廢紙酶法糖化發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的研究

用植物纖維原料這樣的可再生資源生產(chǎn)乙醇燃料，是最有希望替代傳統(tǒng)的石油燃料的方法之一。該文以舊報紙和辦公廢紙作為原料，用里氏木霉Rut C-30（纖維素突變異種）和黑曲霉F38混合培養(yǎng)生產(chǎn)纖維素分解酶，通過酶水解廢紙中纖維素組分制得乙醇。研究發(fā)現(xiàn)，表面活性劑預(yù)處理對廢紙酶消化率有影響，當(dāng)表面活性劑聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）用量為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%時，舊報紙的酶消化率提高約為45%。

目前，世界上大多以淀粉和糖漿為原料生產(chǎn)燃料乙醇并實現(xiàn)工業(yè)化，從長遠來看這受到規(guī)模限制和不可持續(xù)性；而以木質(zhì)纖維素為原料的第二代生物燃料乙醇是決定未來大規(guī)模替代石油的關(guān)鍵。無論從經(jīng)濟和環(huán)境角度看，用木質(zhì)纖維素生產(chǎn)生物乙醇具有諸多優(yōu)勢。纖維素通常含50%～80%（按干基折算）的碳水化合物，主要是戊糖和己糖單元的聚合物。大多數(shù)碳水化合物可以通過化學(xué)或生物處理用于生產(chǎn)生物質(zhì)燃料，如乙醇。

利用工業(yè)纖維廢物作為生產(chǎn)乙醇的原料，可大幅降低生產(chǎn)成本。然而，由于其結(jié)構(gòu)復(fù)雜，預(yù)處理時需要破壞纖維素的結(jié)晶結(jié)構(gòu)，使水解酶更容易與碳水化合物作用。目前預(yù)處理方法主要有爆破法、酸、堿、有機溶劑、堿性過氧化氫、氨水和高溫液態(tài)水處理等。預(yù)處理工藝的選擇直接影響到廢物原料的處理，即影響到纖維素的轉(zhuǎn)化率和水解酶的性能。目前，纖維素酶水解生產(chǎn)乙醇技術(shù)是可行的。預(yù)處理要選擇高產(chǎn)率、低副產(chǎn)物、低能耗、條件溫和、環(huán)境友好的處理工藝。纖維素可以被纖維素混合酶糖化發(fā)酵生成可溶性物質(zhì)，混合酶包括纖維素酶（內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶）和半纖維素酶β（木聚糖酶）。內(nèi)切葡聚糖酶隨機攻擊纖維素分子鏈，將其分解成低聚糖，低聚糖分子鏈兩端經(jīng)外切葡聚糖酶降解為纖維二糖，再經(jīng)β-葡萄糖苷酶降解成葡萄糖單糖。另一方面，木聚糖酶水解木聚糖（半纖維素的主要成分）有利于去除木素，避免木素抑制纖維素酶的活性。由多種微生物作用于組成完整的纖維素酶系統(tǒng)，其中，絲狀真菌里氏木霉是纖維素降解微生物中的典型代表酶。這些纖維素酶是重要的工業(yè)用酶，廣泛應(yīng)用于食品、飼料、紡織和造紙行業(yè)等。

本研究采用里氏木霉RutC-30（纖維素突變異種）和黑曲霉F38混合培養(yǎng)生成纖維素分解酶，采用單獨糖化發(fā)酵（SHF）法測試了多種因素對廢紙生產(chǎn)乙醇的影響。

1 原料和方法

1.1 原料和微生物

廢紙，本地收集。

表面活性劑吐溫20、吐溫80、TritonX-100、p-硝基苯-β-D-半乳吡喃糖苷（p NPG）、3，5-二硝基水楊酸、羧甲基纖維素（CMC）和葡萄糖等。十二烷基磺酸鈉（SDS）和聚乙二醇（PEG 6000）。

