康林芝，王 娜，秦 艷，唐惠奇，云 帆

(廣州市澳鍵豐澤生物科技有限公司，廣東廣州 510760)

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葡萄糖苷酶酶解香草蘭的工藝條件優(yōu)化研究

康林芝，王 娜，秦 艷，唐惠奇，云 帆*

(廣州市澳鍵豐澤生物科技有限公司，廣東廣州 510760)

[目的]優(yōu)化葡萄糖苷酶酶解香草蘭的工藝條件。[方法]以香草蘭為材料，研究葡萄糖苷酶酶解提取香蘭素的工藝。在單因素試驗的基礎上選取試驗因素與水平，設計3因素3水平的響應面分析法，依據回歸分析確定工藝條件的影響因素，以香蘭素含量為響應值作響應面分析試驗。[結果]葡萄糖苷酶酶解香草蘭的最佳工藝條件為：反應溫度 44 ℃，料液比1∶14 g/mL，加酶量16 U/g，香蘭素含量實際得率為17.80 mg/g。[結論]葡萄糖苷酶可水解香蘭素的前體物質，釋放出香草蘭中潛在的香氣成分，從而大幅度提高香氣成分含量。

葡萄糖苷酶；香草蘭； 香蘭素； 酶解

香草蘭原產墨西哥，是高級食用香料，有“食用香料之王”之稱，廣泛用于食品工業(yè)、煙、酒和高級化妝品[1-2]。香蘭素是香草蘭豆莢中最主要的生香物質，但剛成熟的香草蘭豆莢并不具有特征香氣，其豆莢經過生香加工后才具有濃郁的香味[3]。香草蘭豆莢加工過程中生香的原因主要是因為豆莢中的β-葡萄糖苷酶會催化香蘭素葡萄糖苷分解形成香蘭素和葡萄糖，生成的香蘭素賦予香草蘭香味。江明等[4]研究了香草蘭果莢內源β-葡萄糖苷酶在不同加工條件下的活性變化，結果表明，香草蘭在經過殺青及干燥處理后，β-葡萄糖苷酶的活性有所升高。但是香草蘭自身含有的葡萄糖苷酶非常有限，導致香草蘭的傳統(tǒng)生香周期長達1年，耗費大量的人力物力[5]。Ranadive[6]及浦帆等[7]在成熟香草蘭果莢中添加外源β-葡萄糖苷酶，研究發(fā)現豆莢中的香蘭素含量明顯提高，證明β-葡萄糖苷酶在香草蘭的生香過程中起著重要的作用，同時也證明了酶促生香的可行性。筆者采用響應面優(yōu)化了利用葡萄糖苷酶酶解香草蘭原料的工藝條件，為工業(yè)化高效生產純天然香蘭素奠定基礎。

1　材料與方法

1.1材料香草蘭，產地海南，海南興科興隆熱帶植物園開發(fā)有限公司。β- 葡萄糖苷酶：酶活力5.5 U/mg，上海Sigma試劑公司。標準產物香蘭素，分析純，購買于上海生物工程有限公司。

1.2方法

1.2.1香草蘭中香氣成分的提取方法。香草蘭豆莢低溫干燥、粉碎，取20 g粉末置于500 mL三角燒瓶中，然后在粉碎豆莢中加入20單位的葡萄糖苷酶，置于37 ℃恒溫水浴中反應18 h，之后進行熟化。取酶解后的樣品用95%的乙醇索式抽提16 h，提取物定容至100 mL，然后進行紫外分光光度測定。

1.2.2香蘭素含量的定量分析方法。利用紫外分光光度法分析酶促生香樣品中香蘭素的含量[8]。

1.2.2.1標準溶液的配制。稱取0.01 g香蘭素于10 mL容量瓶中，加無水乙醇溶解后定容至刻度，備用。其濃度為1.0 mg/mL。

1.2.2.2試樣液的制備。準確稱取試樣約0.01 g，制備方法與上述標準溶液的制備相同。取上述各溶液分別放入1 cm石英池中，在最大吸收波長約308 nm處測定吸光度，計算香蘭素含量。

