李會英　李國興　崔佳　劉哲敏　杜寧　劉學(xué)聰　喬玉巧

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·論著·

黃芩苷對大鼠牙周炎牙齦組織中TNF-αmRNA和IL-6mRNA表達(dá)的影響

李會英李國興崔佳劉哲敏杜寧劉學(xué)聰喬玉巧

目的觀察黃芩苷對牙周炎大鼠牙齦組織中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)mRNA、白細(xì)胞介素-6(IL-6)mRNA表達(dá)的影響，探討黃芩苷治療牙周炎的治療機(jī)制。方法選用50只8周齡SD大鼠，隨機(jī)分成5組,每組10只，A組為正常對照組， B組為牙周炎組，C1、C2、C3組為黃芩苷治療組，B，C1，C2，C3組建立牙周炎模型，治療1周后處死，采用RT-PCR方法檢測TNF-αmRNA、IL-6mRNA在5組大鼠牙齦組織中的表達(dá)水平。結(jié)果牙周炎組大鼠牙齦組織中TNF-αmRNA、IL-6mRNA表達(dá)強(qiáng)度顯著高于正常對照組(P<0.05)，黃芩苷各治療組大鼠牙齦組織中TNF-αmRNA、IL-6mRNA表達(dá)強(qiáng)度均明顯低于牙周炎組(P<0.05)。結(jié)論黃芩苷可以降低牙周炎大鼠牙齦組織中TNF-αmRNA、IL-6mRNA的表達(dá)含量，并能改善大鼠牙周組織狀況。

黃芩苷；牙周炎；細(xì)胞因子；RT-PCR

牙周炎是累及牙周支持組織的炎癥性疾病，主要表現(xiàn)為牙齦慢性炎癥、牙槽骨吸收和牙周袋形成。研究發(fā)現(xiàn)牙周炎患者炎癥牙齦和齦溝液中TNF-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和IL-6(interleukin-6，IL-6)等炎癥細(xì)胞因子水平升高[1]，炎性細(xì)胞因子TNF-α和IL-6的主要功能是致炎作用,并能直接或間接地介導(dǎo)骨組織吸收。研究發(fā)現(xiàn)黃芩苷對牙周炎具有一定的治療效果[2],但其相關(guān)治療機(jī)制尚不清楚。本研究采用大腸桿菌脂多糖誘導(dǎo)建立大鼠牙周炎模型，通過局部牙齦注射黃芩苷對牙周炎大鼠進(jìn)行治療，利用RT-PCR技術(shù)，從mRNA水平檢測大鼠牙齦組織中TNF-αmRNA 和 IL-6 mRNA的表達(dá)水平,觀察大鼠牙周組織變化情況，探討黃芩苷局部治療牙周炎的作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物：SD大鼠50只，清潔級，8周齡，雄性，體重(220±20)g，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供(動物合格證號：1410084)。大鼠適應(yīng)環(huán)境1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。喂飼實(shí)驗(yàn)動物中心的標(biāo)準(zhǔn)動物飼料，自由攝取水和食物。

1.1.2主要藥品與儀器：大腸桿菌ATCC O55:B5的脂多糖 (美國，sigma公司)，黃芩苷(中國藥物生物制品檢定所)；總RNA提取試劑TRIzol Reagent(GIBCOBRL公司,美國)；逆轉(zhuǎn)錄試劑與PCR試劑SYBR?PrimeScript?RT-PCR Kit (TaKaRa公司，日本)；TNF-αand IL-6及GADPH引物(上海生工生物工程有限公司)；Kodak_1DDC_120電泳凝膠成像自動分析系統(tǒng)(Kodak公司,美國)；7500熒光定量PCR儀(AB公司；美國)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1溶液的配制：取2 mg黃芩苷溶于2 ml 0.9%氯化鈉溶液中，碳酸氫鈉調(diào)pH值至7.4，至黃芩苷完全溶解，成為1 mg/ml的儲存液，4℃保存?zhèn)溆?，試?yàn)時用0.9%氯化鈉溶液稀釋至所需濃度；取10 mg脂多糖(LPS)，用0.9%氯化鈉溶液稀釋至1 mg/ml的溶液。LPS的終末濃度為1 mg/ml，黃芩苷終末濃度為0.01、0.1、1.0 μg/ml。