檢測廢紙用的商品纖維素酶Novo 342、Danimax 89-2、Kamaistone K-050和Cellusoft。真菌里氏木霉Rut C-30，黑曲霉F38。

1.2 纖維素酶的生產(chǎn)

真菌里氏木霉Rut C-30和黑曲霉F38分別作為纖維素酶和β-葡萄糖苷酶（BGL）的接種物。作為生產(chǎn)纖維素酶和BGL的中性無機鹽培養(yǎng)基組成如下（單位為g/L）：尿素為0.3，KH2PO4為2，（NH4）2SO4為1.4，MgSO4·7H2O為0.3，蛋白胨為0.75，酵母膏為0.25，CaCl2·2H2O為0.4，添加1mL/L微量元素溶液（MnSO4為1.6 g/L，ZnSO4為1.4 g/L，F(xiàn)eSO4為5 g/L和CoCl2為2 g/L）。初始pH為4.8，3%麥麩作為碳源生成酶菌。黑曲霉置于500mL錐形瓶，其中含120 mL培養(yǎng)質(zhì)，溫度控制在30℃，旋轉(zhuǎn)混合器（160 r/ min）培養(yǎng)5天。里氏木霉Rut C-30的培養(yǎng)是在容積為3.6 L攪拌反應(yīng)器中進行，其工作容積1.6 L。生物反應(yīng)器（碟形底玻璃夾套反應(yīng)釜）安裝有檢測和/或控制攪拌速度、溫度、pH和溶解氧濃度的儀表。培養(yǎng)溫度控制在30℃，溶解氧保持在20%以上，pH=5（通過自動添加氨水和磷酸來調(diào)節(jié)和控制）。纖維素酶的培養(yǎng)是在溫度120℃下消毒滅菌20min，再發(fā)酵5天后，菌絲體在攪拌速度8 000 r/min下離心過濾10 min，取上層清液備用。

1.3 分析方法

纖維素酶活采用高斯法測定濾紙酶活，濾紙酶活的單位表示為FPU。這種方法是以檸檬酸鹽作緩沖液（0.05 mol/L，pH=4.8），在50 mg Whatman 1號濾紙上溫度50℃培養(yǎng)，測量60min后0.5mL酶溶液生成還原糖的量。內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶（或羧甲基纖維素酶）的測量是在溫度50℃條件下，0.05 mol/L檸檬酸鈉作緩沖液（pH=4.8），測量30 min后從0.5 mL酶溶液和0.5 mL 2% CMC混合溶液中生成還原糖的量。濾紙酶活和CMC酶活的測定是以不同的底物但以相同的原理來評價還原糖的量。還原糖采用3，5-二硝基水楊酸（DNS）法測定。

廢紙在溫度90℃下烘干至恒量，干燥器中冷卻并稱重。依據(jù)勃朗寧所描述的測定方法，絕干廢紙的纖維素、半纖維素和木素的定量測定采用硫酸水解法?；曳值臏y定是將干燥的廢紙放入馬弗爐灼燒，其溫度為500℃。乙醇和糖的含量測定采用高效液相色譜法配有折射率檢測儀（RID）和多孔性陰離子交換樹脂HPX-87H色譜柱。溫度控制在60℃，5mmol/L H2SO4作為色譜分析的流動相（0.6mL/min流速）。

1.4 廢紙制備

廢紙切成尺寸為1 cm×1 cm，在溫度60℃去離子水中浸漬6 h，漿濃為10 g/L，溫和地攪拌以去除油墨。多次反復(fù)擠壓以除去水分；然后，將浸漬后的廢紙置于溫度50℃烘箱中干燥24 h。烘干的廢紙樣用磨機碎解處理5 min，轉(zhuǎn)速1 500 r/min，以消除纖維素結(jié)構(gòu)的物理障礙；最后，廢紙用溫度60℃的稀磷酸（3 g/L）處理2 h，用去離子水洗至pH呈中性；然后，在干燥箱中烘干至恒量，溫度控制在50℃。

