李艷秋，趙惠柳，歐　超，李美琴，利基林，朱　波

(廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科，南寧 530021)

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·論著·

ERCC1基因多態(tài)性與肝癌患者易感性分析*

李艷秋，趙惠柳#，歐超，李美琴，利基林，朱波△

(廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科，南寧 530021)

目的探討切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1(ERCC1)-4533/8092位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性(SNPs)與廣西壯族人群肝癌易感性之間關(guān)系。方法通過聚合酶鏈反應(yīng)限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)方法檢測88例原發(fā)性肝癌患者和82例健康對照者的ERCC1-4533/8092基因多態(tài)性。結(jié)果ERCC1-4533位點(diǎn)的基因分型在病例組和對照組的頻數(shù)分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，ERCC1-8092位點(diǎn)的基因分型在病例組和對照組的頻數(shù)分布差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與攜帶ERCC1-8092 CC基因型的個體相比，攜帶ERCC1-C8092 CA/AA基因型的個體具有更高的肝癌易感性(CA：OR=2.556，95%CI：1.345～4.855；AA：OR=8.667，95%CI：1.000～75.092)。以攜帶ERCC1-8092 C等位基因作為參照，攜帶ERCC1-C8092 A等位基因可以增加原發(fā)性肝癌的發(fā)病危險性(OR=2.387，95%CI：1.428～3.992)。結(jié)論ERCC1-8092位點(diǎn)基因多態(tài)性與廣西壯族人群肝癌易感性有關(guān)。

ERCC1；原發(fā)性肝癌；基因多態(tài)性；易感性

原發(fā)性肝癌的發(fā)生發(fā)展是1個長期并且復(fù)雜的過程，原發(fā)性肝癌不但是嚴(yán)重危害人類生命健康的惡性腫瘤，且初期的臨床癥狀不明顯，因此很多患者在確診的時候已經(jīng)處于原發(fā)性肝癌晚期，只有30%患者通過如手術(shù)切除、肝移植、經(jīng)皮消融等方法治愈。近年在我國發(fā)病率呈上升趨勢，因此原發(fā)性肝癌的早期診斷變得越來越重要[1-2]。許多研究表明，基因多態(tài)性可能和某些DNA修復(fù)基因的功能有關(guān)，這些不同的基因多態(tài)性可能與不同癌癥的易感性有關(guān)，所以，分子水平的疾病診斷可能對腫瘤的早期診斷及腫瘤的個性化治療和預(yù)后判斷做出一定的貢獻(xiàn)[2]。切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1(ERCC1)是核苷酸切除修復(fù)途徑(NER)的關(guān)鍵酶，其與特異性核酸內(nèi)切酶DNA修復(fù)缺乏互補(bǔ)酶F(XPF)結(jié)合形成異源性二聚體結(jié)構(gòu)，具有識別損傷并切除5′端的雙重作用[3-4]。有研究表明，ERCC1基因多態(tài)性可以影響核苷酸切除修復(fù)過程使其功能異常，基因組的不穩(wěn)定性增加，這可能導(dǎo)致多種腫瘤發(fā)生[5]。因此，本研究將對ERCC1-4533/8092的多態(tài)性與廣西壯族人群的原發(fā)性肝癌易感性之間的關(guān)系進(jìn)行探討。

1　資料與方法

1.1一般資料病例組選取2015年7～12月在本院病理組織學(xué)及影像學(xué)確診未經(jīng)治療的原發(fā)性肝細(xì)胞癌88例，其中女16例，男72例；平均年齡(51.375±11.243)歲。對照組選自同醫(yī)院同期住院的非腫瘤患者82例(臨床檢查、檢驗(yàn)結(jié)果均無異常)，其中，女15例，男67例；平均年齡(53.341±15.912)歲。病例組和對照組在年齡和性別比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。所有入選研究對象均為廣西壯族人。

1.2儀器與試劑小量全血基因組DNA快速提取試劑盒、dNTPs由北京艾德萊生物科技有限公司提供；Taq DNA聚合酶、PmaCⅠ、Mbo Ⅱ由日本TaKaRa公司提供；引物由上海生工生物工程有限公司合成；瓊脂糖由西班牙Biowest公司提供；ProFlex PCR儀(美國Life Techonlogies公司)；Universal Hood Ⅲ凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-rad公司)；DYCP-31DN電泳儀(北京六一生物科技有限公司)。

1.3方法

1.3.1全血DNA提取抽取受檢者外周靜脈血2～3 mL置于EDTA 抗凝管中，按照試劑盒說明書嚴(yán)格操作，使用小量全血基因組DNA快速提取試劑盒提取標(biāo)本中的DNA。經(jīng)核酸濃度測定儀測量濃度后，A260/A280比值在1.8～2.0視為DNA純度合格，儲存于-20 ℃冰箱備用。

