馬蘇日古嘎彭航劉佳佳張亦婷桂花劉鵬霞

（1.內(nèi)蒙古大學生命科學學院，呼和浩特 010021；2.西安交通大學前沿科學技術(shù)研究院 骨骼關(guān)節(jié)疾病與治療研究中心，西安 710061；3.中國科學院微生物研究所，北京100101；4.中國科學院上海藥物研究所 藥物安全性評價中心，上海 201203）

阿爾巴斯絨山羊骨髓間充質(zhì)干細胞體外分離培養(yǎng)及鑒定

馬蘇日古嘎1彭航2劉佳佳3張亦婷4桂花1劉鵬霞1

（1.內(nèi)蒙古大學生命科學學院，呼和浩特 010021；2.西安交通大學前沿科學技術(shù)研究院 骨骼關(guān)節(jié)疾病與治療研究中心，西安 710061；3.中國科學院微生物研究所，北京100101；4.中國科學院上海藥物研究所 藥物安全性評價中心，上海 201203）

探討阿爾巴斯絨山羊骨髓間充質(zhì)干細胞（Arbas cashmere goat bone marrow-derived mesenchymal stem cells，gBMMSCs）體外分離培養(yǎng)，并對其生物學特性進行系統(tǒng)的鑒定，進一步深入分析體外誘導時多向分化相關(guān)基因動態(tài)表達情況。結(jié)果顯示，原代培養(yǎng)的gBM-MSCs呈梭形或紡錘形、放射狀排列的細胞集落，能夠連續(xù)穩(wěn)定傳代至15代以上；免疫熒光及流式細胞術(shù)檢測顯示，gBM-MSCs表達間質(zhì)系特異性表面標志物，如：CD13、CD29、CD44、CD106、CD90及CD166，不表達造血干細胞表面標志物CD45及CD34；體外誘導實驗證實該細胞具有多向分化潛能，能夠向脂肪細胞、成骨細胞和軟骨細胞分化；熒光定量PCR實驗結(jié)果顯示，gBM-MSCs多向分化相關(guān)基因的表達水平隨著誘導天數(shù)的增加呈上升趨勢。實驗結(jié)果證實阿爾巴斯絨山羊骨髓中分離培養(yǎng)的細胞具備gBM-MSCs的生物學特性。

阿爾巴斯絨山羊；間充質(zhì)干細胞；培養(yǎng)；分化；生物學特性

1966年，F(xiàn)riedenstein等［1-3］首次從大鼠骨髓中分離鑒定出具有造血支持功能的干細胞，并證明其在體外可以分化為骨細胞及脂肪細胞。在此基礎(chǔ)上，Owen及其同事提出間充質(zhì)干細胞（Mesenchymalstem cells，MSCs）這一概念［4，5］。目前，已經(jīng)證實MSCs是中胚層來源的一類多能干細胞，具有自我更新及多向分化潛能，廣泛存在于胎兒和成體多種組織器官中，例如：骨髓、脂肪、羊水、骨骼肌、胎肺、胎肝、臍血、臍帶和胎盤等［6-11］。其中，骨髓中的含量高，分離及獲取操作簡便，可于自身獲取等特點一直深受研究人員的青睞，因此骨髓來源的MSCs研究比較普遍；但是，目前絨山羊骨髓MSCs體外分離培養(yǎng)的文獻報道極少。

絨山羊作為經(jīng)濟價值很高的家畜，有關(guān)其生物學研究對當代畜牧業(yè)發(fā)展具有重大的戰(zhàn)略意義。目前的絨山羊轉(zhuǎn)基因克隆大多使用的是成纖維細胞，它的一個顯著的缺點是培養(yǎng)傳代數(shù)目有限、基因轉(zhuǎn)染后存活率低，這一缺點已成為絨山羊轉(zhuǎn)基因新品種培育的瓶頸。本研究從阿爾巴斯絨山羊骨髓中分離培養(yǎng)MSCs，并對其生物學特性進行系統(tǒng)研究，旨在深入了解大型偶蹄類動物骨髓MSCs的生物學特性，為后續(xù)轉(zhuǎn)基因動物新品種培育及組織工程提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 阿爾巴斯絨山羊3-5月齡流產(chǎn)胎兒5個。

