謝 景，孟 欣，王燕燕，何小飛，鄭 珊

（1.貴陽(yáng)市護(hù)理職業(yè)學(xué)院醫(yī)學(xué)類(lèi)基礎(chǔ)部，貴陽(yáng) 550003；2.貴陽(yáng)市金陽(yáng)醫(yī)院，貴陽(yáng) 550081）

5-氮雜-2’-脫氧胞苷對(duì)Molt-4細(xì)胞RASSF10基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)的影響研究

謝 景1，孟 欣2，王燕燕1，何小飛1，鄭 珊1

（1.貴陽(yáng)市護(hù)理職業(yè)學(xué)院醫(yī)學(xué)類(lèi)基礎(chǔ)部，貴陽(yáng) 550003；2.貴陽(yáng)市金陽(yáng)醫(yī)院，貴陽(yáng) 550081）

目的：Molt-4細(xì)胞應(yīng)用5-氮雜-2’-脫氧胞苷進(jìn)行處理，并觀察期對(duì)Molt-4細(xì)胞RASSF10基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)的影響。方法：于體外進(jìn)行Molt-4細(xì)胞培養(yǎng)，并采用不同濃度5-氮雜-2’-脫氧胞苷處理。然后采用MTT法檢測(cè)性別增殖抑制率，同時(shí)采用RT-PCR法檢測(cè)RASSF10 mRNA表達(dá)情況。采用COBRA檢測(cè)RASSF10甲基化水平；Westernblot法檢測(cè)RASSF10蛋白表達(dá)情況。結(jié)果：經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，采用一定濃度5-氮雜-2’-脫氧胞苷作用于Molt-4細(xì)胞后，細(xì)胞增殖抑制率明顯升高；且表現(xiàn)為劑量依賴(lài)性和時(shí)間性。然對(duì)照組Molt-4細(xì)胞R中未檢測(cè)出RASSF10 mRNA、蛋白表達(dá)情況。然經(jīng)5-氮雜-2’-脫氧胞苷處理后，RASSF10基因出現(xiàn)部分甲基化。結(jié)論：臨床應(yīng)用5-氮雜-2’-脫氧胞苷處理Molt-4細(xì)胞，其可經(jīng)對(duì)RASSF10基因去甲基化來(lái)恢復(fù)RASSF10表達(dá)，最終達(dá)到抑制Molt-4細(xì)胞增殖效果。

5-氮雜-2’-脫氧胞苷；Molt-4細(xì)胞；甲基化

DNA甲基化異常是一種表觀遺傳學(xué)現(xiàn)象，同時(shí)也是細(xì)胞癌變過(guò)程中的早期及頻發(fā)事件，此外，其還是一個(gè)可逆性的生物學(xué)過(guò)程［1］。因此，臨床可將甲基化特異基因來(lái)作為診斷及治療腫瘤疾病的分子標(biāo)志。并對(duì)特異基因?qū)嵤┘谆幚砗罂蛇_(dá)到治療腫瘤效果。RASSF10為RASSF家族成員，據(jù)相關(guān)報(bào)道稱(chēng)［2］，RASSF10啟動(dòng)子甲基化頻繁出現(xiàn)于前列腺癌及甲狀腺癌等腫瘤中。本次為研究5-氮雜-2’-脫氧胞苷對(duì)Molt-4細(xì)胞RASSF10基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)的影響，特進(jìn)行以下研究。

1 資料與方法

1 一般資料 試劑：5-氮雜-2’-脫氧胞苷由Sigma公司生產(chǎn)；RPMI1640培養(yǎng)基由Hyclone公司提供；RNA提取及RT-PCR試劑盒（TAKARA 公司）?；蚪MDNA提取試劑盒（Qiagen公司）、DNA甲基化試劑盒（Millipore公司）、DNAmarker及引物（上海生工公司）、RASSF10多克隆抗體（Abgent公司）。

1.2 方法 細(xì)胞培養(yǎng)：將Molt-4細(xì)胞放置于含有10%的胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)液中，然后置于溫度37℃、5%CO2孵箱中進(jìn)行培養(yǎng)。采用倒置顯微鏡對(duì)其生長(zhǎng)情況進(jìn)行觀察。