1.3.2ERCC1 4533/8092位點(diǎn)基因多態(tài)性分析采用聚合酶鏈反應(yīng)限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)技術(shù)對ERCC1-4533/8092位點(diǎn)基因多態(tài)性進(jìn)行分析。PCR反應(yīng)體系共25 μL，含5 U/μL Taq DNA聚合酶0.5 μL，DNA模板1 μL，10 μmol/L上、下游引物各1 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，10×PCR buffer(Mg2+Plus)2.5 μL，滅菌雙蒸水17 μL。引物設(shè)計參考文獻(xiàn)[6-7]。4533位點(diǎn)：上游引物：5′-AGA TGT CCT CTG CTC ACC CC-3′，下游引物：5′-GGG AGA ACA AAG TGG CTG GA-3′，PCR反應(yīng)過程為94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，61 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)，72 ℃再延伸10 min。目的產(chǎn)物長379 bp。8092位點(diǎn)：上游引物：5′-ACA GTG CCC CAA GAG GAG AT-3′，下游引物：5′-AGT CTC TGG GGA GGG ATT CT-3′，PCR反應(yīng)過程為95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性45 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35個循環(huán)，72 ℃再延伸10 min，目的產(chǎn)物長204 bp。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后在紫外線燈下確認(rèn)為目的條帶，取10 μL擴(kuò)增產(chǎn)物分別與10 U限制性內(nèi)切酶PmaCⅠ(ERCC1-4533)/Mbo Ⅱ(ERCC1-8092)混勻后置于37 ℃水浴箱中過夜進(jìn)行酶切反應(yīng)。酶切產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后在紫外線燈下分析結(jié)果。為保證基因多態(tài)性分型的準(zhǔn)確性，隨機(jī)抽取20%的標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果與第1次試驗(yàn)一致。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理以t檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn)統(tǒng)計分別分析計量資料和計數(shù)資料。對照組ERCC1-4533/8092基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡采用χ2檢驗(yàn)。應(yīng)用非條件Logistic回歸計算ERCC1-4533/8092基因型分布的比值比(OR)及其95%可信區(qū)間(95%CI)評價不同基因型和等位基因與肝癌易感性之間的相關(guān)性。所有統(tǒng)計檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)，當(dāng)P<0.05時認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件錄入和分析數(shù)據(jù)。

2　結(jié)　　果

2.1ERCC1-4533/8092位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及酶切產(chǎn)物分析ERCC1-4533位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為379 bp，經(jīng)限制性內(nèi)切酶PmaC Ⅰ酶切后可出現(xiàn)3種情況?；蛐蜑榧兒献覩G時電泳結(jié)果出現(xiàn)174、205 bp 2條帶，基因型為雜合子GA時電泳結(jié)果出現(xiàn)74、205、379 bp 3條帶，基因型為純合子AA時電泳結(jié)果出現(xiàn)379 bp 1條帶。ERCC1-8092位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為204 bp，經(jīng)限制性內(nèi)切酶Mbo Ⅱ酶切后可出現(xiàn)3種情況?；蛐蜑榧兒献覥C時電泳結(jié)果出現(xiàn)204 bp 1條帶，基因型為雜合子CA時電泳結(jié)果出現(xiàn)204、116、88 bp 3條帶，基因型為純合子AA時電泳結(jié)果出現(xiàn)116、88 bp 2條帶。見圖1、2。

2.2Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗(yàn)為了檢驗(yàn)ERCC1-4533/8092位點(diǎn)基因型分布是否符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，對對照組的ERCC1-4533/8092位點(diǎn)基因型分布進(jìn)行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)，檢驗(yàn)結(jié)果顯示，對照組的ERCC1-4533/8092位點(diǎn)基因型分布的觀察數(shù)和預(yù)期數(shù)之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，對照組標(biāo)本具有群體代表性。見表1。

2.3ERCC1-4533/8092基因型及等位基因分布頻率比較和肝癌易感性分析ERCC1-4533位點(diǎn)的基因分型的頻數(shù)分布在病例組和對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，ERCC1-8092位點(diǎn)的基因分型的頻數(shù)分布在病例組和對照組兩組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。經(jīng)非條件Logistic回歸分析，以ERCC1-8092 CC基因型作為參照，ERCC1-C8092 CA基因型可以增加原發(fā)性肝癌的發(fā)病危險性(OR=2.556，95%CI：1.345～4.855)，ERCC1-C8092 AA基因型可以增加原發(fā)性肝癌的發(fā)病危險性(OR=8.667，95%CI：1.000～75.092)。以ERCC1-8092 C等位基因作為參照，ERCC1-C8092 A等位基因可以增加原發(fā)性肝癌的發(fā)病危險性(OR=2.387，95%CI：1.428～3.992)。見表2。

注：M表示100 bp DNA Marker Ladder；1表示ERCC1-4533 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；2表示純合子AA基因型：379 bp；3表示雜合子GA 基因型：174、205、379 bp；4表示純合子GG基因型：174、205 bp。