1.2.2動物分組及牙周炎模型的建立：取SD大鼠50只,隨機(jī)分5組：對照組(A組)、牙周炎組 (B組)、黃芩苷治療組(C1、C2、C3組)，每組10只。除A組外,其余4組大鼠用10%水合氯醛(0.3 g/kg)腹腔注射麻醉成功后，選大鼠右上頜第1、2磨牙之間頰腭側(cè)齦溝底注射LPS(1 mg/ml)各0.2 ml，每天在同一部位重復(fù)1次，連續(xù)3天，1周后大鼠牙周炎模型建立。

1.2.3黃芩苷的局部治療：大鼠牙周炎模型建立后第2天開始用藥，A組不用藥，黃芩苷治療組(C1、C2、C3組)每天在大鼠右上頜第1、2磨牙之間頰腭側(cè)齦溝底分別注射0.01、0.1、1.0 μg/ml黃芩苷溶液各0.2 ml，B組注射等量0.9%氯化鈉溶液，均連續(xù)3 d，分籠飼養(yǎng)。用藥前、后分別觀察各組大鼠牙周組織、全身狀況、毛發(fā)、食欲及糞便情況。

1.2.4動物處死及標(biāo)本采集：用藥后第7天，采取頸椎脫臼法處死各組大鼠，5 min內(nèi)剪取大鼠右上頜第1、2磨牙、牙槽骨及牙周組織，0.9%氯化鈉溶液沖洗后置于10%甲醛固定、10%EDTA脫鈣、包埋，制作右上頜磨牙頰腭向石蠟切片，片厚5 μm，蘇木精-伊紅染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察牙槽骨吸收及牙周袋形成情況；另取右上頜第1、2磨牙頰腭側(cè)實(shí)驗(yàn)處新鮮牙齦組織放置于eppendorf管中，液氮驟冷后，-70℃冰箱保存，用于TNF-α mRNA 和 IL-6 mRNA的檢測。

1.2.5RT-PCR檢測大鼠牙齦組織中TNF-α mRNA 和 IL-6 mRNA的表達(dá)水平：①提取RNA 將牙齦標(biāo)本復(fù)融，取0.1 g，粉碎至勻漿狀，加入1 ml RNA裂解液吹打均勻，加入200 μl氯仿混勻，13 000 r/min 4℃離心15 min。取上清液加入500 μl異戊醇-30℃放置12 h，離心同上。棄上清液，加75%乙醇200 μl洗滌，再次離心同上，棄上清液得白色沉淀，加入50 μl聚碳酸二乙酯(diethlpyrocarbonate，DEPC)，置-20℃冰箱備用。采用紫外分光光度計(jì)測定RNA純度。②逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 分別取1 μl TNF-α mRNA、 IL-6 mRNA，2×緩沖液(buffer)5 μl，2 mmol/L MgSO42 μl，10 mmol/L脫氧核苷三磷酸(dNTPs )0.5 μl，40 U/μl RNA酶抑制劑(RNase Inhibitor)0.25 μl，逆轉(zhuǎn)錄酶(Bca Best polymerase)0.5 μl，寡脫氧胸苷酸(OligodT)0.5 μl，以雙蒸水補(bǔ)足反應(yīng)體積至10 μl，操作嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。③PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系為20 μl，其中包括SYBR?Premix Ex TaqTM(2×)10 μl，Rox Reference DyeⅡ(50×) 0.4 μl，上下游引物(10 μM)各0.4 μl，cDNA模板2 μl及d H2O 6.8 μl。置于7500 real-time PCR儀上，兩步法PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)椋旱谝徊?預(yù)變性：95℃ 30 s；第二步 PCR反應(yīng)：95℃ 5 s，60℃ 1 min，40個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。以 GAPDH 作為內(nèi)參照，所用引物序列如下。見表1。