四唑鹽比色法（MTT）：選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于檢測(cè)，然后將藥物濃度調(diào)整為1×105/mL并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理，接種于96孔板上［3］。然后使用5-氮雜-2’-脫氧胞苷對(duì)其進(jìn)行作用24h、48h、72h后取出，然后于每孔中加入5g/LMTT150ul，并放置于溫度為37℃孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)，時(shí)間為4h［4］。然后取出進(jìn)行離心處理，并取上清液，再加入DMSO150il，震蕩混勻后于酶標(biāo)儀570nm下進(jìn)行測(cè)定其吸光度（A），并計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率（%）=（A對(duì)照-A實(shí)驗(yàn)）/A對(duì)照×100.0%［5］。

逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）：采用5-氮雜-2’-脫氧胞苷作用72h后，Trizol提取總RNA，并使用紫外分光光度計(jì)對(duì)RNA純度進(jìn)行檢測(cè)［6］。

免疫印跡法（Western blot）：收集經(jīng)5-氮雜-2’-脫氧胞苷處理72 h后Molt-4細(xì)胞的總蛋白，按100ug/孔上樣［7］。10% SDS-PAGE 電泳后轉(zhuǎn)膜至NC膜上［8］。5%脫脂牛奶封閉1 h，封I抗RASSF10（1∶500）4℃過(guò)夜［9］。次日TBST、TBS洗膜。封HRP標(biāo)記的羊抗兔II抗（1∶2000）45 min，同法洗膜［10］。ECL化學(xué)發(fā)光，將膜置于暗盒中，暗室內(nèi)膠片曝光，沖洗膠片［11］。

亞硫酸氫鈉聯(lián)合限制性?xún)?nèi)切酶分析法（COBRA）：取對(duì)照組、10umol/L經(jīng)5-氮雜-2’-脫氧胞苷處理72 h后的Molt-4細(xì)胞［12］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS20.0軟件統(tǒng)計(jì)與分析，采用t、卡方檢驗(yàn)。結(jié)果以P＜0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 5-氮雜-2’-脫氧胞苷對(duì)Molt-4細(xì)胞增殖影響

Molt-4細(xì)胞經(jīng)不同濃度5-氮雜-2’-脫氧胞苷處理后，其增殖抑制率明顯低于藥物處理組（P＜0.05）；且不同濃度組間比較（P＜0.05）。由此而說(shuō)明5-氮雜-2’-脫氧胞苷對(duì)Molt-4細(xì)胞增殖有一定抑制作用，且表現(xiàn)為劑量依賴(lài)性及時(shí)間性。

2.2 5-氮雜-2’-脫氧胞苷對(duì)RASSF10 蛋白表達(dá)

影響 對(duì)照組細(xì)胞中并無(wú)RASSF10表達(dá)；經(jīng)5-氮雜-2’-脫氧胞苷處理后，各組RASSF10蛋白表達(dá)量出現(xiàn)明顯上調(diào)，且與5-氮雜-2’-脫氧胞苷濃度有關(guān)（P＜0.05）。比較對(duì)照組與5-氮雜-2’-脫氧胞苷各濃度組細(xì)胞的內(nèi)參GAPDH表達(dá)量（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 5-氮雜-2’-脫氧胞苷對(duì)RASSF10 蛋白表達(dá)影響

2.3 5-氮雜-2’-脫氧胞苷對(duì)RASSF10 mRNA表達(dá)影響 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示，RASSF10 mRNA于對(duì)照組Molt-4細(xì)胞中不表達(dá)，但經(jīng)2.5 μmol/L、5.0 μmol/L、10.0 μmol/L5-氮雜-2’-脫氧胞苷處理后，其重新表達(dá)，且其表達(dá)強(qiáng)度與5-氮雜-2’-脫氧胞苷濃度呈正比（P＜0.05）。RASSF10相對(duì)表達(dá)量采用ARASSF10/ AGAPDH表示。如表2。