1.1.2 主要試劑 DMEM/F12、IMDM、胎牛血清（Hyclone公司產(chǎn)品）；胰酶、L-谷氨酰胺、地塞米松、吲哚美辛、β-磷酸甘油、維生素C、黃嘌呤、Giemsa染液、DAPI染液（Sigma公司產(chǎn)品）；油紅O（上海紫一試劑廠）；轉(zhuǎn)化生長因子-β、人堿性成纖維細胞生長因子、人表皮生長因子（Pepro Tech公司產(chǎn)品）；阿利新藍染液（阿拉丁公司產(chǎn)品）；氨水（永大公司產(chǎn)品）；CCK-8試劑盒（Beyotime公司產(chǎn)品）；TRLzol 裂解液（Ambion公司產(chǎn)品）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司產(chǎn)品）；兔多克隆抗體 CD13、CD29、CD34、CD44、CD45、CD90、CD106和CD166（博士德產(chǎn)品）；山羊抗兔 FITC-IgG（Protein Tech產(chǎn)品）；定量PCR引物均由大連寶生物（TaKaRa）公司設(shè)計并合成，序列見表1。

表1 實時定量PCR引物序列

1.2 方法

1.2.1 細胞分離和培養(yǎng) 無菌條件下取阿爾巴斯絨山羊3-5月齡流產(chǎn)胎兒腿骨，用培養(yǎng)基沖洗獲取骨髓，加入肝素抗凝。置20 mL DMEM/F12培養(yǎng)基中，1 000 r/min離心10 min，收集細胞；再加入完全培養(yǎng)基（含有DMEM/F12，50 ng/mL人表皮生長因子，10 ng/mL人堿性成纖維細胞生長因子，10-8mol/L地塞米松，2 mmol/L谷氨酰胺，5%胎牛血清，100 U/mL青霉素/鏈霉素），將細胞懸浮后接種到10 mm培養(yǎng)皿中，隨后置于37℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后全量換液，以后每隔2 d換液，當細胞生長至80%融合時用0.25%胰蛋白酶進行1∶2的消化傳代。培養(yǎng)的過程中，倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)和生長狀況。

1.2.2 細胞增殖能力檢測 取分離至3個不同個體的處于對數(shù)生長期的第4代gBM-MSCs，加入完全培養(yǎng)基稀釋為2×104/mL細胞懸液，按每孔100 μL接種到96孔板中，每隔2 d換液；接種后的第1天起，每隔24 h加入10 μL CCK-8試劑，置于37℃恒溫箱中孵育4 h，用酶標儀檢測450 nm處的吸光值，連續(xù)檢測7 d，并用GraphPad Prism 5軟件進行數(shù)據(jù)處理。

1.2.3 細胞核型分析 取第15代處于對數(shù)生長期的gBM-MSCs，加入80 μL 0.1 mg/mL秋水仙素，置37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育3.5 h；消化收集細胞，加入8 mL 0.075 mol/L KCl低滲液，置于37℃水浴鍋，孵育30 min，固定，滴片；Gimesa染色15 min，自來水沖洗，自然晾干，油鏡下觀察細胞中期染色體形態(tài)及數(shù)目，并用Genus軟件分析。

1.2.4 免疫熒光法檢測細胞表面標志物CD13、CD-29、CD44、CD90和CD106 取第4代gBM-MSCs，在6孔板內(nèi)進行細胞爬片，細胞生長至80%融合時，每孔加入1.5 mL 4%多聚甲醛固定30 min；加入封閉液（PBS+2%牛血清蛋白+2%山羊封閉血清+2%脫脂奶粉+0.15 mol/L甘氨酸）室溫封閉2 h；滴加1∶200稀釋兔多克隆抗體CD13、CD29、CD44、CD106、CD90，4℃孵育過夜，PBS沖洗；之后加入1∶50稀釋異硫氰酸熒光素（FITC）標記的山羊抗兔IgG，室溫孵育2 h；DAPI染色15 min后共聚焦顯微鏡下觀察結(jié)果。陰性對照以磷酸鹽緩沖液（PBS）代替第一抗體。

