曹守瑩 白長存

（蚌埠醫(yī)學(xué)院，蚌埠 233030）

PiggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)在轉(zhuǎn)mCherry基因斑馬魚上的應(yīng)用

曹守瑩 白長存

（蚌埠醫(yī)學(xué)院，蚌埠 233030）

改造了PiggyBac轉(zhuǎn)座子供體質(zhì)粒5'-PTK-3'，將紅色熒光蛋白基因（mCherry）定向插入其中，構(gòu)建得到了基因捕獲載體質(zhì)粒：PTK-mCherry。通過顯微注射，將PiggyBac 轉(zhuǎn)座子供體質(zhì)粒與PiggyBac轉(zhuǎn)座酶mRNA共注射于斑馬魚受精卵中，篩選得到了mCherry的表達(dá)在時間及空間上均不同的轉(zhuǎn)基因斑馬魚，統(tǒng)計表明mCherry在F0代中有8.2%的表達(dá)率，PiggyBac轉(zhuǎn)座子能夠在斑馬魚中進行有效轉(zhuǎn)座且捕獲到不同基因，有效實現(xiàn)突變體的篩選。

PiggyBac轉(zhuǎn)座子；斑馬魚；基因捕獲

轉(zhuǎn)座子是一類有效的轉(zhuǎn)基因工具，它可以將外源基因?qū)胧荏w基因組，同時還可通過隨機的插入誘變使內(nèi)源基因失活，在插入的DNA中可以加入一些功能元件，從而實現(xiàn)基因捕獲（Gene trap）、啟動子捕獲（Promoter trap）和染色體重組（Chromosome rearrangement）等遺傳操作。轉(zhuǎn)座子作為正向遺傳學(xué)研究的重要工具受到越來越多人的關(guān)注［1，2］。

PiggyBac轉(zhuǎn)座子屬于DNA轉(zhuǎn)座子，最初的序列在粉紋夜蛾（Trichoplusia ni）細(xì)胞系（IFP2）中分離出來的［3］。PiggyBac轉(zhuǎn)座子長2 472 bp，中間帶有一個2.1 kb的轉(zhuǎn)錄區(qū)域，可編碼一個預(yù)測大小為64 kD的轉(zhuǎn)座酶；其兩端最外側(cè)各有長13 bp的對稱的反向末端重復(fù)（Inverted terminal repeat，ITR）［4］。PB轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座遵循“切離-粘貼”機制［5］。研究發(fā)現(xiàn)，PB特異地插入到TTAA四堿基位點，插入的同時在其兩側(cè)形成TTAA四堿基重復(fù)。它可以從插入位點處精確地切離，不留下任何痕跡，使插入位點完全回復(fù)到插入以前的狀態(tài)［6］。

PiggyBac轉(zhuǎn)座子具有轉(zhuǎn)座效率高、刪除精確、負(fù)載量大及半隨機插入等優(yōu)點，已經(jīng)開發(fā)成為轉(zhuǎn)基因昆蟲中應(yīng)用最為廣泛的載體之一。它已被證明能夠在5個目（鱗翅目、雙翅目、膜翅目、鞘翅目和直翅目）的20多種昆蟲中轉(zhuǎn)座，其主要應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因和基因插入誘變兩方面［7］，近年來的研究表明 PB轉(zhuǎn)座系統(tǒng)在哺乳動物中同樣也具有高效轉(zhuǎn)座活性以及其他特性［8］，使得該系統(tǒng)在基因組研究、基因治療、干細(xì)胞誘導(dǎo)和誘導(dǎo)后分化等研究領(lǐng)域獲得了廣泛的應(yīng)用［9-14］。研究證明PB轉(zhuǎn)座子在斑馬魚原代培養(yǎng)細(xì)胞及胚胎中均能進行轉(zhuǎn)座［15］，但是，PiggyBac轉(zhuǎn)座子結(jié)合基因捕獲技術(shù)用于斑馬魚突變體篩選及基因功能鑒定則未見報道。本研究以斑馬魚為實驗材料，利用PiggyBac轉(zhuǎn)座子自主轉(zhuǎn)座的特性，構(gòu)建無外源啟動子、帶有PiggyBac轉(zhuǎn)座子左右臂同時具有剪接受體（Splicing acceptor，SA）以及紅色熒光蛋白報告基因（mCherry）的基因捕獲載體供體質(zhì)粒，將供體質(zhì)粒與編碼PiggyBac轉(zhuǎn)座酶mRNA通過顯微注射共注射到斑馬魚單細(xì)胞期受精卵中，以期獲得具有紅色熒光蛋白mCherry表達(dá)的轉(zhuǎn)基因斑馬魚，為利用PiggyBac轉(zhuǎn)座子進行斑馬魚突變體篩選及基因功能鑒定奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 實驗所用AB系野生型斑馬魚由清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院孟安明教授惠贈，本實驗室培育繁殖，28.5℃恒溫魚房；光暗時間按14 h∶10 h交替。