表1　基因引物的堿基序列

2　結(jié)果

2.1實(shí)驗(yàn)動物的一般情況A組大鼠牙齦組織無紅腫充血及牙周袋形成，體重逐漸增加，毛澤光亮，神態(tài)、活動、進(jìn)食水、大便均正常。B、C1、C2、C3組大鼠于注射LPS后第2天出現(xiàn)牙齦組織紅腫，神態(tài)倦怠、活動笨拙、皮毛疏松無光澤、進(jìn)食水減少、大便干燥等癥狀，隨著注射LPS次數(shù)的增加，上述癥狀逐漸加重；B組注射0.9%氯化鈉溶液后牙齦組織仍然紅腫，牙周袋形成，探診深度4～5 mm，神態(tài)倦怠、活動笨拙、皮毛無光澤、進(jìn)食水下降、大便干燥等癥狀無明顯改善，而C1、C2、C3組隨著注射黃芩苷治療時間的增加，上述癥狀逐漸改善，用藥3天后，牙齦組織紅腫充血減輕，牙周袋探診深度3～4 mm，神態(tài)趨于正常，皮毛光澤改善，進(jìn)食及活動增多，大便偶有干燥，并且C3組效果最明顯。

2.2牙周組織病理變化光鏡下可見，B組大鼠的牙齦上皮和皮下結(jié)締組織局部潰瘍、壞死，牙周膜纖維排列紊亂，牙周袋形成，牙槽嵴吸收明顯，表面呈蠶食狀，牙槽骨可見明顯的破骨細(xì)胞和骨吸收陷窩；C1、C2、C3組與B組比較，牙周組織表現(xiàn)為牙齦上皮和上皮下結(jié)締組織較完整，牙周膜主纖維束排列較整齊，牙周袋形成與牙槽嵴吸收較輕，炎性細(xì)胞逐漸減少，成纖維細(xì)胞增多，牙周間隙較正常，牙周膜及牙槽骨結(jié)構(gòu)趨于正常，牙周組織處于炎癥修復(fù)期；A組牙齦上皮和上皮下結(jié)締組織光滑完整，牙周膜纖維排列整齊，牙槽骨表面光滑，無明顯骨吸收、破骨細(xì)胞及骨吸收陷窩形成。見圖1。

A組 正常對照組　　　B組 牙周炎組　　　　　C1、C2、C3組 黃芩苷治療組

圖15組牙周組織形態(tài)(HE×10)

2.3黃芩苷對大鼠牙齦組織中TNF-αmRNA 、IL-6 mRNA表達(dá)水平的影響B(tài)組大鼠牙齦組織中TNF-αmRNA 和 IL-6 mRNA的表達(dá)水平明顯高于A組(P<0.05)；與B組比較,C1、C2、C3組大鼠牙齦組織中TNF-αmRNA 和 IL-6 mRNA的表達(dá)水平均明顯降低(P<0.05)，且C1、C2、C3組TNF-αmRNA 和 IL-6 mRNA表達(dá)水平依次逐漸下降(P<0.05)。B組大鼠牙齦組織中TNF-αmRNA 和 IL-6 mRNA表達(dá)強(qiáng)度明顯高于A組大鼠；局部應(yīng)用黃芩苷治療后1周后,C1、C2、C3組較牙周炎組大鼠牙齦組織中TNF-αmRNA 和 IL-6 mRNA的表達(dá)強(qiáng)度隨黃芩苷濃度增加依次明顯下降。見表2,圖2。

組別TNF-α(fold)IL-6(fold)A組32.34±4.6325.40±2.93B組87.33±5.38*68.27±0.33*C1組63.67±3.67*#55.39±4.41*#C2組51.75±6.00*#45.44±3.78*#C3組41.45±3.79*#36.33±4.04*# F值60.0670.27 P值5.91×10-72.79×10-7

