞中約有900個(gè)類似ES細(xì)胞特征的克隆出現(xiàn)，并對(duì)產(chǎn)生的iPSCs進(jìn)行體內(nèi)外多能性鑒定及細(xì)胞核型檢測(cè)。結(jié)果兩種方法重編程效率基本相同，重編程形成的hiPSCs多能性基因OCT4、SOX2、NANOG的表達(dá)量與hES細(xì)胞系H1比較接近（P＞0.05），而與CD34+細(xì)胞差別較大（P＜0.05），且具有體內(nèi)分化成三胚層的全能性。結(jié)論兩種非整合質(zhì)粒重編程人臍帶血來(lái)源的CD34+細(xì)胞形成iPSCs的方法，效率基本相同，均無(wú)外源基因插入，為建立相對(duì)安全的iPSCs提供了有效途徑，為臨床科研、藥物篩選和再生醫(yī)學(xué)研究等提供了較好的方法。

誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞；重編程；臍帶血CD34+細(xì)胞；非整合型質(zhì)粒

［Avsteact］Ov jective To establish two episomal vector reprogramming methods to reprogram iPSCs from human cord blood（CB）CD34+cells.M ethods Two sets of non-integrating plasmidswere respectively transported into two groups of short-term cultured CB CD34+cells by using transfector nucles，to reprogram iPSCs from CB CD34+cells.Within 14 days of transfection by two sets of non-integrating plasmids，up to 900 iPSC-like colonies per 2 million transfected CB CD34+cells were generated.And the pluripotency and karyotypes of iPSCs were tested in vitTo.Results The reprogramming efficiency of twomethods was basically the same.The pluripotency genes OCT4，SOX2 and NANOG expression levels of the hiPSCswere close to the hES cell line H1 cells（P＞0.05），but different from the CD34+cells（P＜0.05）.Furthermore，the hiPSCs formed teratomas with three embryonic germ layers.Conclusion Two efficient reprogrammingmethods have basically the same efficiency，and no vector integration is found in iPSCs.It is concluded that the non-integrating plasmid system to generate human iPSCs from CB CD34+cells is reliable and can provide new ways for clinical research，drug screening and regenerativemedicine research.

［Key woeds］Induced pluripotent stem cells；Reprogramming；Cord blood CD34+cells；Non-integrating plasmid

誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）是指將特定的轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入成體細(xì)胞，重編程形成的形態(tài)和功能上類似于胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells，ESCs）的一類細(xì)胞。自從2006年日本東京大學(xué)的Takahashi等［1］第一次發(fā)現(xiàn)iPS細(xì)胞以來(lái)，經(jīng)過(guò)各國(guó)研究者努力探索，iPS誘導(dǎo)技術(shù)有了突飛猛進(jìn)的發(fā)展。近年來(lái)重編程iPSCs的方法不斷優(yōu)化，如純化的蛋白、mRNAs和非整合型質(zhì)粒等［2-10］。然而，使用蛋白和mRNAs都需要多次重編程靶細(xì)胞，效率較低。人們使用非整合質(zhì)粒成功的重編程人神經(jīng)祖細(xì)胞和神經(jīng)成纖維細(xì)胞，形成了非整合型iPS細(xì)胞系［4-5］。Chou等［8］報(bào)道了使用一種游離型載體EBNA1/OriP高效重編程人臍帶血細(xì)胞和外周血細(xì)胞形成iPSCs，避免了基因整合的危險(xiǎn)。Meng等［11］也利用改進(jìn)的游離型載體高效重編程臍帶血CD34+細(xì)胞形成了無(wú)基因整合的iPSCs。為了使人體細(xì)胞的iPSCs可以分化成所需的細(xì)胞類型，用于臨床治療、體外重建疾病模型、藥物篩選，利用一種基因非整合型和無(wú)病毒插入型誘導(dǎo)技術(shù)重編程人成體細(xì)胞形成iPSCs是更有應(yīng)用價(jià)值的方法。本研究利用兩種游離型載體，并攜帶不同的質(zhì)粒組合，即pEB-C5、pEB-Tg和pEV SFFV-OS、pEV SFFV-MK、pEV SFFV-B分別將人臍帶血來(lái)源的CD34+細(xì)胞重編程形成了質(zhì)粒非整合型hiPSCs，并對(duì)其多能性進(jìn)行鑒定。兩種方法效率相似，均無(wú)外源基因插入，具有高效性和安全性，進(jìn)一步推動(dòng)了hiPSCs臨床應(yīng)用的進(jìn)程。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