1.5 酶消化試驗

由里氏木霉Rut C-30和黑曲霉F38恢復(fù)活力的粗酶首先采用凍干濃縮，并懸浮于20 mmol/L檸檬酸鹽緩沖液（pH=4.8）中，再經(jīng)混合得到最終的酶濃度如下：活性3.5 U/mL的FP酶，1.5 U/mL的內(nèi)切葡聚糖酶，20 U/mL的β-葡萄糖苷酶和80 U/mL的木聚糖酶。這種混合物同時與其他工業(yè)纖維素酶（Novo 342，Danimax 89-2，Kamaistone K-050和Cellusoft）進行對比，測試其用于預(yù)處理廢紙生產(chǎn)可發(fā)酵糖的能力。取1 g預(yù)處理的廢紙（辦公廢紙，舊報紙）在溫度40℃下以不同纖維素酶培養(yǎng)，完成生物質(zhì)的酶解糖化。具體步驟如下：在250mL具塞燒瓶中加入廢紙樣和酶，并加入50 mmol/L檸檬酸鹽緩沖液（pH=4.8），使總液體體積為50mL。用一個可控攪拌器控制燒瓶內(nèi)攪拌轉(zhuǎn)速為150 r/min。所有纖維素酶的用量都固定為10 FPU/g（干物質(zhì)）。發(fā)酵培育48 h后，從產(chǎn)物中取樣，以6 000 r/min離心分離10min，上層清液用于分析總還原糖，用DNS法測定。

糖化率計算公式：

在所有的分析測定中至少有3組平行樣品，數(shù)據(jù)取3次測定值的平均值。

1.6 表面活性劑預(yù)處理對酶消化率的影響

表面活性劑預(yù)處理方法如下：稱取10 g預(yù)處理的辦公廢紙和舊報紙放入500mL燒瓶中，加200 g去離子水；加入0.5%（對絕干廢紙質(zhì)量）表面活性劑（吐溫20、吐溫80、Triton X-100、SDS和PEG 6000）于燒瓶中，溫度40℃，轉(zhuǎn)速250 r/min，攪拌2 h。預(yù)處理后，濕的固體進行離心分離，用3 L去離子水徹底洗滌以去除表面活性劑；然后，在干燥箱中干燥，溫度50℃，過夜。酶消化率的測定方法如上所述。

1.7 廢紙水解發(fā)酵制乙醇

所有的發(fā)酵試驗都使用釀酒酵母CTM-30101。辦公廢紙采用單獨糖化發(fā)酵（SHF）生產(chǎn)乙醇，廢紙水解糖化產(chǎn)物經(jīng)過濾消毒滅菌后作為發(fā)酵培養(yǎng)液。發(fā)酵培養(yǎng)試驗在1 L三角瓶中進行，加入200 mL補充了氮源的培養(yǎng)液，形成YMP培養(yǎng)基（含3 g/L酵母提取物，3 g/L麥芽提取物和5 g/L蛋白胨）。三角瓶接種5%的酵母菌懸液，酵母菌懸液是在含有10 g/L的酵母提取物、10 g/L蛋白胨及20 g/L的葡萄糖的YPG培養(yǎng)基上培養(yǎng)15 h而獲得。空白對比發(fā)酵也是用YMP培養(yǎng)基，但補充加入試劑級葡萄糖使其達到用于廢紙單獨糖化發(fā)酵過程的水解產(chǎn)物的相同濃度。在溫度30℃下進行，150 r/min回轉(zhuǎn)式震蕩下培養(yǎng)繁殖。樣品72 h后收集，并在12 000 r/min離心10min。無微生物細胞的上層清液用于測定產(chǎn)生的乙醇和糖的消耗。細胞生長情況由讀取光密度來直接監(jiān)測。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶法生產(chǎn)廢紙水解酶制劑