表2 5-氮雜-2’-脫氧胞苷對(duì)RASSF10 mRNA表達(dá)影響

2.3 5-氮雜-2’-脫氧胞苷對(duì)RASSF10基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)影響 經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，采用Molt-4細(xì)胞被處理前后，其RASSF10基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化狀態(tài)如圖4。對(duì)照組消化的DNA條帶較為明顯，因此而說(shuō)明對(duì)照組存在啟動(dòng)子甲基化現(xiàn)象。采用PCR擴(kuò)增后，含有TaqI識(shí)別位點(diǎn)可被TaqI消化水解，并出現(xiàn)水解條帶。但經(jīng)10 μmol/L5-氮雜-2’-脫氧胞苷作用72 h后則可見(jiàn)清晰且未被TaqI消化水解的條帶，消化水解的DNA條帶不明顯；因此而說(shuō)明啟動(dòng)子存在甲基化與非甲基化共存的情況，且原有甲基化RASSF10基因啟動(dòng)子區(qū)域可大部分被去甲基化。

3 討論

本次研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度所處理后的Molt-4細(xì)胞增殖抑制程度存在明顯差異性，因此說(shuō)明5-氮雜-2’-脫氧胞苷可有效抑制白血病細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)。本次研究為降低5-氮雜-2’-脫氧胞苷自身對(duì)本次研究細(xì)胞所產(chǎn)生的毒性作用而導(dǎo)致研究結(jié)果受到影響，所以選擇濃度較小的5-氮雜-2’-脫氧胞苷處理Molt-4細(xì)胞。對(duì)照組Molt-4細(xì)胞中RASSF10基因啟動(dòng)子是被甲基化修飾的，而RASSF10 mRNA、蛋白在Molt-4細(xì)胞中不表達(dá)。但經(jīng)采用510 umol/L-氮雜-2’-脫氧胞苷處理后，RASSF10基因啟動(dòng)子部分發(fā)生去甲基化作用，其RASSF10 mRNA及蛋白重新出現(xiàn)表達(dá)。因此而說(shuō)明抑癌基因RASSF10失表達(dá)的主要機(jī)制為RASSF10基因啟動(dòng)子的高度甲基化修飾。5-氮雜-2’-脫氧胞苷主要是通過(guò)抑癌基因RASS F10基因發(fā)生去甲基化，最終使得RASSF10重新恢復(fù)表達(dá)，并發(fā)揮其抗白血病作用。

綜上所述，5-氮雜-2’-脫氧胞苷可降低Molt-4細(xì)胞RASSF10基因的甲基化程度，同時(shí)可誘導(dǎo)其重新表達(dá)，進(jìn)而有效抑制Molt-4細(xì)胞增殖。

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5-aza-2'-deoxycytidine Impact on Molt-4 cells RASSF10 gene promoter methylation status

Xie Jing1， Meng Xin2， Wang Yan-yan1， He Xiao-fei1， Zheng Shan1
（1.Guiyang City Career Academy Department of Medicine Basic Nursing ，Guiyang 550003， China； 2.Department of Nnternal Medicine， Jinyang Hospital of Guiyang City， Guiyang 550081， China）

Objective Discussion and Analysis of 5-aza-2’-deoxycytidine impact on Molt-4 cells RASSF10 gene promoter methylation status. Methods Molt-4 cells were cultured in vitro and the use of different concentrations of 5-aza-2’-deoxycytidine treatment. Then using the MTT assay gender proliferation inhibition rate， while using RT-PCR assay RASSF10 mRNA expression. COBRA detection RASSF10 using methylation level； Westernblot RASSF10 protein expression was detected. Results After testing found that the use of certain concentration 5-aza-2’-deoxycytidine acting on the Molt-4 cells，cell proliferation was significantly increased ； and showed a dose-dependent and time-sensitive. However， Molt-4 cells in the control group was not detected in the R RASSF10 mRNA， protein expression. However， by 5-aza-2’-deoxycytidine treatment after， RASSF10 appear partially methylated genes. Conclusion Clinical application of 5-aza-2’-deoxycytidine treated Molt-4 cells， which may be of RASSF10 gene demethylation to restore RASSF10 expression， and ultimately achieve the effect of inhibiting the proliferation of Molt-4 cells.

5-aza-2’-deoxycytidine； Molt-4 cells； Methylation

R256.1

A

1673-016X（2016）01-0008-03

2015-02-02

謝景，E-mail: dftttr@163.com