1.1.2 主要試劑與儀器 編碼PiggyBac轉(zhuǎn)座酶的輔助質(zhì)粒pCMV-hyPBase，PiggyBac轉(zhuǎn)座子供體質(zhì)粒5'-PTK-3'由英國Sanger研究所構(gòu)建與保存；編碼PiggyBac轉(zhuǎn)座酶的輔助質(zhì)粒pCS2+-CMV-hyPBase由本實驗室保構(gòu)建并保存；pmCherry-N1質(zhì)粒由本實驗室保存。5'-PTK-3'質(zhì)粒圖譜見圖1-A，pCS2+-CMV-hyPBase體外轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒包含有原核SP6啟動子、1 804 bp的PiggyBac轉(zhuǎn)座酶基因。

圖1 改造前后的PiggyBac轉(zhuǎn)座子供體質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖

E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自TaKaRa公司；PCR用的DNA聚合酶為TransTaq HiFi，與T4 DNA連接酶均購自Transgene公司；限制性內(nèi)切酶Bcl I、Pst I、Nco I均購自TaKaRa公司，Acc65I 為Fermentas公司產(chǎn)品；瓊脂糖凝膠回收試劑盒為Tiangen公司產(chǎn)品；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。顯微注射系統(tǒng)為Eppendorf產(chǎn)品，拉針儀及毛細(xì)管玻璃均為NARISHIGE產(chǎn)品；倒置熒光顯微鏡產(chǎn)自奧林巴斯。

1.2 方法

1.2.1 PiggyBac轉(zhuǎn)座子供體質(zhì)粒PTK-mCherry的構(gòu)建 對5'-PTK-3'進行Bcl I和Nco I雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠，割膠并回收純化目的片段。為了將mCherry基因定向插入5'-PTK-3'載體上，設(shè)計1對引物（F：5'-CATGCCATGGTGACGCAAATGCGCGGTAGG-3'，R：5'-GGTGATCATGATTATGATCTAGAGTCGCGG-3'），（下劃線分別為Nco I和Bcl I酶切位點）。使用F、R引物，以pmCherry-N1質(zhì)粒為模板，對其進行PCR擴增，反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃復(fù)性30 s，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)Bcl I和Nco I限制性內(nèi)切酶雙酶切，酶切后進行膠回收、純化，并與經(jīng)相同的限制性內(nèi)切酶酶切獲得的5'-PTK-3'的雙酶切產(chǎn)物大片段連接，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞后涂于含氨芐青霉素（Amp+）的LB平板上，挑選陽性克隆，經(jīng)酶切鑒定后使用T3測序引物對構(gòu)建好的PTK-mCherry重組質(zhì)粒進行了測序。具體操作方法參照Sambrook等的《分子克隆實驗手冊》以及相關(guān)產(chǎn)品推薦的使用說明書。

1.2.2 PiggyBac轉(zhuǎn)座酶mRNA的體外轉(zhuǎn)錄 用限制性內(nèi)切酶Acc65I酶切輔助質(zhì)粒pCS2+-CMV-hyPBase，酶切產(chǎn)物經(jīng)Cycle-Pure kit（OMEGA，USA）純化，并進行電泳檢測。以該回收純化產(chǎn)物作為模板，采用SP6 mMessage mMachine kit（Ambion，USA）試劑盒進行體外轉(zhuǎn)錄合成，該試劑盒可對體外轉(zhuǎn)錄出的mRNA進行5'加帽反應(yīng)，mRNA 5'端的“帽子”結(jié)構(gòu)可使mRNA免遭核酸酶的破壞，且更有利于被蛋白合成的起始因子所識別，從而促進蛋白質(zhì)的合成。轉(zhuǎn)錄出的mRNA經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)量。