注：與A組比較，*P<0.05;與B組比較，#P<0.05

3　討論

牙周炎是一種以骨破壞為主要特征的慢性細(xì)菌感染性疾病，發(fā)生在牙齒的支持組織，是由革蘭氏陰性(G-)厭氧菌、鞭毛菌、螺旋體等微生物引起的炎癥性疾病，其中G-厭氧菌及其內(nèi)毒素刺激可引起宿主局部免疫細(xì)胞反應(yīng),從而激活宿主防御細(xì)胞釋放TNF-α和 IL-6等多種炎癥細(xì)胞因子，這些炎癥細(xì)胞因子繼發(fā)引起牙齦組織炎癥、牙槽骨破壞和吸收等牙周組織損傷[2，3]。內(nèi)毒素是G-細(xì)菌細(xì)胞壁外膜中的脂多糖(LPS),是G-細(xì)菌細(xì)胞壁外膜所獨(dú)有的一種致病物質(zhì),對牙周組織具有很高的毒性。在不同微生物之間，LPS的化學(xué)組成有所不同，但其基本結(jié)構(gòu)相似。LPS的生物活性中心是類脂A，幾乎可介導(dǎo)所有LPS的生物學(xué)反應(yīng),并且類脂A在各種G-菌中的結(jié)構(gòu)和化學(xué)成分相似,無種屬特異性,因此不同種屬G-細(xì)菌的LPS引起的毒性作用基本相似[4]。根據(jù)amamurthy的參考文獻(xiàn)，采用大腸桿菌LPS誘導(dǎo)大鼠實(shí)驗(yàn)牙周炎模型, 已由SUNY Stony Brook動物用戶委員會認(rèn)可[3]。 LPS誘導(dǎo)的大鼠牙周炎模型,簡便、可比性強(qiáng),具有可重復(fù)性。本實(shí)驗(yàn)采用大腸桿菌LPS進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，連續(xù) 3 d 在大鼠右上頜磨牙同一部位的牙齦組織中注射LPS,1周后牙周袋形成,牙齦紅腫,探診出血。光鏡下,炎癥細(xì)胞聚集,破骨細(xì)胞浸潤,牙槽骨吸收。

在牙周炎發(fā)生發(fā)展過程中，牙周組織中單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、多形核白細(xì)胞、牙齦及牙周膜成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和成骨細(xì)胞等均可分泌TNF-α、IL-1、IL-6等炎癥細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子可以誘導(dǎo)白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子的上調(diào)，刺激趨化因子的產(chǎn)生和聚集；誘導(dǎo)其他可放大或維持炎癥反應(yīng)的介質(zhì)表達(dá)，例如前列腺素；刺激組織溶解酶產(chǎn)生，例如基質(zhì)金屬蛋白酶；提高細(xì)菌殺傷力和噬菌活性[5]。研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α誘導(dǎo)骨吸收的活性較強(qiáng)，通過刺激膠原酶介導(dǎo)組織破壞，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的前體細(xì)胞增生、分化，并間接作用于成熟的破骨細(xì)胞，造成牙槽骨的破壞和吸收，也是刺激前列腺素和蛋白酶產(chǎn)生的主要因子，在牙周組織破壞中起重要作用；IL-6是一種多效應(yīng)炎性細(xì)胞因子,細(xì)菌﹑病毒﹑寄生蟲﹑脂多糖等均可提高其基因表達(dá)，IL-6的生物功能較多，可誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞分化并分泌免疫球蛋白，促進(jìn)多種細(xì)胞如T淋巴細(xì)胞、造血干細(xì)胞等的增殖，抑制成纖維細(xì)胞的生長，參與骨吸收，有效地抑制IL-6的分泌和合成,對牙周炎的治療有重要意義[3,6]。有研究顯示在牙周炎患者的齦溝液和牙齦組織中可檢測到高水平的TNF-α、IL-6，其表達(dá)水平和牙周炎癥的嚴(yán)重程度明顯相關(guān)[7，8]。因此通過藥物抑制這些炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)水平對于抑制牙周炎癥反應(yīng)具有重要意義[9，10]。