表1顯示了粗纖維素酶的生產(chǎn)水平和BGL的里氏木霉Rut C-30和黑曲霉F38分別經(jīng)過5天的培養(yǎng)情況［表中，總纖維素酶活（FP）、CMC、p NPG和木聚糖酶活性（木聚糖）作為酶活性的測定底物］。

表1 里氏木霉Rut C-30和黑曲霉F38培養(yǎng)5天產(chǎn)生粗纖維素酶

Rut C-30纖維素酶可用于估計濾紙的酶活性（1.14 U/mL）和CMC酶的活性（0.76 U/mL），但BGL酶活性（0.22 U/mL）較小。相反地，黑曲霉酶有較小的濾紙酶活（0.24 U/mL）和CMC酶活（0.33 U/mL），而BGL酶活達到6.8 U/mL，高出了數(shù)倍。里氏木霉是一種絲狀真菌纖維素酶，但它具有低的BGL酶活性，導(dǎo)致纖維二糖積累，它在水解過程中產(chǎn)生抑制，是最終產(chǎn)物的抑制劑。值得注意的是，添加BGL以減小纖維二糖酶的抑制作用。

另一方面，木聚糖酶活性主要由2種培養(yǎng)方法獲得。這種酶可能在半纖維素降解過程中起重要作用。許多研究者報道了木聚糖酶是一種能夠顯著提高纖維素酶水解纖維素活性的酶劑，而半纖維素被認(rèn)為是纖維素水解的障礙物質(zhì)，阻礙酶進入纖維素。

2.2 廢紙組成

表2是廢紙（辦公廢紙、舊報紙）的生化特性分析結(jié)果（分別4個平行試樣并分別標(biāo)記為序號1～4）。

表2 廢紙的生化特性分析結(jié)果w/%

表2列出了不同的研究所測定得出的辦公廢紙中纖維素含量，質(zhì)量分?jǐn)?shù)從55.7%～87.4%不等，最高纖維素含量為87.4%；最低的半纖維素和木素含量分別為4.7%質(zhì)量分?jǐn)?shù)和0.93%質(zhì)量分?jǐn)?shù)。這一特性更適合糖化發(fā)酵生產(chǎn)，因為少量的半纖維素和木素對酶法水解纖維素產(chǎn)生較小阻礙作用。有研究曾測定出辦公廢紙的纖維素含量較低（55.7%），可能是因廢紙樣品中有無機物涂布紙（含量達13%）。另有研究證實，不僅原生紙漿會影響纖維素含量，而且不同的測定方法也影響其生化成分的測定結(jié)果。鑒于此，必須選擇適宜的方法，盡可能使碳水化合物的損失量控制在最小范圍內(nèi)。

由表2還可見，與辦公廢紙相比，舊報紙含有較多的木素（23.9%）和半纖維素（18.1%），纖維素含量較少（43.7%）。舊報紙的這一組成特點使纖維素水解程度受限，不過可通過使用多種水解酶協(xié)同作用來克服。

2.3 酶消化試驗

在使用酶以前對酶制劑的水解性能進行評估是很有必要的。圖1是使用不同的纖維素酶水解反應(yīng)48 h后的糖化度。

圖1 不同纖維素酶水解反應(yīng)48 h后的糖化度

由圖1可知，酶混合物和纖維素酶Kamaistone K-050表現(xiàn)出較好的功能穩(wěn)定性，并分別能夠保留約66%和71%初始活性。其原因可能是由于它們有良好的熱穩(wěn)定性。操作穩(wěn)定性是酶在工業(yè)應(yīng)用中非常理想的特性，特別有利于連續(xù)糖化過程和顯著降低纖維素乙醇發(fā)酵的生產(chǎn)成本。值得注意的是，這2種酶制劑分別來自里氏木霉Rut C-30和黑曲霉F38，他們協(xié)同使用比單獨使用能顯著提高廢紙的水解率（數(shù)據(jù)未顯示）。這表明混合酶非常適合廢紙的糖化發(fā)酵。

