劉連新，劉郁，何偉平，田龍

（徐州工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院化學(xué)工程學(xué)院，江蘇徐州221140）

高效液相色譜法測(cè)定藍(lán)莓干中的原花青素含量

劉連新，劉郁，何偉平，田龍

（徐州工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院化學(xué)工程學(xué)院，江蘇徐州221140）

建立高效液相色譜測(cè)定藍(lán)莓干中的原花青素的含量，用于評(píng)價(jià)產(chǎn)品的優(yōu)劣。色譜條件：DiamonsilC18（250 mm× 4.6 mm，5 μm）色譜柱；流動(dòng)相為甲醇、乙腈與水，比例為75∶20∶5；流速：1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm。該方法對(duì)原花青素具有良好的線性，Y=5 756.85X+2 715（0～100 μg/mL），R2=0.999 5；重復(fù)性和精密度良好，樣品加標(biāo)回收率在99.83%。RSD=0.204 0%。

HPLC；藍(lán)莓；原花青素

藍(lán)莓（Blueberry）又稱越橘、藍(lán)漿果，杜鵑花科越桔屬多年生落葉或常綠灌木，果實(shí)為漿果，近圓形，呈藍(lán)色，酸甜適度，果肉細(xì)膩，皮薄籽小。藍(lán)莓是越橘屬植物中營(yíng)養(yǎng)成分最豐富的種類，除含常規(guī)的有機(jī)酸、糖以外，還富含多種維生素、超氧化物歧化酶、不飽和脂肪酸、礦物質(zhì)等成分，以及原花青素、黃酮、尼克酸等特殊成分。原花青素（Origin Proanthocyanidin，OPC）是一大類多酚類化合物的總稱。基本組成單元是兒茶素和表兒茶素，上下單元間以4-8或4-6位C-C鍵相連，形成具有不同聚合度的混合體。原花青素具有很強(qiáng)的抗氧化和消除自由基的生理活性，其抗自由基氧化能力大約為維生素E的50倍，維生素C的20倍；具有抗高血壓、內(nèi)皮依賴性血管舒張活性、抗缺血-再灌注損傷、抗動(dòng)脈粥樣硬化以及抗血小板凝固等作用；對(duì)多種癌細(xì)胞如乳腺癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞、皮膚癌細(xì)胞等都具有不同程度的抑制作用；還可以促進(jìn)與調(diào)節(jié)眼睛中視網(wǎng)膜中的視紫質(zhì)再生，預(yù)防近視與提高視力。本文主要是研究采用微波提取藍(lán)莓干中原花青素的方法，用HPLC測(cè)定藍(lán)莓干中的原花青素的含量，根據(jù)含量可以評(píng)價(jià)該產(chǎn)品的優(yōu)劣，來規(guī)范該產(chǎn)品質(zhì)量的評(píng)價(jià)方法，提高并推進(jìn)藍(lán)莓與加工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑

KQ-100B超聲波清洗儀：昆山市超聲儀器有限公司；L2000高效液相色譜儀：日本日立株式會(huì)社；Milli-Q Advantage Merck Millipore純水機(jī)：Merck Millipore USA；201s賽多利斯電子天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。

藍(lán)莓干：吉林產(chǎn)；原花青素：上海哈靈生物科技有限公司，HL20150612；乙腈、甲醇：sigma公司生產(chǎn)，為HPLC級(jí)別；其他試劑均為分析純。

1.2方法

1.2.1HPLC色譜測(cè)試條件［1-3］

色譜柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇∶水∶乙腈=75∶5∶20；流速：1.0 mL/min；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：室溫。

1.2.2對(duì)照品溶液的制備

精密稱取原花青素對(duì)照品0.002 5 g，置于25 mL容量瓶中，先用部分甲醇溶解，超聲10 min，定容，超聲，用0.25 μm微孔濾膜過濾，得100 μg/mL的對(duì)照品貯備溶液。

1.2.3樣品溶液的配制

取藍(lán)莓干樣品1.500 0 g，切碎，加入不低于80%的甲醇15mL，加入磷酸調(diào)節(jié)pH=3.5，溫度控制在80℃，微波提取45 min。過濾提取液體，取上清液0.5 mL，用甲醇稀釋到50 mL。樣品用0.25 μm的微孔濾膜過濾，得待測(cè)樣品溶液，裝入樣品瓶中，備用。

2　結(jié)果與討論

2.1進(jìn)樣精度

按照1.2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液制備方法，配制溶液，按照1.2.1項(xiàng)下的色譜方法測(cè)定，記錄峰面積，結(jié)果見表1所示，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.317 9%。

表1　精密度試驗(yàn)（n=6）Table 1Precision experiment（n=6）

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別精密移取對(duì)照品溶液1.00、2.00、3.00、4.00 mL，分別置于5 mL的棕色容量瓶中用甲醇稀釋，超聲、定容、用0.25 μm微孔濾膜過濾，注入樣品瓶。按照1.2.1項(xiàng)下的液相方法測(cè)定，記錄峰面積。以對(duì)照品進(jìn)樣濃度以（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=5 756.85X+2 715（0～100 μg/mL），結(jié)果見表2所示，HPLC色譜圖見圖1所示。