研究表明，黃芩苷是中藥黃芩的主要有效成分，具有抑菌、清熱、抗變態(tài)反應(yīng)等多種作用，黃芩苷可通過清除LPS誘生的自由基,阻斷LPS破壞細(xì)胞生物膜系統(tǒng), 穩(wěn)定細(xì)胞膜,從而保護(hù)細(xì)胞表面,抑制牙周細(xì)胞分泌炎性細(xì)胞因子，并可抑制其發(fā)揮作用[11]。陳悅等[12]研究認(rèn)為黃芩苷抑制牙周炎和牙槽骨吸收的機(jī)理可能是通過巨噬細(xì)胞分泌 TGF-β，從而抑制T細(xì)胞的活性、增殖和數(shù)量，導(dǎo)致 T細(xì)胞產(chǎn)生的TNF-α等炎性因子減少，引起破骨細(xì)胞減少，從而抑制牙槽骨破骨細(xì)胞的生成，牙周炎癥狀減輕。羅志曉等[13]研究發(fā)現(xiàn)黃芩苷可阻止成纖維細(xì)胞和炎性細(xì)胞的相互作用，抑制炎性細(xì)胞因子以及金屬基質(zhì)蛋白酶等的合成和分泌，減少炎性細(xì)胞的聚集、滯留及牙槽骨的破壞，阻止牙周炎病程進(jìn)展。王國芳等[14]研究發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷、黃芩苷和大黃素聯(lián)合應(yīng)用對脂多糖誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性牙周炎牙槽骨吸收具有一定的抑制作用。有研究還發(fā)現(xiàn)黃芩苷在體外能顯著降解內(nèi)毒素[15],對LPS致鼠巨噬細(xì)胞過度釋放TNF-α有抑制作用[16]。

本實(shí)驗(yàn)通過牙齦局部注射LPS成功建立大鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎模型后，使用不同濃度黃芩苷牙齦局部注射治療大鼠牙周炎，觀察大鼠牙周組織變化狀況，采用RT-PCR法檢測大鼠牙齦組織中TNF-α mRNA 和 IL-6 mRNA表達(dá)水平的變化，從而探討黃芩苷治療牙周炎的療效與機(jī)制。結(jié)果顯示，與牙周炎組相比，局部注射黃芩苷后，各治療組大鼠牙齦組織充血腫脹減輕，牙周袋變淺，神態(tài)趨于正常，皮毛光澤改善，進(jìn)食及活動增多，體重逐漸增加，濃度為0.01 ～1.0 μg/ml黃芩苷均能抑制大鼠牙齦組織中TNF-α mRNA 和 IL-6 mRNA的表達(dá)，隨著黃芩苷濃度升高，TNF-α mRNA 和 IL-6 mRNA表達(dá)水平逐漸降低，不同濃度組間比較，抑制作用有顯著性差異(P<0.05)。因此本研究表明，黃芩苷可降低實(shí)驗(yàn)性牙周炎大鼠牙齦組織中TNF-α mRNA 和 IL-6 mRNA的表達(dá)水平，減輕機(jī)體炎性反應(yīng)，抑制牙槽骨吸收，提示臨床上局部應(yīng)用黃芩苷治療牙周炎，可能會減輕牙周炎的炎性反應(yīng)，抑制破骨細(xì)胞形成，促進(jìn)牙周病患者的康復(fù)，但是黃芩苷的確切作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

1Yavuzyilmaz E, Yamalik N, Bulut S, et al. The gingival crevicular fluid interleukin-1 beta and tumour necrosis factor-alpha levels in patientswith rapidly progressive periodontitis. Aust Dent J,1995,40:46-49.

2竇永青，李慶星，王瑤，等.黃芩苷局部應(yīng)用治療慢性牙周炎的療效觀察.實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志,2006,22: 728-729.

3Liavaneras M,Ramamurthy L,Heikkila R,et al. A combination of a chemically modified doxycycline and a bisphosphonate synergistically inhibits endotoxin-induced periodontal breakdown in rats.J Periodontol,2001,72:1069-1077.

4張鳳秋，吳織芬，萬玲.牙周優(yōu)勢菌內(nèi)毒素的生物學(xué)活性及與牙周炎相關(guān)的發(fā)病機(jī)制.牙體牙髓牙周病學(xué)雜志,2003,13:166-169.

5Pfizenmaier K，Wajant H，Grel M．Tumor necrosis factors in 1996．Cytokine Growth Facter Rev，1996，7：271-277．

6吳亞菲，趙川江，張靜儀，等. 牙齦溝液中白細(xì)胞介素-6含量與牙周炎關(guān)系的研究.華西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2000,31:494-496.

