王小玉,孫復(fù)錢,曾國(guó)屏,劉昕昕,喻繼文

(江西省科學(xué)院應(yīng)用化學(xué)研究所，江西南昌 360102)

氯霉素類抗生素(Chloramphenicols，CAPs)是一種在委內(nèi)瑞拉鏈霉菌(Streptomyces Venezuela)中分離提取的廣譜抗生素。CAP已經(jīng)廣泛應(yīng)用于治療和預(yù)防家禽、家畜及水產(chǎn)品的疾病。然而長(zhǎng)期使用可引起再生性障礙性貧血和其他惡性血液病。許多國(guó)家嚴(yán)格禁止將CAP用于食品動(dòng)物(特別是蛋雞和奶牛)中，規(guī)定CAP的最大殘留限量為0～10 ng/g。歐盟、美國(guó)等均在法規(guī)中規(guī)定CAP殘留限量標(biāo)準(zhǔn)為“零容許量”[1,2]，即不得檢出。我國(guó)也已經(jīng)禁止將CAP及其鹽、酯用于食品動(dòng)物。任何水產(chǎn)品、畜禽產(chǎn)品中CAP都是必檢項(xiàng)目。因此建立靈敏度高、選擇性好、簡(jiǎn)便易行的動(dòng)物源性食品CAP殘留的檢測(cè)方法是非常有必要的。目前動(dòng)物源性食品中CAP的殘留分析方法主要有酶免疫分析法[3]、微生物法[4]、高效液相色譜(HPLC)和氣相色譜(GC)法[5 - 7]。由于實(shí)際樣品基質(zhì)成分復(fù)雜，且污染物濃度在ng·g-1或 μg·g-1數(shù)量級(jí)，樣品前處理方法常用液-液萃取和固相萃取(Solid Phase Extraction,SPE)[8]。分子印跡聚合物(Molecularly Imprinted Polymers,MIPs)是一類對(duì)特定物質(zhì)具有特異性吸附的分離材料[8 - 11]。MIPs具有制備簡(jiǎn)單，選擇性好，抗惡劣環(huán)境能力強(qiáng)，穩(wěn)定性高和可重復(fù)使用等優(yōu)點(diǎn)，作為特異性固相吸附劑在復(fù)雜基質(zhì)樣品前處理領(lǐng)域得到廣泛關(guān)注。

雖然已有CAP分子印跡聚合物應(yīng)用的報(bào)道[12 - 14]，但大多數(shù)MIPs采用傳統(tǒng)本體分子印跡方法，存在識(shí)別位點(diǎn)不均一，傳質(zhì)阻力大，選擇性差，動(dòng)力學(xué)平衡慢等缺點(diǎn)。本工作以多壁碳納米管(MWCNTs)為載體，采用溶膠-凝膠的方法先在MWCNTs表面包覆硅層，得到MWCNTs@SiO2，再以氯霉素CAP為模板，采用表面分子印跡技術(shù)制備具有核殼結(jié)構(gòu)的CAP分子印跡聚合物包覆的碳納米管復(fù)合材料(MWCNTs@CAP-MIPs)。將MWCNTs@CAP-MIPs作為選擇性吸附劑，實(shí)現(xiàn)了對(duì)雞蛋樣品中痕量CAP的富集和檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

熱重(TG)分析儀(德國(guó)，Netzsch TG 209)；TecnaiG2 T2透射電子顯微鏡(TEM)(荷蘭，飛利浦公司)；AVATAR 360傅立葉變換紅外(FT-IR)光譜儀(美國(guó)，Nicolet公司)；UV-2450型紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本，島津公司)；LC-20AT高效液相色譜(日本，島津公司)。CAP的色譜測(cè)定條件:使用Shimadzu VP-ODS C18色譜柱(150×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相條件為色譜純甲醇-水(50∶50，V/V)；流速為1.0 mL/min；紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)為278 nm；進(jìn)樣體積為100 μL。

氯霉素(CAP，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)；碳納米管購(gòu)于深圳納米技術(shù)有限公司(直徑：60～100 nm，長(zhǎng)度：5～15 μm)；四乙氧基硅烷(TEOS)，苯基三甲氧基硅烷(PTMOS)，氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)均購(gòu)于Alfa Aesar；十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)；HNO3(天津市化學(xué)試劑五廠)；甲醇，無(wú)水乙醇，冰乙酸，乙腈，色譜純甲醇均購(gòu)于天津市康科德科技有限公司；氨水(25%)(天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠)；其它試劑均為分析純。所有的實(shí)驗(yàn)用水均為高純水。

