廖春華　鄒垂彬　謝國秀　吳小波*　黃京山

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)蜜蜂研究所，南昌330045；2.江西省職業(yè)病防治研究院，南昌330000)

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飼糧粗蛋白質(zhì)水平對中華蜜蜂育王質(zhì)量的影響

廖春華1鄒垂彬1謝國秀2吳小波1*黃京山1

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)蜜蜂研究所，南昌330045；2.江西省職業(yè)病防治研究院，南昌330000)

本試驗旨在研究飼糧粗蛋白質(zhì)水平對中華蜜蜂蜂王育王的影響。選取基本情況相近的中華蜜蜂9群，隨機分成3組，每組3群，在每群蜂巢門口裝置脫粉器，阻止花粉進入，使其處于缺粉狀態(tài)。Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組蜂群分別飼喂粗蛋白質(zhì)水平為15%、25%、35%的試驗飼糧，45 d后控制蜂王產(chǎn)卵，并進行人工育王，待蜂王出房后，測其初生重、胸寬，并檢測其卵巢卵黃蛋白原基因(vitellogenin，Vg)、轉(zhuǎn)鐵蛋白基因(transferrin，Trf)的相對表達量。結(jié)果表明：蜂王的初生重隨飼糧粗蛋白質(zhì)水平的增加而升高，Ⅲ組和Ⅱ組培育蜂王的初生重顯著高于Ⅰ組(P<0.05)，且Ⅲ組也顯著高于Ⅱ組(P<0.05)；蜂王的胸寬隨飼糧粗蛋白質(zhì)水平的增加而升高，但3個試驗組之間差異不顯著(P>0.05)。Ⅲ組和Ⅱ組培育蜂王卵巢的Vg相對表達量顯著高于Ⅰ組(P<0.05)，但Ⅲ組與Ⅱ組之間差異不顯著(P>0.05)；培育蜂王卵巢的Trf相對表達量3個試驗組間均有顯著差異(P<0.05)，相對表達量最高的是Ⅲ組，最低的是Ⅰ組。由此得出，飼糧粗蛋白質(zhì)水平對中華蜜蜂育王質(zhì)量存在影響，高蛋白質(zhì)飼糧可以增加中華蜜蜂蜂王的初生重，促進蜂王卵巢Vg和Trf的表達。育王時，中華蜜蜂飼糧粗蛋白質(zhì)水平不應(yīng)低于25%。

中華蜜蜂；育王質(zhì)量；粗蛋白質(zhì)水平

蜜蜂是與人類以及大自然關(guān)系密切的社會性昆蟲，它不僅可以為人類提供營養(yǎng)豐富的蜂產(chǎn)品，而且通過授粉模式維持生態(tài)平衡，對保護和維持生物多樣性起著重要作用[1]。蜂王是蜜蜂蜂群當(dāng)中的主要繁殖個體，蜂王質(zhì)量決定群勢的強弱，高質(zhì)量蜂王對感染寄生蟲病有較高的抵抗能力，因此培育高質(zhì)量、高抵抗力的蜂王對于養(yǎng)蜂生產(chǎn)尤為重要。在傳統(tǒng)育王過程中，養(yǎng)蜂人員通常通過獎勵飼喂糖水來提高蜂王的培育質(zhì)量，僅依靠外界粉源及巢脾中儲存的蜂糧提供蛋白質(zhì)營養(yǎng)。但由于季節(jié)等因素，外界粉源缺乏、蜂群自身儲備又不足時，會導(dǎo)致蜜蜂營養(yǎng)物質(zhì)的缺乏，此時會對蜜蜂的繁殖及蜂王的培養(yǎng)產(chǎn)生較大的影響，有經(jīng)驗的養(yǎng)蜂人員在缺粉的情況下會適當(dāng)添加一些花粉，但不同花粉的營養(yǎng)效價不一樣，而且隨著花粉價格的不斷提升，許多養(yǎng)蜂人員會為了降低養(yǎng)蜂成本而選擇黃豆粉等人工合成飼糧來代替花粉，而人工合成飼糧中蛋白質(zhì)水平不同對蜂群的應(yīng)用效果也不一樣。近年來，蜜蜂蛋白質(zhì)營養(yǎng)需要研究取得了階段性成果，研究發(fā)現(xiàn)：蛋白質(zhì)缺乏會影響蜜蜂的生長發(fā)育，導(dǎo)致蜂王產(chǎn)卵和工蜂育子能力降低，影響羽化工蜂的體重和體組織蛋白質(zhì)含量、產(chǎn)漿量、卵的孵化率、幼蟲化蛹率、機體抗氧化活性，使蜂群群勢急劇下降，甚至導(dǎo)致整個蜂群消亡等[2-9]。目前關(guān)于飼糧蛋白質(zhì)水平對育王質(zhì)量的影響未見報道?；诖耍覀冮_展了本項試驗，通過探索飼糧粗蛋白質(zhì)水平對中華蜜蜂(Apisceranacerana)育王質(zhì)量的影響，為優(yōu)質(zhì)蜂王培育提供一定的理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1試驗動物