1.2.3 顯微注射 在進行顯微注射的前一天晚上，選擇性成熟的親魚，按雌雄數(shù)量2∶1的比例放入交配盒。第2天注射前抽去交配盒中間隔板，雌雄魚追尾并產(chǎn)卵，收集、清洗、分選，等待10 min后觀察到卵膜隆起即可進行注射。顯微注射儀裝好顯微注射針，吸取發(fā)育時期處于1-2細(xì)胞期的斑馬魚胚胎，輕輕壓擠進入注射皿的凝膠凹槽中，上面再滴幾滴胚胎孵育液，保證胚胎濕潤，把注射皿置于立體解剖鏡下，調(diào)節(jié)好注射壓力，每個胚胎注射PiggyBac轉(zhuǎn)座子供體質(zhì)粒PTK-mCherry與PiggyBac轉(zhuǎn)座酶mRNA混合液2 nL，PiggyBac轉(zhuǎn)座子供體質(zhì)粒PTK-mCherry DNA濃度為50 ng/μL，PiggyBac轉(zhuǎn)座酶mRNA的濃度為100 ng/μL。注射后的胚胎28℃培養(yǎng)于胚胎孵育液中，使其恢復(fù)發(fā)育；對照組斑馬魚受精卵僅注射生理鹽水。注射后的斑馬魚受精卵經(jīng)孵化、培育，熒光顯微鏡下進行熒光檢測。

2 結(jié)果

2.1 基因捕獲載體轉(zhuǎn)座子供體質(zhì)粒PTK-mCherry的構(gòu)建與鑒定

實驗設(shè)計構(gòu)建的基因捕獲載體轉(zhuǎn)座子供體質(zhì)粒PTK-mCherry包含PiggyBac轉(zhuǎn)座子左臂（313 bp）、右臂（241 bp）以及內(nèi)部核糖體進入位點（IRES）和mCherry基因（圖1-B）。用引物F和R從pmCherry-N1擴增到編碼mCherry的DNA片段，經(jīng)測序鑒定后插入到5'-PTK-3'的Bcl I和Nco I位點，獲得PTK-mCherry。酶切方法鑒定獲得的PTK-mCherry，瓊脂糖凝膠電泳（圖2）顯示所獲得的酶切產(chǎn)物與預(yù)期大小一致，測序結(jié)果進一步證實所構(gòu)建的載體序列正確。

圖2 PTK-mCherry重組表達(dá)質(zhì)粒的酶切鑒定

2.2 PiggyBac轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)mCherry基因的轉(zhuǎn)植與表達(dá)

在立體解剖鏡下挑選高質(zhì)量1-2細(xì)胞期受精卵，對其注射PiggyBac轉(zhuǎn)座子供體質(zhì)粒PTK-mCherry與PiggyBac轉(zhuǎn)座酶mRNA混合液。注射后的受精卵置于胚胎孵育液水體中，孵化培育，定期在熒光顯微鏡下觀察胚胎熒光表達(dá)情況。注射5天（5 dpf）后的胚胎中首次發(fā)現(xiàn)有紅色熒光表達(dá)，且紅色熒光的表達(dá)部位在不同斑馬魚中也不盡相同。圖3-A2為一嵌合體魚（5 dpf），紅色熒光主要在背部的肌肉和神經(jīng)管呈鑲嵌分布，在眼睛周圍也有表達(dá)；而此魚發(fā)育到第15天（15 dpf）時紅色熒光在身體幾乎所有部位均有表達(dá)（圖3-A3）。如圖3-B2所示，此嵌合體魚（5 dpf）的紅色熒光主要分布在腹部的腸道及眼睛周圍，發(fā)育到第15天時紅色熒光仍主要在這兩處表達(dá)（圖3-B3）。圖3-C2所示為另一不同表型的斑馬魚（5 dpf），在第5天時紅色熒光主要在腹部表達(dá)，而到第15天時則在整個頭部、腹部以及背部脊柱中均有表達(dá)（圖3-C3）。圖3-D2為一紅色熒光呈泛表達(dá)的斑馬魚（5 dpf），在第15天時仍呈泛表達(dá)（圖3-D3）。

圖3 共注射hyPBase mRNA及質(zhì)粒PTK-mCherry進行基因捕獲得到的不同表型Donor品系紅色熒光魚

本研究進行了4批斑馬魚受精卵的顯微注射，共注射受精卵1 208顆，出膜后存活仔魚975 尾。轉(zhuǎn)mCherry基因斑馬魚在出膜時的平均存活率和熒光蛋白表達(dá)陽性率分別為80.8%和8.2%（表1）。目前轉(zhuǎn)mCherry基因陽性斑馬魚F0代培育工作正在進行中，mCherry的表達(dá)穩(wěn)定，未發(fā)現(xiàn)紅色熒光減弱的現(xiàn)象。