1.2.3香草蘭的酶促生香研究[9]。根據酶促反應動力學可知，香草蘭酶促生香過程中各項影響酶促反應的參數均將影響酶促反應的速度與強度，從而影響香草蘭酶促生香的加工時間長短以及產品中香蘭素含量。酶促生香加工以產品中香蘭素含量為指標，對提取物進行紫外分光光度法測定分析。由于反應溫度、時間、 體系 pH等工藝參數是影響酶促反應的主要因素。因此，該試驗從加酶量、酶解溫度、酶解時間、料液比等方面研究β-葡萄糖苷酶的酶解作用對香草蘭中香蘭素含量的影響，并以傳統(tǒng)生香方法生香的香草蘭豆莢提取物作為對照。

1.2.3.1不同反應溫度對香草蘭酶促生香研究的影響。取殺青后的香草蘭豆莢50 g切碎至均勻大小，加入pH 5.0的磷酸鹽緩沖液200 mL進行勻漿。在勻漿液中加入20 U/g的β-葡萄糖苷酶，在35、40、45、50、55 ℃的酶解溫度下，攪拌酶解18 h后進行熟化。熟化完全的香草蘭豆莢利用“1.2.1”方法提取，對香蘭素進行紫外分光光度計測定分析。

1.2.3.2不同反應時間對香草蘭酶促生香研究的影響。取殺青后的香草蘭豆莢50 g切碎至均勻大小，加入pH 5.0的磷酸鹽緩沖液200 mL進行勻漿。在勻漿液中加入20 U/g的β-葡萄糖苷酶，在35 ℃的酶解溫度下，攪拌酶解4、12、18、24、32 h后進行熟化。熟化完全的香草蘭豆莢利用“1.2.1”方法提取，對香蘭素進行紫外分光光度計測定分析。

1.2.3.3不同料液比對香草蘭酶促生香研究的影響。取殺青后的香草蘭豆莢50 g切碎至均勻大小，加入pH 5.0的磷酸鹽緩沖液200、300、400、500、600、700 mL(料液比依次為1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14 g/mL)進行勻漿。在勻漿液中加入20 U/g的β-葡萄糖苷酶，在35 ℃的酶解溫度下，攪拌酶解18 h后進行熟化。熟化完全的香草蘭豆莢利用“1.2.1”方法提取，對香蘭素進行紫外分光光度計測定分析。

1.2.3.4不同加酶量對香草蘭酶促生香研究的影響。取殺青后的香草蘭豆莢50 g切碎至均勻大小，加入pH 5.0的磷酸鹽緩沖液200 mL進行勻漿。在勻漿液中加入15、20、25、30、35 U/g的β-葡萄糖苷酶，在35 ℃的酶解溫度下，攪拌酶解18 h后進行熟化。熟化完全的香草蘭豆莢利用“1.2.1”方法提取，對香蘭素進行紫外分光光度計測定分析。

1.2.4β-葡萄糖苷酶酶解香草蘭的工藝條件優(yōu)化。通過對加酶量、酶解溫度、酶解時間、料液比等方面進行了單因素試驗考察，采用響應面法在3因子3水平上對β-葡萄糖苷酶酶解香草蘭工藝條件進行優(yōu)化。選取酶解溫度、料液比和加酶量作為響應面試驗設計的分析因子，同樣條件下制備一個不加酶的空白對照樣，之后進行熟化，熟化完全的香草蘭豆莢以產品中香蘭素含量為指標對提取物進行分析。

2　結果與分析

2.1不同單因素對香蘭素含量的影響

2.1.1不同反應溫度對香蘭素含量的影響。在酶解溫度不同的條件下提取香蘭素，其他條件(料液比1∶12 g/mL，反應時間18 h，加酶量為20 U/g)相同，計算不同酶解溫度條件下香蘭素含量。

對50 g香草蘭豆莢進行酶解溫度的單因素試驗，分別測定各處理組中的香蘭素含量。由圖1可以看出，酶解溫度處于50 ℃時，提取的香蘭素相對含量達到最大值。在50 ℃之前，隨著溫度的升高，酶的水解效果不斷提高；但在50 ℃以后，香蘭素含量開始下降。因此，該試驗采用50 ℃的酶解溫度。

圖1　酶解溫度對香蘭素含量的影響Fig.1　Effects of enzymolysis temperature on the vanillin content

2.1.2不同反應時間對香蘭素含量的影響。在酶解時間不同的條件下提取香蘭素，其他條件(料液比1∶12 g/mL，反應溫度45 ℃，加酶量為20 U/g)相同，計算不同酶解時間條件下香蘭素含量。