試驗動物為江西農(nóng)業(yè)大學(xué)蜜蜂研究所飼養(yǎng)的中華蜜蜂，于2015年8月至10月在江西農(nóng)業(yè)大學(xué)蜜蜂研究所開展試驗。

1.2飼糧及主要試劑

不同粗蛋白質(zhì)水平的飼糧(由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)提供)，油菜蜜，DNA聚合Taq酶和對應(yīng)的緩沖液Buffer(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司產(chǎn)品)，Trizol總RNA提取試劑盒和RNA酶抑制劑(北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品)，Oligo(dT)(5.97 nmol/OD，由美國英杰生命技術(shù)公司上海辦事處合成)，dNTP Mixture(2.5 mmole，TaKaRa)，反轉(zhuǎn)錄酶M-mLV(200 U/μL，TaKaRa)。

1.3主要儀器

生化培養(yǎng)箱(GZ-250-GSI型，韶關(guān)市廣智科技設(shè)備發(fā)展有限公司產(chǎn)品)，核酸蛋白質(zhì)測定儀(NanoPhotometerTM P300，IMPLEN)，普通離心機(飛鴿KA-1000型，上海安亭科學(xué)儀器廠公司)，熒光定量PCR儀(iQTM2型，Bio-Rad公司)，PCR儀(iQTM2型，Bio-Rad公司)。

1.4試驗方法

1.4.1蜜蜂飼喂及育王

選取群勢相當(dāng)?shù)闹腥A蜜蜂9群(每群5脾蜂)，隨機分成3組，每組3群，在每群蜂巢門口裝置脫粉器，阻止花粉進入，使其處于缺粉狀態(tài)。Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組蜂群分別飼喂粗蛋白質(zhì)水平為15%、25%、35%的試驗飼糧，試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1[7]，每隔3 d飼喂1次，每次足量飼喂。定期對蜂群進行檢查并飼喂糖水。飼喂45 d后，將提前準(zhǔn)備好的空巢脾分別添加到每群蜂中，控制蜂王產(chǎn)卵8 h后，用隔王板將產(chǎn)卵的巢脾和蜂王分開。3 d后，按照標(biāo)準(zhǔn)的人工育王方法培育中華蜜蜂蜂王[10]。

表1　試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

預(yù)混料可為每千克飼糧提供The premix provided the following per kg of diets：VA 5 000 IU，VB15.4 mg，VB26 mg，VC 265.4 mg，VE 240 mg，VD 2 000 IU，VB67 mg，葉酸 folic acid 20 mg，煙酸 niacin 18 mg，肌醇 inositol 318 mg。

1.4.2蜂王初生重及胸寬測定

在處女王出生的前1天，將王臺按組別統(tǒng)一裝入框式王籠中，移至恒溫恒濕培養(yǎng)箱(溫度34 ℃，相對濕度80%)中羽化出房，用分析天平稱量剛出房蜂王的體重，同時測量其胸寬，記錄試驗數(shù)據(jù)。