1.2.5 流式細胞術(shù)檢測細胞表面標志物CD34、CD45和CD166 消化收集第4代gBM-MSCs，用F-PBS（含1%胎牛血清PBS）重懸，將細胞以106個/管分裝至2 mL離心管中，離心棄上清，分別加5 μL兔多克隆抗體 CD34、CD45和CD166，避光常溫孵育2 h，PBS沖洗，之后加入1∶50稀釋異硫氰酸熒光素（FITC）標記的山羊抗兔IgG，室溫孵育2 h；補加F-PBS沖洗2次，離心棄上清，加800 μL 2%多聚甲醛固定，流式細胞儀檢測，用FlowJo 7.6.1軟件分析數(shù)據(jù)。

1.2.6 多向分化潛能檢測 消化收集第4代gBMMSCs，加完全培養(yǎng)基，將細胞濃度調(diào)整至2×104個/mL，接種于六孔板中，培養(yǎng)24 h后，更換誘導培養(yǎng)液，以后每隔2 d換液，第21天檢測誘導結(jié)果。對于成脂肪誘導的細胞，用1%油紅O染色，倒置熒光顯微鏡觀察脂滴形成情況；用RT-PCR法檢測脂肪細胞經(jīng)典基因過氧化物酶體增殖物激活受體γ PPARG（Peroxisome proliferator-activated receptor gamma）的表達。成骨誘導的細胞，用20 ng/mL硝酸銀染色，觀察鈣鹽沉積情況；用RT-PCR法檢測骨細胞經(jīng)典基因骨鈣素蛋白GLA（Galactosidase alpha）的表達。成軟骨誘導的細胞，用1%阿利新藍染色，觀察酸性黏多糖合成情況，用RT-PCR法檢測軟骨細胞經(jīng)典基因光蛋白聚糖LUM（lumican）的表達。

成脂肪誘導液：IMDM，5%牛胎血清，1 μmol/L地塞米松，5 μg/mL胰島素，0.5 mmol/L黃嘌呤，60 μmol/L吲哚美辛；成骨誘導液：IMDM，5%牛胎血清，0.1 μmol/L地塞米松，0.05 mmol/L維生素C，10 mmol/L β-甘油磷酸；成軟骨誘導液：IMDM，5%牛胎血清，10 ng/mL 轉(zhuǎn)化生長因子-β，10-7mol/L地塞米松，50 μg/mL維生素C。

1.2.7 多向分化相關(guān)基因動態(tài)表達分析 按照上述1.2.6中的實驗方法誘導培養(yǎng)gBM-MSCs后，分別提取誘導7、14和21 d 后的細胞總RNA，通過熒光定量PCR法檢測誘導不同天數(shù)后相應(yīng)分化基因動態(tài)表達情況。對于成脂肪誘導的細胞，檢測脂肪經(jīng)典基因PPARG的表達趨勢；對于成骨誘導的細胞，檢測骨經(jīng)典基因GLA的表達趨勢；對于成軟骨誘導的細胞，檢測軟骨經(jīng)典基因LUM的表達趨勢；以未誘導的gBM-MSCs作為對照，基因相對表達量用GAPDH標準化并用 2-ΔΔCt法運算。

2 結(jié)果

2.1 細胞分離和培養(yǎng)

實驗對5個絨山羊流產(chǎn)胎兒進行了骨髓分離培養(yǎng)，獲得了5株gBM-MSCs。gBM-MSCs原代培養(yǎng)時4-6 h開始貼壁，大約培養(yǎng)14 d后達到80% 匯合，通過培養(yǎng)基篩選和傳代培養(yǎng)去除其他類型的干細胞和終末分化細胞，傳至P5時呈現(xiàn)均一的成纖維樣細胞，貼壁生長，狀態(tài)良好（圖1）。