人臍帶血（天津市中心婦產(chǎn)科醫(yī)：提供，患者簽署知情同意書(shū)）來(lái)源的CD34+細(xì)胞；小鼠成纖維細(xì)胞（MEF）；H1細(xì)胞系（天津血液病研究所保存）；pEBC5（表達(dá)OCT4、SOX2、KLF4、c-MYC和LIN28）和pEB-Tg（SV40 Large T antigen）（Addgene公司）；pEV SFFV-OS（OCT4-2a-SOX2），pEV SFFV-MK（MYC-2a-KLF4）和pEV SFFV-B（BCL-XL）（天津血液病研究所保存）；Human CD34+cell nucleofection kit（Lonza公司）；Anti-TRA-1-60、Anti-SSEA4、Anti-OCT4、Anti-Nanog和Accutase（Stemgent公司產(chǎn)品）；引物對(duì)（Millipore公司）：hOct4上游引物5＇-ATTCAGCCAAACGACCATCT-3＇，下游引物5＇-GCTTCCTCCACCCACTTCT-3＇；hSox2上游引物5＇-CACACTGCCCCTCTCACACA-3＇，hSox2下游引物5＇-CCCTCCCATTTCCCTCGTTT-3＇；NANOG上游引物5＇-GCC GAAGAATAGCAATGGTGTG-3＇，NANOG下游引物5＇-GGAAGAGTAGAGGCTGGGGTAG-3；hGAPDH上游引物5＇-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC3＇，hGAPDH下游引物5＇-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3＇。

1.2方法

1.2.1人臍帶血CD34+細(xì)胞的分離培養(yǎng)利用Ficoll密度梯度離心法分離取得人臍帶血單個(gè)核細(xì)胞（human cord blood mononuclear cells，hCB-MNCs），然后避光操作，每108個(gè)細(xì)胞先加入100μL Fc-R阻斷劑，再加入100μL CD34+Microbeads，充分混勻后4℃避光孵育30min，再利用MACS磁珠分選得到人臍帶血CD34+細(xì)胞。獲得人臍帶血CD34+細(xì)胞培養(yǎng)在6孔板，使用人CD34+細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.2非整合質(zhì)粒轉(zhuǎn)染重編程過(guò)程人臍帶血CD34+細(xì)胞培養(yǎng)9 d，使用Amaxa細(xì)胞核轉(zhuǎn)染儀行細(xì)胞核轉(zhuǎn)染（稱為轉(zhuǎn)染第0天）。兩組不同的方法分別進(jìn)行轉(zhuǎn)染。第1種方法：質(zhì)粒包含pEB-C5和pEB-Tg，比例為8μg pEB-C5+2μg pEB-Tg，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染程序?yàn)門-016。第2種方法：pEV SFFV-OS、pEV SFFV-MK和pEV SFFV-B，比例為10μg OS+5μg MK+5μg B，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染程序?yàn)閁-008。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞（2×106細(xì)胞）種到12孔板的1個(gè)孔中培養(yǎng)，24 h后轉(zhuǎn)移到預(yù)先鋪有MEF的6孔板，加入hES培養(yǎng)基和MEF培養(yǎng)基每孔各1mL，封口膜封閉平板進(jìn)行離心，1000 r/min 25℃30 min。繼續(xù)培養(yǎng)，用hES培養(yǎng)基隔天換液，第9天時(shí)更換條件培養(yǎng)基（MEF-derived conditioned medium，MEF CM），電轉(zhuǎn)后第3天開(kāi)始加NaB（0.25 mmol/L），直到克隆形成。轉(zhuǎn)染第14天用TRA-1-60活染鑒定完全重編程的細(xì)胞并挑取克隆進(jìn)行傳代培養(yǎng)（圖1）。