7Hoebe K, Jiang Z, Georgel P,et al. TLR signaling pathways:opportunities for activation and blockade in pursuit of therapy.Curr Pharm Des,2006,12: 4123-4134.

8袁林，趙云鳳，周偉東. 咬合力喪失影響大鼠牙周組織白細(xì)胞介素- 6變化的研究. 華西口腔醫(yī)學(xué)志,2000,18：367-368.

9Bartold PM, Haynes DR. Interleukin-6 production by human gingival fibroblasts. J PeriodontRes,1991,26: 339.

10Ionita MG，Arslan F，de Kleijn DP，et al． Endogenous inflammatory mol-ecules engage Toll-like receptors in cardiovascular disease.J In-nate Immun，2010,2: 307．

11馬愛團(tuán)，鐘秀會，孟立根，等.黃芩黃酮藥理研究概況.中國獸醫(yī)雜志,2006,42: 39-40.

12陳悅，吳織芬. 黃芩苷抑制牙周炎牙槽骨吸收的作用及機(jī)理研究.第四軍醫(yī)大學(xué),2008,4.

13羅志曉，李成章，曹正國. 黃芩苷對牙齦成纖維細(xì)胞和牙周膜細(xì)胞上ICAM-1 表達(dá)調(diào)節(jié)的研究.口腔醫(yī)學(xué)研究,2004,20:14-16.

14王國芳，吳織芬，王勤濤. 三種中藥提取物抑制牙周炎牙槽骨吸收的實(shí)驗(yàn)研究.臨床口腔醫(yī)學(xué)雜志,2005,21:321-323.

15竇永青，杜文力，薛毅，等.黃芩苷降解細(xì)菌內(nèi)毒素的定量分析測定.華西口腔醫(yī)學(xué)雜志,2007,25: 169-171.

16李敬，劉云海，陳新，等.黃芩中黃芩苷的抗內(nèi)毒素作用.醫(yī)藥導(dǎo)報,2006,25: 1237-1240.

Effects of baicalin on the expressions of TNF-αmRNA and IL-6mRNA in gingiva tissues of rat with periodontitis

LIHuiying,LIGuoxing,CUIJia,etal.

DepartmentofStomatology,HebeiProvincialChildren’sHospital,Shijiazhuang050031,China

ObjectiveTo observe the effects of baicalin on the expressions of tumor necrosis factor alpha (TNF-α) mRNA and interleukin-6 (IL-6) mRNA in gingiva tissues of rat with periodontitis in order to explore the action mechanism of baicalin in treatment of periodontitis.MethodsFifty SD rats (8-week age) were randomly divided into 5 groups:blank control group (group A), periodontitis group (group B), baicalin treatment groups including group C1,group C2,group C3,with 10 rats in each group.The animal models with periodontitis were established in group B,group C1,group C2 and group C3.All the rats were sacrificed after 7-day treatment,and the expression levels of TNF-αmRNA and IL-6 mRNA were detected by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) technique.ResultsThe expression levels of TNF-αmRNA and IL-6 mRNA in gingiva tissues of rats in group B were significantly higher than those in group A (P<0.05),moreover, the expression levels of TNF-αmRNA and IL-6 mRNA in group C1,group C2 and group C3 were significantly lower than those in group B (P<0.05).ConclusionThe baicalin can decrease the expression levels of TNF-αmRNA and IL-6 mRNA in gingiva tissues of rat with periodontitis, and can also improve the status of periodontal tissues.

baicalin；periodontitis；cytokines；reverse transcription polymerase chain reaction

10.3969/j.issn.1002-7386.2016.20.006

050031石家莊市,河北省兒童醫(yī)院口腔科

劉學(xué)聰，050031石家莊市，河北省兒童醫(yī)院口腔科；

E-mail: lgxlhy@163.com

R 781.42

A

1002-7386(2016)20-3068-04

2016-04-17)

項(xiàng)目來源：河北省中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥類科研計(jì)劃課題(編號:2013181)