圖1 阿爾巴斯絨山羊骨髓間充質(zhì)干細胞形態(tài)

2.2 細胞增殖能力檢測

第5代gBM-MSCs生長曲線呈S型（圖2），接種后第0-1天為潛伏適應(yīng)期，從第1天起快速增殖，進入對數(shù)生長期，第5天進入平臺期，平臺期持續(xù)1-2 d，之后細胞增殖速度顯著下降，進入衰退期。

圖2 第5代阿爾巴斯絨山羊骨髓間充質(zhì)干細胞生長曲線

2.3 細胞核型分析

為驗證本實驗所分離出的gBM-MSCs在體外傳代過程中細胞染色體數(shù)目是否完整，我們收集第15代gBM-MSCs做染色體數(shù)目分析，隨機選取20個樣本進行染色體計數(shù)。結(jié)果（圖3）顯示，所做的第15代gBM-MSCs中有95%（19/20）的細胞染色體為2n=60條，具有正常二倍體核型，表明體外培養(yǎng)的gBM-MSCs能夠進行正常染色體復制和分裂。

圖3 第15代阿爾巴斯絨山羊骨髓間充質(zhì)干細胞核型（2n=60）

2.4 免疫熒光法檢測細胞表面標志物CD13、CD29、CD44、CD90和CD106

免疫熒光檢測結(jié)果顯示，第5代gBM-MSCs表達間質(zhì)系表面標志物CD13（圖4-B）、整合素家族成員CD29（圖4-C）、黏附分子CD44（圖4-D）、CD106（圖4-E）及CD90（圖4-F）。

2.5 流式細胞術(shù)檢測細胞表面標志物CD34、CD45和CD166

流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，第5代gBM-MSCs表達粘附分子CD166（圖5-A）、不表達造血干細胞表面標志物CD34（圖5-B）、CD45（圖5-C）。

2.6 多向分化潛能檢測

第5代gBM-MSCs分別用成脂肪、成骨和成軟骨培養(yǎng)基誘導21 d后，進行染色和RT-PCR法鑒定。結(jié)果（圖6）顯示，成脂肪誘導后細胞質(zhì)中形成脂肪顆粒，經(jīng)油紅O染色后，能觀察到桔紅色的脂滴（圖6-A1），RT-PCR顯示成脂肪誘導后的細胞陽性表達脂肪經(jīng)典基因PPARG（圖6-A3）；成骨誘導后細胞質(zhì)中出現(xiàn)鈣鹽沉積，硝酸銀染色呈陽性（圖6B1），RT-PCR顯示成骨誘導后的細胞陽性表達成骨經(jīng)典基因GLA（圖6-B3）；成軟骨誘導后細胞質(zhì)中形成酸性黏多糖，經(jīng)阿爾新蘭染色后，能特異性著藍色（圖6-C1）；RT-PCR顯示成軟骨誘導后的細胞陽性表達軟骨經(jīng)典基因LUM（圖6-C3）。以上結(jié)果顯示，gBM-MSCs具有多向分化潛能。