1.2 碳納米管-氯霉素分子印跡聚合物的合成

采用HNO3氧化法對(duì)多壁碳納米管(MWCNTs)進(jìn)行純化預(yù)處理。參照Gao等[15]的方法，在表面活性劑CTAB存在下，硅烷試劑APTES水解制備SiO2包覆的碳納米管(MWCNTs@SiO2)。再以CAP為模板，無(wú)水乙醇為溶劑，APTES和PTMOS為功能單體，TEOS為交聯(lián)劑，用溶膠-凝膠法制備碳納米管-氯霉素分子印跡聚合物MWCNTs@CAP-MIPs。具體制備過(guò)程如下：稱取一定量的CAP(1.25 mmol) 溶于10 mL乙醇，然后加入功能單體APTES(2.5 mmol)和PTMOS(2.5 mmol)，攪拌0.5 h后加入2 mL TEOS，繼續(xù)攪拌10 min使溶液混合均勻后，向上述溶液加入200 mg MWCNTs@SiO2和1 mL 1 mol/L HAc，常溫下攪拌12 h。反應(yīng)后的產(chǎn)物先用無(wú)水乙醇洗滌三次，干燥。然后用洗脫液甲醇-乙酸(9∶1,V/V)洗脫聚合物中的模板分子，直至洗滌液在275 nm處無(wú)紫外吸收。用甲醇洗滌印跡聚合物三次以除去殘留的乙酸，最后60 ℃下真空干燥至恒重，即得到印跡聚合物MWCNTs@CAP-MIPs。非印跡聚合物MWCNTs@SiO2-NIPs的合成除不加入模板分子CAP外，其它步驟相同。

1.3 MWCNTs@CAP-MIPs的吸附性能

動(dòng)力學(xué)吸附性能實(shí)驗(yàn)：分別稱取MWCNTs@CAP2-NIPs 50 mg，置于不同離心管中，然后向每個(gè)離心管中加入10 mL 20 mg/L的CAP的乙腈溶液，室溫下振蕩。每隔一段時(shí)間(5、10、15、……60 min)后，取100 μL吸附后的上清液，利用高效液相色譜法測(cè)定溶液中CAP的濃度，直到吸附后的溶液濃度值基本無(wú)變化為止。

等溫吸附實(shí)驗(yàn)：分別稱取若干份50 mg CAP分子印跡聚合物及非印跡聚合物，置于10 mL的離心管中，然后分別加入3 mL不同濃度的氯霉素的乙腈溶液。室溫下振蕩2 h，離心，取其上清液，利用高效液相色譜法測(cè)定吸附后溶液中氯霉素的濃度。

1.4 MWCNTs@CAP-MIPs應(yīng)用于雞蛋樣品中CAP的富集

對(duì)市場(chǎng)上購(gòu)買的雞蛋樣品參照Sun等[16]的方法進(jìn)行前處理。首先將雞蛋樣品制成勻漿，稱取3份雞蛋樣品，每份5.0 g，置于50 mL離心管中。將CAP分別以5.0、10.0、30.0 μg/kg的添加水平加入到雞蛋樣品中，然后加入20 mL乙醇-水(6∶4,V/V)溶液，在振蕩器上振蕩1 h，離心，將上清液轉(zhuǎn)入另一離心管中。再重復(fù)提取兩次。合并三次提取的上清液，吹干濃縮后，用乙腈定容至50 mL。將30 mg MWCNTs-@CAP-MIPs加入到上述乙腈定容液中，室溫下振蕩1 h后，離心，棄去上層清液，用甲醇-乙酸((9∶1,V/V)洗脫吸附在MWCNTs@CAP-MIPs上的CAP，用氮吹儀吹干后，流動(dòng)相定容，再用高效液相色譜法測(cè)定吸附后溶液中CAP的濃度。每個(gè)添加水平平行測(cè)3次。

2 結(jié)果與討論

2.1 MWCNTs@CAP-MIPs的表征

2.1.1透射電鏡表征圖1為MWCNTs、MWCNTs@SiO2和MWCNTs@CAP-MIPs的透射電鏡(TEM)圖。由圖1可見(jiàn)，MWCNTs的直徑約為70～80 nm，硅烷試劑APTES水解后,在MWCNTs表面均勻地包覆了一層SiO2，MWCNTs@SiO2的TEM表明MWCNTs表面包覆層SiO2的厚度約為10 nm，相應(yīng)粒徑增加到約80～90 nm，再經(jīng)過(guò)溶膠-凝膠反應(yīng),聚合物層厚度明顯增加，說(shuō)明在MWCNTs@SiO2表面包覆了CAP分子印跡層，TEM圖像表明已成功制備了MWCNTs@CAP-MIPs，分子印跡層厚度大約為15 nm。