1.4.3蜂王卵巢卵黃蛋白原基因(vitellogenin，Vg)、轉(zhuǎn)鐵蛋白基因(transferrin，Trf)表達的測定

1.4.3.1樣品采集

剛出房的蜂王測完初生重、胸寬后立即解剖，采集卵巢，分別裝入1.5 mL RNase-free的EP管迅速放入液氮中，用于后續(xù)檢測。

1.4.3.2總RNA的提取與cDNA的合成

每組取4只蜂王的卵巢，放入含液氮的研缽中進行研磨，研磨成粉末后轉(zhuǎn)入裝有1 mL Trizol的1.5 mL的EP管中。參考秦秋紅[11]的方法對樣本總RNA進行提取，用核酸蛋白質(zhì)測定儀測定其OD260/280(1.9～2.1之間符合標(biāo)準(zhǔn))和總RNA濃度，每個組測3次，取平均值。

用反轉(zhuǎn)錄試劑盒對總RNA進行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系為50 μL，包括：8 μL總RNA，10 μL Buffer，8 μL dNTP，1.5 μL反轉(zhuǎn)錄酶M-mLV，3 μL Oligo(dT)，1 μL RNA酶Inhibitor，18.5 μL焦碳酸二乙酯(DEPC)水。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件如下：體系混勻后，42 ℃反應(yīng)60 min，75 ℃滅活5 min。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物保存于-80 ℃。

1.4.3.3熒光定量PCR引物的設(shè)計及熒光定量PCR

式中：ER為內(nèi)參基因擴增效率；ET為目的基因擴增效率；CT,R為內(nèi)參基因Ct值；CT,T為目的基因Ct值。

表2　熒光定量PCR引物序列

1.5數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)用SPSS 17.0軟件中的ANOVA程序進行差異顯著性比較分析。

2　結(jié)　果

2.1飼糧粗蛋白質(zhì)水平對培育蜂王初生重及胸寬的影響

由表3可知，蜂王的初生重隨飼糧粗蛋白質(zhì)水平的增加而升高，Ⅲ組和Ⅱ組的平均體重顯著高于Ⅰ組(P<0.05)，且Ⅲ組也顯著高于Ⅱ組(P<0.05)。蜂王的胸寬隨飼糧粗蛋白質(zhì)水平的增加而增加，但試驗組之間差異不顯著(P>0.05)。

2.2飼糧粗蛋白質(zhì)水平對培育蜂王卵巢Vg、Trf相對表達量的影響

由圖1可知，Ⅲ組和Ⅱ組培育蜂王的卵巢Vg相對表達量顯著高于Ⅰ組(P<0.05)，但Ⅲ組與Ⅱ組之間差異不顯著(P>0.05)。

表3　飼糧粗蛋白質(zhì)水平對培育蜂王初生重及胸寬的影響

同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

Values in the same column with the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05).

數(shù)據(jù)柱標(biāo)注相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下圖同。

Date columns with the same letters mean no significant difference (P>0.05), while with different letters mean significant difference (P<0.05). The same as below.

圖1飼糧粗蛋白質(zhì)水平對培育蜂王卵巢Vg基因表達量的影響

Fig.1Effects of dietary protein level on the relative expression level ofVgin ovary of rearing queens