圖4 免疫熒光法檢測第5代阿爾巴斯絨山羊骨髓間充質(zhì)干細胞表面標志物

圖5 流式細胞術(shù)檢測第5代阿爾巴斯絨山羊骨髓間充質(zhì)干細胞表面標志物

2.7 多向分化相關(guān)基因動態(tài)表達分析

進一步通過熒光定量PCR法檢測誘導7、14和21 d后相關(guān)分化基因動態(tài)表達情況，結(jié)果（圖7）顯示，成脂肪細胞誘導后脂肪經(jīng)典基因PPARG表達量隨著誘導天數(shù)的增加逐步上升，誘導21 d后達到最高，約上調(diào)1 270倍（圖7-A）；成骨細胞誘導后骨細胞經(jīng)典基因GLA的表達也隨著誘導天數(shù)的增加逐步上調(diào)，誘導21 d后達到最高，約上調(diào)165倍（圖7-B）；成軟骨細胞誘導后軟骨經(jīng)典基因LUM的表達量也逐步增加，誘導21 d后達到最高，約上調(diào)63倍（圖7-C）。本實驗進一步證實我們分離培養(yǎng)的gBM-MSCs具有多向分化潛能，多向分化相關(guān)基因的表達水平隨著誘導天數(shù)的增加呈上升趨勢。

3 討論

本研究采用全骨髓貼壁培養(yǎng)法，對5個絨山羊流產(chǎn)胎兒進行了骨髓分離培養(yǎng)，用含人表皮生長因子（EGF）和人堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）等的擴增培養(yǎng)基培養(yǎng)，獲得了5株細胞，該細胞具備MSCs的生物學特征。有研究證實，培養(yǎng)基中添加人堿性成纖維細胞生長因子有利于細胞貼壁生長［12］，同時不影響其多向分化能力［13］；而人表皮生長因子的添加能夠促進細胞增殖，縮短細胞的倍增時間［14，15］。

目前，MSCs的鑒定采用2006年國際細胞治療協(xié)會（International Soeiety for Cellular Therapy，ISCT）提出的標準，包括以下幾方面：①細胞形態(tài)為成纖維細胞樣，具有貼壁生長特性；②陽性表達間質(zhì)系表面標志物，如CD73（SH3和SH4），CD105（SH2）和CD90（Thy1）等，陰性表達造血干細胞表面標志物，如：CD45，CD19，CD19或CD79、CD14或CD11b和HLA-DR等；③具有向脂肪細胞、成骨細胞和軟骨細胞分化的多向分化潛能［16，17］。本實驗對gBM-MSCs生物學特征進行了系統(tǒng)研究，結(jié)果顯示，gBM-MSCs體外培養(yǎng)時具有貼壁特性，呈梭形或紡錘形，具有較強的增殖能力，符合MSCs的基本特征；可連續(xù)穩(wěn)定傳代至15代以上，第15代gBMMSCs仍然具備正常二倍體核型；第5代gBM-MSCs表達間質(zhì)系表面標志物，如：CD13、CD29、CD44、CD106、CD90及CD166，而不表達造血干細胞表面標志物CD45及CD34；體外誘導培養(yǎng)后，gBMMSCs能夠向脂肪細胞、成骨細胞和軟骨細胞分化；以上結(jié)果說明我們分離獲得的細胞具備MSCs的生物學特性。這一結(jié)果與Ren等［18，19］的報道相似，他們研究顯示，絨山羊gBM-MSCs表達間質(zhì)系表面標志物CD29、CD44和CD90，不表達內(nèi)皮及造血干細胞表面標志物CD31及CD45，體外可以向骨細胞、神經(jīng)細胞誘導分化。