2.1.2紅外光譜表征分別取一定量MWCNTs、MWCNTs@SiO2和MWCNTs@CAP-MIPs，采用KBr壓片法，利用FI-IR光譜對(duì)其進(jìn)行表征。從圖2中可以看出，經(jīng)過(guò)純化的MWCNTs表面含有羧基，在3 420 cm-1出現(xiàn)羥基特征吸收峰，且在1 630 cm-1處有-C=O的振動(dòng)峰；MWCNTs@SiO2在1 070 cm-1處出現(xiàn)Si-O的伸縮振動(dòng)特征吸收峰，說(shuō)明在納米管表面已經(jīng)包上一層SiO2；而MWCNTs@CAP-MIPs 在1 431 cm-1和1 560 cm-1出現(xiàn)NH2的特征吸收峰，在699 cm-1出現(xiàn)一處苯環(huán)的特征吸收峰，且Si-O的伸縮振動(dòng)峰進(jìn)一步增強(qiáng)，充分證明了在MWCNTs@SiO2表面接枝上了功能單體，紅外數(shù)據(jù)證實(shí)了對(duì)MWCNTs的每一步修飾過(guò)程都是成功的。

2.1.3熱重分析熱重分析可以對(duì)每步反應(yīng)的修飾含量加以表征與量化。圖3為MWCNTs(a)、MWCNTs@SiO2(b)、MWCNTs@CAP-MIPs(c)的TG圖，從圖3曲線a可以看出，從0～200 ℃，隨著溫度的上升，碳納米管吸附的水分子失去，繼續(xù)加熱到400 ℃，碳納米管中的雜質(zhì)組分會(huì)不斷地分解，失去約4%重量，而在400～580 ℃組分則相對(duì)穩(wěn)定，其含量基本保持不變，隨著溫度升高到580 ℃以上，碳納米管開始分解，至700 ℃幾乎分解完全。圖3曲線b是MWCNTs@SiO2的熱分解曲線，碳納米管包覆一層SiO2后，在200～580 ℃失重約10%，則其損失來(lái)自于修飾的硅層部分。圖3曲線c是MWCNTs@CAP-MIPs的熱分解曲線，前面曲線的下降與曲線b類似，但由于MWCNTs@CAP-MIPs 表面接枝了兩種不同的硅烷試劑，在200～580 ℃區(qū)間硅層的失重更多，約占總重量的12.5%，碳納米管升高到580 ℃以上分解完全。TG分析的結(jié)果與TEM的分析結(jié)果相一致，MWCNTs@CAP-MIPs表面包覆上了硅層和分子印跡聚合物層。

2.2 MWCNTs@CAP-MIPs對(duì)氯霉素吸附性能的研究

對(duì)MWCNTs@CAP-MIPs進(jìn)行了動(dòng)力學(xué)吸附考察。從圖4a中可以看出，碳納米管印跡聚合物對(duì)模板分子CAP的吸附容量在前20 min增加較快，30 min時(shí)基本上已達(dá)到吸附平衡。相比于傳統(tǒng)的本體聚合制備的CAP-MIPs吸附平衡時(shí)間(12～24 h)，本工作所制備的MWCNTs@CAP-MIPs具有優(yōu)秀的傳質(zhì)特性，印跡層厚約15 nm，印跡位點(diǎn)都在印跡薄層中，保證了較高吸附量的同時(shí)，又保證了吸附速率。

MWCNTs@CAP-MIPs和MWCNTs@SiO2-NIP的熱力學(xué)吸附結(jié)果如圖4b所示。MWCNTs@-CAP-MIPs吸附容量隨CAP溶液濃度增大而迅速增大，而MWCNTs@SiO2-NIPs對(duì)模板分子的吸附容量變化很小。MWCNTs@CAP-MIPs和MWCNTs@SiO2-NIP吸附平衡濃度在20 mg/L左右達(dá)到平衡。從圖4b中可見(jiàn)，對(duì)于同一濃度的CAP溶液，印跡材料吸附容量明顯高于非印跡材料，前者飽和吸附容量是后者的4.2倍左右。造成這種吸附差異性的原因，這是因?yàn)镸WCNTs@CAP-MIPs存在較多記憶型的識(shí)別孔穴，表現(xiàn)出更高的吸附容量。