圖1　非整合質(zhì)粒轉(zhuǎn)染重編程臍帶血CD34+的流程圖

1.2.3i PSCs初步鑒定并傳代用TRA-1-60鼠IgM抗體染色，初步鑒定重編程的克隆，TRA-1-60抗體（1∶300）和Alexa555標(biāo)記的抗小鼠IgM二抗（1∶500）稀釋于ESC培養(yǎng)基中，然后加入重編程的細(xì)胞中，0.5 mL/孔，37°C孵育1 h，PBS洗1遍，加入新鮮的ESC培養(yǎng)基或CM。倒置熒光顯微鏡下觀察TRA-1-60+克隆形成情況，計(jì)數(shù)克隆總數(shù)及TRA-1-60+克隆數(shù)，挑取陽(yáng)性的克隆傳代培養(yǎng)擴(kuò)增，傳至8～10代細(xì)胞系基本穩(wěn)定。

1.2.4免疫熒光染色檢測(cè)i PSCs多能性基因表達(dá)兩組質(zhì)粒誘導(dǎo)形成的CB-CD34+iPSCs分別傳代擴(kuò)增，取傳代至第5代（P5）的一部分細(xì)胞傳到24孔板中，當(dāng)iPS細(xì)胞克隆長(zhǎng)到適當(dāng)大小時(shí)，使用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min，然后0.1%Triton X-100透膜10 min，PBS洗3遍，再加入山羊血清工作液室溫封閉15min。取稀釋好的抗體anti-TRA-1-60（1∶300）、anti-SSEA-4（1∶100）、anti-NANOG（1∶100）、anti-OCT4（1∶100），分別加入相應(yīng)的孔中，100μL/孔，室溫避光孵育2 h，然后PBS洗3遍，每孔加入相應(yīng)的二抗Alexa FLuor 488標(biāo)記的羊抗兔IgG或Alexa555標(biāo)記的羊抗鼠IgM/IgG（1∶500），室溫避光孵育1 h，PBS洗3遍，再加入DAPI染細(xì)胞核5min，PBS洗3遍，倒置熒光顯微鏡下觀察胚胎干細(xì)胞4種多能性標(biāo)志基因TRA-1-60、SSEA-4、NANOG、OCT4表達(dá)。

1.2.5Rea l-t ime PCR檢測(cè)全能性基因表達(dá)6孔板中iPSCs用稀釋好的accutase進(jìn)行消化，除去支持細(xì)胞，加入PBS終止消化，吸出廢液。加入hESM，將iPSCs克隆刮下放入離心管，1000 r/min離心5 min，棄上清，提取細(xì)胞RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。取重編程CB-CD34+形成的iPSCs、H1細(xì)胞（即hES細(xì)胞系，陽(yáng)性對(duì)照）、CB-CD34+細(xì)胞（陰性對(duì)照）的cDNA進(jìn)行Real-time PCR鑒定內(nèi)源性基因Oct4、Sox2、NANOG的表達(dá)量。采用2-ΔΔCt方法計(jì)算各目的基因在各個(gè)細(xì)胞群的相對(duì)表達(dá)量，hGAPDH為內(nèi)參，H1為參照樣本。ΔΔCt（目的基因，細(xì)胞群）=（Ct目的基因-CtGAPDH）細(xì)胞群-（Ct目的基因-CtGAPDH）H1。

1.2.6核型鑒定分別取兩組質(zhì)粒誘導(dǎo)形成的iPS細(xì)胞進(jìn)行核型鑒定。使用HE染色，隨機(jī)選取中期分裂相的細(xì)胞20個(gè)以上進(jìn)行核型正確率統(tǒng)計(jì)。人正常為46條染色體，一般認(rèn)為有70%～80%的細(xì)胞染色體為46條時(shí)，此hiPS細(xì)胞系則為較好的細(xì)胞系。通過(guò)染色體核型顯帶進(jìn)行核型分析。