3 討論

斑馬魚具有繁殖力強，性成熟期短，受精卵透明，誘變效率高等特點，適用于大規(guī)模的誘變和突變體篩選［16］。迄今為止，已證明在斑馬魚中具有轉(zhuǎn)座活性的轉(zhuǎn)座子包括TC3轉(zhuǎn)座子、Mariner轉(zhuǎn)座子、Tgf2轉(zhuǎn)座子、Tol2轉(zhuǎn)座子、SB（Sleeping beauty）轉(zhuǎn)座子等［17-21］，這些活性轉(zhuǎn)座子的發(fā)現(xiàn)極大方便了斑馬魚功能基因的研究。在以上幾種轉(zhuǎn)座子中，Tol2轉(zhuǎn)座子和SB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)在斑馬魚轉(zhuǎn)基因及插入突變研究中采用較多。從1998年Kawakami等［22］在硬骨魚類青鳉中克隆出Tol2轉(zhuǎn)座子開始，科學(xué)家們利用這一轉(zhuǎn)座子進行了斑馬魚轉(zhuǎn)基因、增強子捕獲及基因捕獲等研究，篩選得到了一些和斑馬魚個體發(fā)育、神經(jīng)通路相關(guān)的基因［23-25］。自2003年開始，Stephen［26］研究小組將SB轉(zhuǎn)座子應(yīng)用到斑馬魚轉(zhuǎn)基因研究中，證明SB在斑馬魚中具有較高的基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)效率，隨后他們采用SB轉(zhuǎn)座子在斑馬魚中開展增強子捕獲及轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的插入突變篩選，篩選得到一個斑馬魚胚胎發(fā)育相關(guān)基因［27］。Clark等［28］運用SB轉(zhuǎn)座子在脊椎動物中開展基因捕獲研究，并證明了SB轉(zhuǎn)座子進行基因捕獲的有效性。Mátés等［29，30］對SB轉(zhuǎn)座系統(tǒng)中的轉(zhuǎn)座酶進行了改良，得到了高活性SB轉(zhuǎn)座酶SB100X，成功運用到斑馬魚等脊椎動物的轉(zhuǎn)基因研究中。

表1 PiggyBac轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)mCherry基因斑馬魚的存活率和熒光率檢測

與Tol2轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)、SB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)等誘變工具相比較，PB轉(zhuǎn)座系統(tǒng)有其獨特的優(yōu)勢：可以在生殖細(xì)胞中高效轉(zhuǎn)座，PB轉(zhuǎn)座子插入在基因組中分布廣泛而且偏好基因區(qū)，攜帶外源基因能力更強，在轉(zhuǎn)座酶存在的情況下可以進行自發(fā)轉(zhuǎn)座。目前，PB轉(zhuǎn)座系統(tǒng)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于脊椎動物功能基因的篩選研究，并且在使用過程中不斷被進行各種改造，以具備更強的轉(zhuǎn)座能力。Landrette等［31］使用PB轉(zhuǎn)座系統(tǒng)進行體細(xì)胞突變篩選，得到了小兒腎癌相關(guān)基因 TFE3、TFEB、MITF；Thomas等［32］利用PB轉(zhuǎn)座子插入突變，篩選到了黑素瘤相關(guān)基因Arhgef3、Map3k1、Map3k2、Mitf、Rapgef2；Rad等［33］在小鼠中使用PB轉(zhuǎn)座系統(tǒng)進行基因篩選，發(fā)現(xiàn)了胰腺癌發(fā)生中的原癌基因相互作用網(wǎng)絡(luò)；Gayle等［34］利用PB轉(zhuǎn)座子插入突變篩選發(fā)現(xiàn)了RhoA在人胚胎干細(xì)胞分化過程中的作用機制；Sato和Pettitt［35，36］兩個研究小組分別對PB轉(zhuǎn)座系統(tǒng)進行了改造，使之在包括小鼠單倍體胚胎干細(xì)胞在內(nèi)的非人類哺乳動物細(xì)胞中能夠更加高效進行轉(zhuǎn)座；Cooney等［37］使用腺病毒作為PB轉(zhuǎn)座系統(tǒng)的運載工具，對體細(xì)胞進行在體（in vivo）外源基因?qū)?，極大提高了PB轉(zhuǎn)座系統(tǒng)的導(dǎo)入效率。

在基因篩選過程中，使用含有PB轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)基因動物，與含有PB轉(zhuǎn)座酶基因的異性同種轉(zhuǎn)基因動物交配，即可改變轉(zhuǎn)座子插入位點［38，39］，極大地方便了大規(guī)模功能基因篩選工作的進行。

本實驗利用斑馬魚為研究材料，探索PiggyBac轉(zhuǎn)座子結(jié)合基因捕獲技術(shù)用于斑馬魚突變體篩選及基因功能鑒定的可行性，同時嘗試在斑馬魚中實現(xiàn)使用PiggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)進行在體（in vivo）轉(zhuǎn)座，為斑馬魚突變體的大規(guī)模篩選和遺傳分析提供新的插入誘變工具。在此工作基礎(chǔ)上，一方面，可以建立自己的斑馬魚突變體資源庫，另一方面，還可以通過與已知的斑馬魚突變品系進行雜交，研究基因與基因之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)，應(yīng)用于基因功能的進一步研究。