印跡聚合物對(duì)模板分子的識(shí)別選擇性用印跡因子(IF)來(lái)評(píng)價(jià)，印跡因子定義為印跡聚合物和非印跡聚合物對(duì)模板分子氯霉素的飽和吸附量之比值(QMIP/QNIP)，氯霉素印跡聚合物的印跡因子IF為4.2，說(shuō)明印跡聚合物對(duì)模板分子具有較好的選擇性。我們進(jìn)一步用Langmuir方程來(lái)表征MWCNTs@CAP-MIPs對(duì)模板分子CAP的吸附性能，Langmuir等溫吸附方程如下：

ce/Q=ce/Qmax+ 1/(KDQmax)

(1)

其中,ce(mg/L) 為分子印跡聚合物達(dá)到吸附平衡時(shí)溶液中模板分子CAP的濃度;Q(mg/g)為達(dá)到吸附平衡時(shí)分子印跡聚合物對(duì)CAP吸附容量，Qmax(mg/g)代表MWCNTs@CAP-MIPs的最大表觀吸附容量，KD為解離常數(shù)。根據(jù)上述方程，通過(guò)ce/Q對(duì)ce做圖，擬合得到一條直線(圖4c)，擬合得到的線性方程為：ce/Q=1.037ce+9.956(r2=0.9818)，由直線斜率和截距可計(jì)算出Qmax=0.9643 mg/g，KD=0.1042 L/mg。

2.3 MWCNTs@CAP-MIPs的重復(fù)使用性能

為了考察MWCNTs@CAP-MIPs的重復(fù)利用性能，對(duì)其進(jìn)行了吸附-解吸實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，MWCNTs@CAP-MIPs的吸附容量在前三次吸附-解吸循環(huán)中，都會(huì)比前一次有一定下降，但在第三次吸附-解吸循環(huán)后，MWCNTs@CAP-MIPs的吸附容量比第一次降低約15%。這可能是由于在前一次的吸附過(guò)程中部分模板分子被吸附在了印跡聚合物的內(nèi)部，占據(jù)了一部分印跡位點(diǎn)，洗脫過(guò)程中無(wú)法將其洗脫下來(lái)，從而使得這部分識(shí)別位點(diǎn)不能再吸附新的模板分子，或者是在洗脫過(guò)程中印跡聚合物的部分結(jié)合位點(diǎn)的空間結(jié)構(gòu)遭到破環(huán)，這樣造成了聚合物吸附量的逐次降低。對(duì)同一印跡聚合物進(jìn)行了5次吸附-解吸的實(shí)驗(yàn)，第5次吸附容量與第一次吸附容量的比值約為82.0%，結(jié)果表明MWCNTs@CAP-MIPs可以多次重復(fù)使用。

2.4 MWCNTs@CAP-MIPs對(duì)雞蛋樣品中氯霉素的富集研究

將MWCNTs@CAP-MIPs材料作為選擇性吸附劑應(yīng)用于雞蛋樣品中CAP的富集，對(duì)富集后的MWCNTs@CAP-MIPs用甲醇-乙酸(9∶1,V/V)的溶液洗脫，收集洗脫液定容后用高效液相色譜法測(cè)定。對(duì)購(gòu)于超市的雞蛋樣品未檢測(cè)出CAP殘留。為了驗(yàn)證MWCNTs@CAP-MIPs結(jié)合HPLC法測(cè)定CAP的可靠性，在雞蛋樣品中分別添加5.0、10、30 μg/kg CAP標(biāo)準(zhǔn)溶液，用MWCNTs@CAP-MIPs富集樣品中CAP，其平均回收率分別為72.3%、81.6%和84.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于8.5%，回收率和準(zhǔn)確性均較好，結(jié)果表明MWCNTs@CAP-MIPs適用于復(fù)雜樣品中痕量CAP的富集和檢測(cè)。

3 結(jié)論

本文發(fā)展了一種以多壁碳納米管(MWCNTs)為載體，以氯霉素為模板，氨丙基三乙氧基硅烷和苯基三甲氧基硅烷為雙功能單體，四乙氧基硅烷為交聯(lián)劑，溶膠-凝膠法制備了核殼結(jié)構(gòu)的氯霉素分子印跡聚合物包覆的碳納米管復(fù)合材料MWCNTs@CAP-MIPs，并進(jìn)行了吸附性能研究，結(jié)果表明MWCNTs@-CAP-MIPs對(duì)模板分子具有高的吸附容量，響應(yīng)動(dòng)力學(xué)快，選擇識(shí)別性能良好，對(duì)雞蛋樣品中的氯霉素的回收率可達(dá)72.3%～84.1%，有望應(yīng)用于實(shí)際樣品中氯霉素殘留量的檢測(cè)分析。