2.4 表面活性劑預(yù)處理對酶消化率的影響

眾所周知，添加表面活性劑對木質(zhì)纖維素酶水解有顯著改善作用；然而，以往的研究是在水解階段加入表面活性劑。本研究選擇了5種不同的表面活性劑，考察了當(dāng)表面活性劑用量均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%時纖維素酶解對廢紙中木質(zhì)纖維原料的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 不同的表面活性劑對預(yù)處理后廢紙中纖維素糖轉(zhuǎn)化率的影響

由圖2可見：所有表面活性劑均能提高舊報紙的水解效率，但辦公廢紙水解效率無明顯提高；Triton X-100用量0.5%時能提高舊報紙消化率約45%。Triton X-100是非離子型表面活性劑，可顯著提高廢紙或再生紙的糖化率。如圖2所示，由于舊報紙中木素含量相對較高，木素對纖維素酶解有一定的影響，會抑制纖維素酶解能力，可通過在酶解液中添加表面活性劑加以改善。研究者認(rèn)為，表面活性劑的加入主要是減少木素對纖維素酶的吸附作用。已經(jīng)有研究者提出了幾種機理作用，表面活性劑的加入可以顯著提高纖維原料的纖維素糖轉(zhuǎn)化率，且底物中木素含量越高，其纖維素轉(zhuǎn)化率的提高幅度也越大。而辦公廢紙含相對較低的木素可以解釋表面活性劑預(yù)處理后相對較低的糖轉(zhuǎn)化量，只有Triton X-100預(yù)處理后舊報紙可以維持較高的糖轉(zhuǎn)化率。

2.5 廢紙水解產(chǎn)物的乙醇發(fā)酵

研究發(fā)現(xiàn)辦公廢紙生產(chǎn)乙醇產(chǎn)量高于以往以造紙污泥作為原料生產(chǎn)乙醇。底物用木糖發(fā)酵酵母在以分步糖化發(fā)酵（SHF）和同步糖化發(fā)酵（SSF）工藝下培育72 h。SHF法可以達到較高的轉(zhuǎn)化率，乙醇產(chǎn)率相當(dāng)于1 g總糖約得到0.27 g乙醇。

在YMP介質(zhì)對比發(fā)酵中，發(fā)現(xiàn)葡萄糖和乙醇有類似的表現(xiàn)。最大的乙醇質(zhì)量濃度（9.6 g/L）比SHF法稍高，經(jīng)36 h培育后，可獲得相當(dāng)于產(chǎn)量為0.26 g乙醇每升每小時和0.42 g乙醇每克總糖。觀察細胞生長或酒精發(fā)酵有細微差異，結(jié)果表明，辦公廢紙的水解物無任何顯著抑制微生物生長的物質(zhì)。

圖3顯示了2個典型的發(fā)酵工藝過程中水解時間與葡萄糖濃度、乙醇濃度和磷酸預(yù)處理關(guān)系（圖中：SHF工藝，“■”為葡萄糖，“●”為乙醇，“▲”為增長水平；對照工藝YMP，“□”為葡萄糖，“○”為乙醇，“△”為增長水平。

圖3 2個典型的發(fā)酵工藝過程中水解時間與葡萄糖濃度、乙醇濃度和磷酸預(yù)處理的關(guān)系

3 結(jié)論

舊報紙和辦公廢紙可作為可發(fā)酵糖的生產(chǎn)原料，SHF可以使降解的糖轉(zhuǎn)化為乙醇。由里氏木霉Rut C-30和黑曲霉F38培育的纖維素酶和BGL，分別證明了糖化發(fā)酵廢紙生產(chǎn)乙醇的可行性。在最優(yōu)水解條件下，從廢紙中釋放的糖隨后被生物轉(zhuǎn)化為乙醇。

（張俊苗編譯）