1.2.7畸胎瘤形成實(shí)驗(yàn)分別選取核型鑒定正常的重編程的iPS細(xì)胞傳代擴(kuò)增，傳至第9代時(shí)，accutase進(jìn)行消化去掉雜細(xì)胞，加入PBS終止消化。約5×106細(xì)胞重懸到PBS與Matrigel solution（1∶1）稀釋的200μL的溶液中，注射到NOD/SCID免疫缺陷小鼠腋窩皮下，2個(gè)月左右可觀察到畸胎瘤形成，取下畸胎瘤，10%甲醛固定24 h，石蠟包埋，HE染色，顯微鏡下觀察畸胎瘤組織形態(tài)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 5.0軟件處理分析結(jié)果數(shù)據(jù)，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1重編程過(guò)程中克隆形態(tài)變化及誘導(dǎo)效率觀察

兩種游離型載體pEB-C5（C5）+pEB-Tg（Tg）和pEV SFFV-OS（OS）+pEV SFFV-MK（MK）+pEV SFFV-B（B）重編程CB CD34+細(xì)胞形成的iPSCs的過(guò)程中，細(xì)胞核轉(zhuǎn)染第9天時(shí)，顯微鏡下即可看到iPS克隆的初始形態(tài)；第14天時(shí)，完全重編程的克隆使用TRA-1-60活染鑒定，倒置熒光顯微鏡下觀察TRA-1-60+克隆形態(tài)，取陽(yáng)性克隆傳代培養(yǎng)并觀察形態(tài)變化（圖2），發(fā)現(xiàn)與hESC克隆非常相似，計(jì)數(shù)克隆總數(shù)和TRA-1-60+克隆數(shù)，6孔板的每個(gè)孔（2×106CB CD34+細(xì)胞）可觀察到約900個(gè)類似ES細(xì)胞的克隆，TRA-1-60+克隆約450個(gè)，克隆效率（即TRA-1-60+克隆數(shù)/克隆總數(shù)）約為50%（圖3）。

圖2　CB CD34+細(xì)胞重編程克隆形態(tài)圖

圖3　兩組質(zhì)粒重編程效率比較

2.2重編程的hiPSCs多能性基因的鑒定

利用pEB-C5、pEB-Tg和pEV SFFV-OS、pEV SFFV-MK、pEV SFFV-B兩組質(zhì)粒分別誘導(dǎo)CB CD34+形成hiPSCs經(jīng)免疫熒光染色顯示，hiPSCs高表達(dá)多潛能標(biāo)記基因Oct4和NANOG和未分化特異性膜表面標(biāo)記基因TRA-1-60和SSEA4（圖4）。實(shí)時(shí)定量熒光PCR顯示，hiPSCs多能性基因OCT4、SOX2、NANOG的表達(dá)量與hES細(xì)胞系H1相比，表達(dá)量比較接近，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而與CD34+細(xì)胞相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖5。

圖4　免疫熒光染色鑒定（免疫熒光染色，10伊）

相對(duì)表達(dá)量

2.3核型鑒定結(jié)果

兩組非整合型質(zhì)粒重編程CB CD34+細(xì)胞形成的iPSCs，細(xì)胞核型分析發(fā)現(xiàn)，染色體為46條細(xì)胞比例在70%～80%之間，且核型和正常人的細(xì)胞核型相同，即（46，XX）（圖6），說(shuō)明重編程的細(xì)胞核型正常。

圖6　hiPSCs核型鑒定圖

2.4畸胎瘤形成結(jié)果

利用畸胎瘤形成的方法對(duì)所建立的iPS細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)分化潛能檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)8～12周時(shí)取出免疫缺陷小鼠皮下直徑約2 cm畸胎瘤，行病理切片HE染色，結(jié)果顯示具有三胚層結(jié)構(gòu)，說(shuō)明來(lái)源于CB CD34+細(xì)胞的iPS細(xì)胞在免疫缺陷小鼠體內(nèi)具有形成三胚層結(jié)構(gòu)的能力（圖7），重編程的hiPSCs具有分化多能性。