由圖2可知，Ⅲ組和Ⅱ組培育蜂王的卵巢Trf相對表達量顯著高于Ⅰ組(P<0.05)，且Ⅲ組也顯著高于Ⅱ組(P<0.05)。

3　討　論

營養(yǎng)是影響蜜蜂健康的關(guān)鍵因素，合理、均衡的營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)以及適宜的環(huán)境是維持蜜蜂健康，保持高水平生產(chǎn)性能的重要條件。而蜂王是蜜蜂蜂群當(dāng)中的主要繁殖個體，蜂王的質(zhì)量決定蜂群群勢的強弱。蜂王的初生重與蜂王的質(zhì)量成正比關(guān)系，初生重大的蜂王，具有發(fā)育良好的卵巢管和數(shù)量較多的卵小管，這種蜂王具有較強的產(chǎn)卵力[15]。許少玉等[16]發(fā)現(xiàn)，中蜂蜂王初生重和卵小管數(shù)之間存在顯著的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)高達0.919。因此，蜂王初生重是衡量蜂王質(zhì)量的一項重要指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)：隨著飼糧粗蛋白質(zhì)水平的增加，中華蜜蜂蜂王初生重明顯增加，Ⅲ組和Ⅱ組培育蜂王的初生重顯著高于Ⅰ組，且Ⅲ組培育蜂王的初生重也顯著高于Ⅱ組。其主要原因可能是因為：蛋白質(zhì)是生命活動的物質(zhì)基礎(chǔ)，是生物體細胞的重要組成成分，為蜜蜂機體組織發(fā)育、更新、修補提供原料[17]。氨基酸是蛋白質(zhì)的基本組成單位，其分解中間產(chǎn)物為乙酰輔酶A，而乙酰輔酶A是三大營養(yǎng)物質(zhì)代謝的中間產(chǎn)物，它是與生命及與各種形式的生命活動緊密聯(lián)系在一起的物質(zhì)。在蜂王培育過程中飼喂高粗蛋白質(zhì)水平的飼糧，使蜂王發(fā)育得到足夠的蛋白質(zhì)供應(yīng)，提高營養(yǎng)物質(zhì)之間相互調(diào)節(jié)、相互轉(zhuǎn)換效率，使得機體能夠充分發(fā)育，從而提高了蜂王的質(zhì)量。Tarpy等[18]研究發(fā)現(xiàn)，胸寬與卵巢的發(fā)育存在一定的相關(guān)性，蜂王胸寬與卵巢管數(shù)存在正相關(guān)，胸寬的蜂王具有更多的卵巢管數(shù)，因此胸寬也是評估蜂王質(zhì)量的重要指標(biāo)，本研究發(fā)現(xiàn)：中華蜜蜂蜂王的胸寬隨著飼糧蛋白質(zhì)水平的增加而增加，但各試驗組之間差異不顯著，具體原因有待于進一步研究與分析。

圖2　飼糧粗蛋白質(zhì)水平對培育蜂王卵巢Trf相對表達量的影響

Vg是一類大分子質(zhì)量的糖脂復(fù)合蛋白質(zhì)，廣泛存在于卵生脊椎動物和非脊椎動物的血淋巴脂肪體和卵等器官中，是蜜蜂卵黃發(fā)生的關(guān)鍵物質(zhì)，與蜂王的繁殖力、壽命和蜜蜂行為等生物學(xué)功能變化密切相關(guān)，卵黃蛋白原是卵黃蛋白的前體，卵黃蛋白為胚胎發(fā)育提供蛋白質(zhì)、必需氨基酸等多種營養(yǎng)物質(zhì)，卵巢發(fā)育好的蜂王其Vg具有較高的表達量[19-27]，因此Vg的表達量也是衡量蜂王質(zhì)量的重要指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)：Ⅲ組和Ⅱ組卵巢Vg的相對表達量顯著高于Ⅰ組，但Ⅲ組與Ⅱ組之間差異不顯著。這也說明高蛋白質(zhì)飼糧比低蛋白質(zhì)飼糧培育的蜂王卵巢發(fā)育程度高。Human等[28]研究發(fā)現(xiàn)，高蛋白質(zhì)飼糧會促進工蜂的卵巢發(fā)育。本試驗結(jié)果與Human等[28]的試驗結(jié)果很相似，這也說明飼糧蛋白質(zhì)水平對蜂王質(zhì)量存在影響，過低的蛋白質(zhì)水平不利于蜂王卵巢發(fā)育。Ⅲ組與Ⅱ組卵巢Vg相對表達量差異不顯著，可能是因為當(dāng)飼糧中的蛋白質(zhì)到達一定水平時已能滿足卵巢發(fā)育所需的蛋白質(zhì)的量。