為了達(dá)到上述目的，首先需要篩選得到含有PB轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)基因斑馬魚，我們對PiggyBac二元轉(zhuǎn)座系統(tǒng)的供體質(zhì)粒-轉(zhuǎn)座子載體質(zhì)粒5'-PTK-3'進行改造，構(gòu)建了一個無外源啟動子，包含PiggyBac轉(zhuǎn)座子的5'-TR及3'-TR、剪接受體（the mouse engrailed-2 gene splicing acceptor，En-2SA）、內(nèi)部核糖體進入位點（Internal ribosome entry site，IRES）、報告基因（mCherry）以及polyA信號序列（bGH polyA）的基因捕獲載體質(zhì)粒：PTK-mCherry。理論上，mCherry將在兩種情況下表達(dá)：第一，當(dāng)mCherry插入在5'非翻譯區(qū)（5' UTR）的一個外顯子之后并在該基因的起始密碼子之前，而且mCherry的表達(dá)方向與該基因一致，則mCherry的第一個ATG將被當(dāng)作起始密碼子被轉(zhuǎn)錄；第二，當(dāng)mCherry插入到一個基因編碼區(qū)內(nèi)的某個內(nèi)含子當(dāng)中且表達(dá)方向與該基因一致，則mCherry將被融合到插入位點前的編碼區(qū)，轉(zhuǎn)錄成融合mRNA。

參考Tol2轉(zhuǎn)座子進行基因捕獲時所用的條件［40，41］，使用環(huán)狀基因捕獲載體質(zhì)粒PTK-mCherry與轉(zhuǎn)座酶hyPBase mRNA共注射導(dǎo)入斑馬魚受精卵中，成功篩選到了紅色熒光表達(dá)斑馬魚，且紅色熒光表達(dá)率約為8.2%，與使用Tol2進行基因捕獲時效率相似。

本研究篩選到多種紅色熒光表型的斑馬魚，且發(fā)現(xiàn)隨著發(fā)育的進行同一條斑馬魚的熒光表達(dá)譜也會有變化。推測斑馬魚紅色熒光表型不同是因為捕獲到了不同的基因，由于紅色熒光的表達(dá)受捕獲到的內(nèi)源基因啟動子控制，反映內(nèi)源基因的表達(dá)，捕獲到的基因不同也就造成了不同斑馬魚中紅色熒光表達(dá)不盡相同。在同一條斑馬魚中可能同時捕獲到多個不同基因，這些基因的表達(dá)時期不盡相同，即使同一個基因隨著發(fā)育的進行表達(dá)強度和范圍也有可能發(fā)生改變，這也就解釋了為什么隨著發(fā)育的進行同一條斑馬魚的熒光表達(dá)譜也會有變化。

4 結(jié)論

本研究證明PiggyBac轉(zhuǎn)座子能夠在斑馬魚中進行有效轉(zhuǎn)座且捕獲到不同基因，因此PiggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)在斑馬魚中可以作為一種新的技術(shù)手段，有效實現(xiàn)突變體的篩選。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

The Application of the PiggyBac Transposon System in mCherrytransgenic Danio rerio

CAO Shou-ying BAI Chang-cun
（Bengbu Medical College，Bengbu 233030）

The red fluorescent protein gene（mCherry）was inserted into the modified PiggyBac transposon donor plasmid 5'-PTK-3'， and the vector plasmid for gene trap， PTK-mCherry was constructed. PTK-mCherry and PiggyBac transposase mRNA were co-injected into fertilized eggs by microinjection， and the zebrafishes expressing mCherry in different temporally and spatially patterns were acquired. The statistics revealed that the expression rate of mCherry in F0 was 8.2%， indicating that PiggyBac transposon efficiently translocated and captured the different genes in zebrafish， and the efficient screening of mutants was achieved.

PiggyBac transposon；zebrafish；gene trap

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.02.027

2015-04-21

安徽省生化藥物工程技術(shù)研究中心開放課題（BYEC1302），蚌埠醫(yī)學(xué)院校自然科學(xué)項目（Byky1329）

曹守瑩，女，碩士研究生，研究方向：基因工程研究及生化藥物開發(fā)；E-mail：bestcsy@163.com

白長存，男，碩士，研究方向：基因工程研究及生化藥物開發(fā)；E-mail：baichangcun@163.com