3　討論

為了提高重編程的iPS細(xì)胞的安全性使其易于走向臨床應(yīng)用，人們?cè)谡T導(dǎo)iPSC技術(shù)方面進(jìn)行了深入的探索，Nakagawa等［12］和Wernig等［13］發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)iPS細(xì)胞過(guò)程中可以將過(guò)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)變的c-MYC基因［14］剔除，避免了c-MYC原癌基因的插入。研究者們發(fā)現(xiàn)，重編程介導(dǎo)的載體和媒介從腺病毒到脂質(zhì)體、質(zhì)粒再到后來(lái)的蛋白載體［3，15］，一定程度上降低了病毒載體帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)，但使用蛋白和mRNAs重編程靶細(xì)胞，效率較低，使用不方便，不易推廣使用。近年來(lái)越來(lái)越多的研究者［16-19］發(fā)現(xiàn)，利用非整合的游離型載體重編程人體細(xì)胞形成iPSCs，不會(huì)改變基因組序列，進(jìn)一步降低了致瘤的風(fēng)險(xiǎn)，重編程的iPS細(xì)胞的安全性較高，使其易于走向臨床應(yīng)用。

圖7　畸胎瘤檢測(cè)hiPSC體內(nèi)分化多能性（HE，100×）

本研究利用兩組非整合型質(zhì)粒pEB-C5、pEB-Tg和pEV SFFV-OS、pEV SFFV-MK、pEVSFFV-B分別重編程人臍帶血來(lái)源的CD34+細(xì)胞形成了質(zhì)粒非整合型hiPSCs。兩種方法重編程效果基本相同，周期較短，效果較高，且血液細(xì)胞只需培養(yǎng)8～9 d即可進(jìn)行細(xì)胞核轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染2周左右即可挑克隆傳代培養(yǎng)。通過(guò)一次質(zhì)粒轉(zhuǎn)染即可成功重編程目的細(xì)胞，方法簡(jiǎn)便，易于推廣使用。并且誘導(dǎo)過(guò)程中，加入丁酸鈉［20］可以提高誘導(dǎo)效率。游離型載體EBNA1/OriP［8，21］不會(huì)改變基因組遺傳信息，該方法建立的iPS細(xì)胞為質(zhì)粒非整合型iPS細(xì)胞，更有可能走向臨床應(yīng)用。重編程的hiPSCs經(jīng)細(xì)胞免疫熒光染色和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)證明表達(dá)胚胎干細(xì)胞多能性標(biāo)志基因，細(xì)胞核型鑒定為正常核型，且具有體內(nèi)形成三胚層結(jié)構(gòu)的能力。以上體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明誘導(dǎo)重編程的iPSCs與ES細(xì)胞有相似的特性。利用非整合型質(zhì)粒重編程血液細(xì)胞形成hiPSCs有可能代替ES細(xì)胞應(yīng)用于臨床治療和科學(xué)研究，為hiPSC用于疾病模型的研究和臨床應(yīng)用等提供了更好的前景。

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Two efficient eepeogeamm ing methods of human coed v lood CD34+cells induced p lueipotent stem cellsw ith non-integeating plasm id system

ZHANGQuan＇e SHIWenting TAOHong HEZhengmei DING Banghe WANGChunling YU Liang LIYufeng

Department of Hematology，Huai＇an First People＇s Hospital，Nanjing Medical University，Jiangsu Province，Huai＇an 223300，China

R457

A

1674-4721（2016）08（c）-0021-06

2016-05-21本文編輯：程銘）

江蘇省“333工程”培養(yǎng)資金資助項(xiàng)目（BRA2015152）；江蘇省淮安市科技計(jì)劃專項(xiàng)資金項(xiàng)目（HAS2015026）。

丁邦和（1968.11-），男，副主任醫(yī)師；研究方向：血液病學(xué)。