Trf是蜜蜂體內(nèi)鐵的運輸者，通過Trf受體介導(dǎo)的“結(jié)合鐵的轉(zhuǎn)鐵蛋白-轉(zhuǎn)鐵蛋白受體”復(fù)合物的內(nèi)吞，Trf將其結(jié)合的鐵送入細胞內(nèi)[29-30]。蜜蜂體內(nèi)的Trf和鐵結(jié)合蛋白能夠調(diào)控游離Fe2+和Fe3+的含量，增強蜜蜂對感染寄生蟲病的抵抗能力，降低因鐵含量過高而引起的氧化反應(yīng)對蜜蜂機體的危害[29,31-33]。Koywiwattrakul等[34]研究發(fā)現(xiàn)，Trf在卵巢發(fā)育的工蜂上的表達量顯著高于卵巢未發(fā)育的工蜂，Trf表達量的上調(diào)將通過一系列下游反應(yīng)使卵巢活化，刺激工蜂的產(chǎn)卵行為。因此，Trf的表達量也可以為評價蜂王質(zhì)量做參考。本研究發(fā)現(xiàn)：隨著飼糧蛋白質(zhì)水平的增加，Ⅲ組和Ⅱ組卵巢Trf相對表達量顯著高于Ⅰ組，且Ⅲ組也顯著高于Ⅱ組，說明給蜜蜂飼喂高蛋白質(zhì)飼糧能夠明顯提升卵巢Trf含量，促進卵巢的發(fā)育，提高培育蜂王的抵抗力，促進卵巢的活化和產(chǎn)卵力。

4　結(jié)　論

① 飼糧粗蛋白質(zhì)水平對中華蜜蜂育王質(zhì)量存在影響，高蛋白質(zhì)飼糧可以增加蜂王的初生重，促進蜂王卵巢Vg和Trf的表達。

② 育王時，中華蜜蜂飼糧粗蛋白質(zhì)水平不應(yīng)低于25%。

致謝：

感謝山東農(nóng)業(yè)大學(xué)胥保華教授團隊提供試驗蛋白質(zhì)飼糧！

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*Corresponding author, associate professor, E-mail: wuxiaobo21@163.com

(責(zé)任編輯菅景穎)

Effects of Dietary Crude Protein Level on Quality of Rearing Queens forApisceranacerana

LIAO Chunhua1ZOU Chuibin1XIE Guoxiu2WU Xiaobo1*HUANG Jingshan1

(1. Honeybee Research Institute, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China;2. Institute of Occupational Medicine of Jiangxi, Nanchang 330000, China)

The objective of this experiment was to explore the effects of dietary crude protein level on the quality of rearing queens forApisceranacerana. Nine colonies ofApisceranaceranawith basic similar conditions were randomly divided into 3 groups with 3 colonies in each group. Pollen trap was installed at the entrance of colonies to prevent pollen entering. Bees in groups Ⅰ, Ⅱ and Ⅲ were fed diets containing 15%, 25% and 35% crude protein, respectively. Forty-five days later, queens were reared in each colon and the birth weight, chest width of newly emerged queens as well as the relative expression levels of vitellogenin (Vg) and transferrin (Trf) in ovary of rearing queens were tested. The results showed as follows:the birth weight of rearing queens was increased with the increase of dietary crude protein level. The birth weight of rearing queens in groups Ⅲ and Ⅱ was significantly higher than that in group Ⅰ (P<0.05), and the birth weight of rearing queens in group Ⅲ was significantly higher than that in group Ⅱ (P<0.05). The chest width of rearing queens was raised with the increase of dietary crude protein level, but no significant difference was found among the three experimental groups (P>0.05). The relative expression level ofVgin ovary in groups Ⅲ and Ⅱ was significantly higher than that in group Ⅰ (P<0.05), while there was no significant difference between groups Ⅱ and Ⅲ (P>0.05). The relative expression level ofTrfin ovary was significantly different among the three experimental groups (P<0.05), the highest relative expression level was found in group Ⅲ, and the lowest relative expression level was found in group Ⅰ. In conclusion, the quality of rearing queens forApisceranaceranais affected by dietary crude protein level. The high-protein diets can increase the birth weight of queens and enhance the expression ofVgandTrfin ovary of rearing queens forApisceranacerana. The minimum dietary crude protein level ofApisceranaceranafor queen rearing is 25%.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2016, 28(9)：2998-3004]

Apisceranacerana; quality of rearing queens; crude protein level

10.3969/j.issn.1006-267x.2016.09.040

2016-03-15

江西省教育廳科技計劃項目(GJJ13280)；大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項目(201510410008)

廖春華(1992—)，男，四川德陽人，碩士研究生，從事養(yǎng)蜂學(xué)研究工作。E-mail: 398376812@qq.com

吳小波，副教授，碩士生導(dǎo)師，E-mail: wuxiaobo21@163.com

S896.3

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1006-267X(2016)09-2998-07