對50 g香草蘭豆莢進行酶解時間的單因素試驗，分別測定各處理組中的香蘭素含量。由圖2可以看出，隨著酶解時間的不斷增加，香蘭素含量逐步增加，當酶解時間達到24 h時，提取的香蘭素相對含量達到最大值。但在24 h之后，香蘭素含量又隨著酶解時間的增加而降低，這是因為隨著時間的不斷延長，一些香氣成分揮發(fā)造成測到的香蘭素有所降低。因此，該試驗采用24 h為最佳酶解時間。

圖2　酶解時間對香蘭素含量的影響Fig.2　Effects of enzymolysis time on the vanillin content

2.1.3不同料液比對香蘭素含量的影響。在料液比不同的條件下提取香蘭素，其他條件(反應時間18 h，反應溫度45 ℃，加酶量為20 U/g)相同，計算不同料液比條件下香蘭素含量。

對50 g香草蘭豆莢進行料液比的單因素試驗，分別測定各處理組中的香蘭素含量。由圖3可以看出，隨著料液比中溶劑用量的提高，香蘭素含量逐步增加，當料液比為1∶12 g/mL時，提取的香蘭素相對含量達到最大值；料液比中溶劑用量繼續(xù)增加時，香蘭素含量沒有隨之增加。因此，該試驗采用1∶12 g/mL為最佳料液比。

圖3　料液比對香蘭素含量的影響Fig.3　Effects of solid-liquid ratio on the vanillin content

2.1.4不同加酶量對香蘭素含量的影響。在加酶量不同的條件下提取香蘭素，其他條件(反應時間18 h，反應溫度45 ℃，料液比1∶12 g/mL)相同，計算不同加酶量條件下香蘭素含量。

對50 g香草蘭豆莢進行加酶量的單因素試驗，分別測定各處理組中的香蘭素含量。由圖4可以看出，隨著加酶量的增加，香蘭素含量逐步增加，當加酶量為20 U/g時，提取的香蘭素相對含量達到最大值；加酶量繼續(xù)增加時，香蘭素含量沒有明顯增加。因此，該試驗采用20 U/g為最佳加酶量。

圖4　加酶量對香蘭素含量的影響Fig.4　Effects of enzyme volume on the vanillin content

2.2提取香蘭素工藝的響應面優(yōu)化試驗響應面分析法已經廣泛應用于食品工業(yè)、化工、生物技術等方面，其目的是在現有的試驗基礎上尋找到試驗范圍上的因素的最佳組合和響應值的最優(yōu)值，以確定最佳提取工藝參數[13]。

2.2.1響應面優(yōu)化試驗設計。根據單因素試驗對不同反應溫度、不同反應時間、不同料液比、加酶量進行綜合考慮，采用3因素3水平，根據Box-Behnken Design(BBD)設計法設計香蘭素提取的響應面試驗，試驗因素與水平設計見表1，共20個試驗點，設計方案所得的試驗結果見表2。

表1響應面3因素3水平試驗設計

Table 1Three factors and three levels test design of response surface analysis

2.2.2響應面試驗數學模型的建立。按照Design Expert 軟件中的Box-Behnken Design 模型對表2的數據進行多元回歸擬合，得到香蘭素含量對反應溫度(A)、料液比(B)、加酶量(C)的二次多項回歸模型為：Y=17.29-0.15A+0.3B+0.95C-0.53AB+0.076AC+0.4BC-1.78A2+0.36B2-2.33C2。對回歸模型進行方差分析，結果得出：FA=0.32，PA=0.586 4；FB=1.28，PB=0.284 1；FC=12.91，PC=0.004 9；FA2=12.54，PA2=0.005 3；FB2=0.52，PB2=0.487 6；FC2=21.50，PC2=0.000 9；FAB=3.26，PAB=0.101 3；FAC=0.067，PAC=0.800 9；FBC=1.88，PBC=0.200 2；F模型=11.73，P模型=0.000 3**；F失擬=4.04，P失擬=0.075 8。由此可以看出，模型顯著性水平P<0.01，表明二次方程模型達到極顯著水平；失擬項P=0.075 8>0.05，即模型差異不顯著，說明模型殘差均由隨機誤差引起。