表2　濃度與面積關(guān)系Table 2Relationship of concentration and peak area

圖1　原花青素標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.1HPLC chromatogram of standard substance of origin proanthocyanidin

2.3穩(wěn)定性試驗(yàn)

取濃度為10 μg/mL的對(duì)照品溶液適量，分別放置于室溫陰暗處1、2、4、6 h，按照1.2.1項(xiàng)下的液相方法測(cè)定，計(jì)算峰面積與含量。結(jié)果原花青素的RSD為0.781%，表明供試品溶液在6 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4回收率試驗(yàn)

精密稱取0.1mL的標(biāo)準(zhǔn)液，按“1.2.2”的制備方法及“1.2.1”項(xiàng)條件液相方法進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)樣分析，每個(gè)平行3次平行測(cè)定，計(jì)算其回收率。結(jié)果表明，平均回收率為99.83%，RSD為0.204 0%。結(jié)果詳見詳見表3所示。

表3　回收率試驗(yàn)Table 3Recovery ratio experiment

2.5樣品含量測(cè)定［4-5］

取樣品若干個(gè)，按照1.2.1項(xiàng)下的液相方法測(cè)定。記錄峰面積，根據(jù)線性關(guān)系計(jì)算原花青素的含量結(jié)果見表4所示，平均含量在29.97 mg/g，RSD為1.210 8%，色譜圖見圖2所示。

表4　藍(lán)莓干中原花青素的含量Table 4The content of PC in Blueberry

圖2　藍(lán)莓樣品色譜圖Fig.2HPLC chromatogram of blueberry sample

2.6討論

2.6.1原花青素提取條件的選擇

根據(jù)原花青素的性質(zhì)，可以采用的提取溶劑有水、甲醇以及乙醇等。通過文獻(xiàn)查閱以及前期的預(yù)作試驗(yàn)，確定甲醇為提取溶劑，甲醇濃度不低于80%（體積分?jǐn)?shù)），用磷酸調(diào)節(jié)提取溶劑的pH=3.5，提取溫度為80℃，提取時(shí)間為45 min。

2.6.2原花青素的提取方式

本研究在樣品制備過程中采用微波提取，微波具有加熱速度快，溫度穩(wěn)定，而且在加熱過程中沒有氧氣，這樣可以減少樣品的氧化過程，提高了原花青素的穩(wěn)定性，而且雜質(zhì)含量較低。在微波提取過程中，采用攪拌子進(jìn)行攪拌，速度為600 r/min。

2.6.3原花青素的穩(wěn)定性

在穩(wěn)定性的考察時(shí)，只考慮了1、2、4、6 h，因?yàn)樵ㄇ嗨氐姆€(wěn)定性受周圍光、氧氣、溫度等因素的影響，一般應(yīng)控制在3 h之內(nèi)檢測(cè)，不建議放置時(shí)間過長(zhǎng)。

3　結(jié)論

采用HPLC色譜法測(cè)定藍(lán)莓干中原花青素的含量，紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm，流量：1.0 mL/min，進(jìn)樣量：20 μL，流動(dòng)相：甲醇∶水∶乙腈=75∶5∶20，檢測(cè)溫度為室溫。該方法可以根據(jù)測(cè)定的原花青素的含量，評(píng)價(jià)產(chǎn)品的優(yōu)劣。

［1］劉郁，劉連新，燕傳勇，等.高效液相色譜法測(cè)定茶飲料中阿斯巴甜的含量［J］.現(xiàn)代食品科技，2012，28（12）：1810-1812

［2］劉郁，張念潔，劉連新，等.采用HPLC方法測(cè)定氟伐他汀鈉分散片的含量［J］．吉林化工學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，28（1）：23-25

［3］周瑋婧，孫智達(dá)，謝筆鈞，等.荔枝皮原花青素提取、純化及抗氧化活性研究［J］.食品科學(xué)，2009，30（8）：68-71

［4］劉連新，劉郁，時(shí)光霞，等.液相色譜測(cè)定葡萄酒中白藜蘆醇含量的方法研究［J］.食品研究與開發(fā)，2014，35（21）：103-105

［5］時(shí)光霞，劉郁，劉連新，等.紅葡萄酒中合成色素的測(cè)定研究［J］.食品研究與開發(fā)，2014，35（10）：109-111

Determination of Proanthocyanidin in Blueberry by HPLC

LIU Lian-xin，LIU Yu，HE Wei-ping，TIAN Long
（School of Chemical Engineering，Xuzhou College of Industrial Technology，Xuzhou 221140，Jiangsu，China）

To evaluate the quality of the products，the HPLC method for the determination of the content of origin proanthocyanidin in blueberry was established.HPLC chromatographic conditions：Diamonsil C18（250 mm× 4.6 mm，5 μm）chromatographic column，flow phase：methanol∶acetonitrile∶water=75∶20∶5；flow rate was 1 mL/min，detection wavelength at 280 nm.The method had good linear relation，Y=5 756.85X+2 715（0-100 μg/mL），R2=0.999 5.The repeatability and precision were good，and the recovery rate was 99.83%.RSD= 0.204 0%.

HPLC；blueberry；origin proanthocyanidin

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.17.029

2016-03-25

劉連新（1971—），女（漢），副教授，碩士，研究方向：檢驗(yàn)方法與數(shù)據(jù)處理。