圖6 體外誘導第5代阿爾巴斯絨山羊骨髓間充質(zhì)干細胞向脂肪、成骨和軟骨細胞分化

圖7 實時定量PCR法檢測誘導后分化相關(guān)基因的動態(tài)表達

在此基礎(chǔ)上，我們通過熒光定量PCR法檢測多向分化相關(guān)基因PPARG、GLA和LUM動態(tài)表達情況。Rosen等研究顯示，PPARG通過結(jié)合脂肪細胞特異基因，如脂肪酸結(jié)合蛋白和脂肪細胞P2基因，在脂肪形成過程中扮演重要角色［20，21］。我們發(fā)現(xiàn)成脂肪誘導后PPARG表達量隨著誘導天數(shù)的增加逐步上升。GLA是成骨特異性表達基因，與骨礦化基質(zhì)的形成有關(guān)［22，23］。我們發(fā)現(xiàn)成骨誘導后GLA表達隨著誘導天數(shù)的增加逐步上調(diào)，此結(jié)果與A?il等［24］的研究一致，他們發(fā)現(xiàn)人骨髓MSCs成骨分化過程中，堿性磷酸酶和骨鈣蛋白表達上調(diào)。LUM編碼形成亮氨酸豐富的蛋白多糖家族，包括聚糖、雙鏈蛋白聚糖和纖維調(diào)節(jié)蛋白，也可能參與到膠原原纖維的構(gòu)建［25］。我們發(fā)現(xiàn)成軟骨誘導后LUM表達量同樣隨著誘導天數(shù)的增加逐步上升，誘導21 d時，表達顯著上調(diào)。本實驗發(fā)現(xiàn)體外誘導培養(yǎng)gBM-MSCs后，多向分化相關(guān)基因的表達水平隨著誘導天數(shù)的增加呈上升趨勢，進一步證實gBM-MSCs具有多向分化潛能。

綜上所述，采用全骨髓貼壁培養(yǎng)法能夠從阿爾巴斯絨山羊骨髓中分離gBM-MSCs，獲得的gBMMSCs具有自我更新及多向分化潛能。此培養(yǎng)法操作簡單，可大量分離及純化gBM-MSCs，可以為后續(xù)轉(zhuǎn)基因動物新品種培育及組織工程提供充足種子細胞，具有重要現(xiàn)實意義。

4 結(jié)論

本研究從阿爾巴斯絨山羊骨髓中分離培養(yǎng)獲得了gBM-MSCs，該細胞符合國際細胞治療協(xié)會提出的MSCs鑒定標準，具備MSCs生物學特性，可以用于后續(xù)實驗研究。

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（責任編輯 馬鑫）

Isolation，Culture and Identification of Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells from Arbas Cashmere Goat

MA Su-ri-gu-ga1PENG Hang2LIU Jia-jia3ZHANG Yi-ting4GUI Hua1LIU Peng-xia1
（1. College of Life Sciences，Inner Mongolia University，Hohhot 010021；2. Bone and Joints Research Center，F(xiàn)rontier Institute of Science and Technology，Xi'an Jiaotong University，Xi'an 710061；3. Institute of Microbiology，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100101；4. Center for Drug Safety Evaluation and Research，Shanghai Institute of Materia Medica，Chinese Academy of Sciences，Shanghai 201203）

Here we isolated and cultured Arbas cashmere goat bone marrow-derived mesenchymal stem cells（gBM-MSCs）in vitro，identified the biological characteristics of gBM-MSCs， and analyzed the dynamic expressions of differentiation genes while induced in vitro. The primary cultured gBM-MSCs were spindle cell-based， showing radial colony arrangement， and stably and continuously passed down for over 15 generations. The detections by immunofluorescence and flow cytometry showed that gBM-MSCs were positive for mesenchymal specific markers，such as CD13， CD29， CD44， CD106， CD90 and CD166， but negative for hematopoietic stem cell surface markers CD45 and CD34. The induction in vitro confirmed that gBM-MSCs owned the multiple differentiation potential， and differentiated into adipocytes， osteoblasts and chondrocyte. Real-time PCR further indicated that the expressions of differentiation genes increased throughout the culture period. Our results confirmed that the isolated and cultured cells from the bone marrow of Arbas cashmere goat possessed the biological characteristics of gBM-MSCs. Our findings promoted the basic research of MSCs in livestock and laid a theoretical foundation for the further application of gBM-MSCs in transgenic breeding and tissue engineering.

Arbas cashmere goat；mesenchymal stem cells；culture；differentiate；biological characteristics

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.02.028

2015-09-06

國家自然科學基金項目（31101698），內(nèi)蒙古杰出青年自然科學基金項目（2011JQ03）

馬蘇日古嘎，女，碩士研究生，研究方向：干細胞生物學；E-mail：1017955583@qq.com

劉鵬霞，女，副教授，碩士生導師，研究方向：干細胞生物學；E-mail：Liupengxia@imu.edu.cn