表2　Box-Behnken設計方案及其響應值

綜合以上所述，說明模型擬合程度良好，試驗誤差小。因此，該模型可較好地描述各因素與響應值之間的真實關系，可利用模型來分析和預測制備香蘭素的工藝結果。

2.2.3響應面優(yōu)化與分析。利用Design Expert 7.1.6軟件，繪制各影響因素對香蘭素的響應曲面圖，分析酶解溫度(A)、料液比(B)、加酶量(C)對香蘭素含量的影響。響應曲面的坡度平緩說明隨著處理條件的變化，響應值的大小不受影響，但是，當曲面坡度陡峭時，則說明響應值對處理條件的改變非常敏感。

比較圖5、6、7可知，酶解溫度(A)、料液比(B)、加酶量(C)對香蘭素含量的影響極為顯著，表現為曲面較陡，其中加酶量對香蘭素含量的影響最大。

圖5　料液比與反應溫度對香蘭素含量的影響Fig.5　Effects solid-liquid ratio and reaction temperature on the vanillin content

圖6　加酶量與反應溫度對香蘭素含量的影響Fig.6　Effects enzyme volume and reaction temperature on the vanillin content

圖7　加酶量與料液比對香蘭素含量的影響Fig.7　Effects enzyme volume and solid-liquid ratio on the vanillin content

2.2.4優(yōu)化與驗證。由 SAS分析得到香蘭素提取的最佳工藝條件為：反應溫度 43.81 ℃，料液比1∶13.82 g/mL，加酶量16.3 U/g，此時的理論得率達到了18.188 1 mg/g。為了驗證響應面法的可靠性，采用得到的最佳提取工藝條件進行香蘭素提取的驗證試驗，同時考慮到實際生產操作的便利性，以反應溫度 44 ℃，料液比1∶14 g/mL，加酶量16 U/g為最佳。3次平行試驗得到的實際平均得率為17.80 mg/g，與理論值相差 0.02%。因此，通過響應面法優(yōu)化得到葡萄糖苷酶酶解香草蘭豆莢提取工藝條件是可行的，具有實際生產價值。

3　結論

通過響應面試驗優(yōu)化了葡萄糖苷酶對香草蘭進行酶解的工藝，葡萄糖苷酶酶解香草蘭的最佳工藝條件為：反應溫度 44 ℃，料液比1∶14 g/mL，加酶量16 U/g，此條件下香蘭素含量實際得率17.80 mg/g。結果表明，經葡萄糖苷酶處理后得到的香草蘭提取物，其中的香蘭素含量明顯提高，其香氣也更加濃郁，說明葡萄糖苷酶可以將香蘭素前體物質香蘭素葡萄糖苷分解形成香蘭素和葡萄糖，生成的香蘭素賦予香草蘭香味。

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Optimization of the Technology Condition of Vanilla Enzyme Digestion by Glycosidase

KANG Lin-zhi,WANG Na,QIN Yan,YUN Fan*et al

(Guangzhou Alchemy Biotechnology Co.,Ltd.,Guangzhou,Guangdong 510760)

[Objective]To optimize the technology condition of vanilla enzyme digestion by glycosidase.[Method]With vanilla as the material,we researched the extraction technology of vanillin by glycosidase enzymolysis.Test factor and level were selected based on single factor test.Response Surface Analysis was designed based on three factors and three levels.According to the regression analysis,influencing factor of technology condition was determined.With vanillin content as the response value,response surface analysis was carried out.[Result]The optimal technology condition of vanilla enzyme digestion by glycosidase was as follows: 44 ℃ reaction temperature,1∶14 g/mL solid-liquid ratio,and 16 U/g enzyme volume.Under this condition,the extraction rate of vanillin content was 17.80 mg/g.[Conclusion]Glycosidase can hydrolyse the precursor of vanillin,release the potential components of vanilla aroma,and greatly improve the aroma composition.

Glycosidase enzyme;Vanilla;Vanillin;Enzymolysis

康林芝(1988- )，女，山東菏澤人，工程師，博士，從事食品生物技術研究。*通訊作者，工程師，碩士，從事食品生物技術研究。

2016-06-29

S 573

A

0517-6611(2016)25-058-04