圖1ERCC1-4533基因多態(tài)性2%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析

注：M表示100 bp DNA Marker Ladder；1表示ERCC1-8092 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；2表示純合子AA基因型：116、88 bp；3表示雜合子CA基因型：204、116、88 bp；4表示純合子CC基因型：204 bp。

圖2　ERCC1-8092基因多態(tài)性2%

表2　　病例組與對照組ERCC1-4533/8092基因型及等位基因分布頻率比較

續(xù)表2　　病例組與對照組ERCC1-4533/8092基因型及等位基因分布頻率比較

注：與對照組相比，*P>0.05，#P<0.05。

3　討　　論

正常細(xì)胞主要通過核苷酸切除修復(fù)途徑(NER)進(jìn)行DNA損傷修復(fù)，而ERCC1是核苷酸切除修復(fù)途徑中的關(guān)鍵基因。ERCC1基因最初是由HeLa細(xì)胞克隆得到，位于人類第19號(19q13.2-3)染色體上，編碼含297個氨基酸的ERCC1蛋白[8-9]。單核苷酸多態(tài)性(SNPs)是指基因水平上由單個核苷酸變異引起的DNA序列多態(tài)性，在人群中的發(fā)生頻率大于1%[10]。ERCC1基因多態(tài)性可能影響ERCC1 mRNA表達(dá)或穩(wěn)定及蛋白質(zhì)功能，可能使核苷酸切除修復(fù)途徑功能受影響，導(dǎo)致基因組的不穩(wěn)定性增加，進(jìn)而產(chǎn)生腫瘤或其他疾病發(fā)生的惡性表型行為。有研究表明，ERCC1基因多態(tài)性與非小細(xì)胞肺癌、胃癌、卵巢癌等多種腫瘤的發(fā)病機(jī)制、對鉑類等抗腫瘤藥物的反應(yīng)性及預(yù)后有密切關(guān)系[11-13]。

目前關(guān)于ERCC1-4533/8092位點(diǎn)基因多態(tài)性與原發(fā)性肝癌易感性關(guān)系的報道還比較少，其位點(diǎn)是否存在多態(tài)性且與原發(fā)性肝癌易感性是否有關(guān)尚不能確定。藍(lán)永洪等[8]的研究表明，海南人群中人類ERCC1-4533G/A存在多態(tài)性。鄭霄雁[14]的研究結(jié)果顯示， ERCC1-4533/8092位點(diǎn)存在基因多態(tài)性，并且這2個位點(diǎn)基因多態(tài)性均與原發(fā)性肝癌的發(fā)生可能有關(guān)。在本次病例對照研究中，作者分析了ERCC1-4533/8092 2個位點(diǎn)基因多態(tài)性與廣西壯族人群原發(fā)性肝癌易感性之間的關(guān)系，結(jié)果表明ERCC1-4533位點(diǎn)的基因分型的頻數(shù)分布在病例組和對照組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，ERCC1-8092位點(diǎn)的基因分型和等位基因的頻數(shù)分布在病例組和對照組兩組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。非條件Logistic回歸分析結(jié)果顯示，ERCC1-8092位點(diǎn)的A等位基因可能是廣西壯族人群原發(fā)性肝癌發(fā)生的危險因素，攜帶ERCC1-8092 A等位基因的個體患原發(fā)性肝癌的危險性是ERCC1-8092 C等位基因的2.387倍(OR=2.387，95%CI：1.428～3.992)。然而，由于本次研究收集的對象數(shù)量偏少并僅限于廣西壯族人群且只針對原發(fā)性肝癌這1種腫瘤進(jìn)行探討，因此，ERCC1-4533/8092基因多態(tài)性是否對原發(fā)性肝癌的易感性產(chǎn)生影響，是否與肝臟其他相關(guān)性疾病有關(guān)，需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本數(shù)量，擴(kuò)大疾病范圍，在不同地區(qū)、不同人群中進(jìn)行更深一步的探討。

原發(fā)性肝癌在世界腫瘤相關(guān)死亡中排名第2位，有數(shù)據(jù)顯示目前中國發(fā)病人數(shù)約占全球的原發(fā)性肝癌50%[15]。廣西是中國原發(fā)性肝癌的高發(fā)區(qū)，同時也是壯族人群聚集地[16]。而ERCC1基因多態(tài)性又與鉑類化療藥物的耐藥性有關(guān)，因此對廣西壯族人群的ERCC1基因多態(tài)性進(jìn)行研究將對原發(fā)性肝癌的發(fā)病機(jī)制、基因水平的疾病診斷和個性化治療及預(yù)后判斷具有重要意義。

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The relationship on polymorphisms of ERCC1-4533/8092 and the susceptibility of hepatocellular carcinoma*

LIYanqiu，ZHAOHuiliu#，OUChao，LIMeiqin，LIJilin，ZHUBo△

(DepartmentofLaboratory，AffiliatedTumorHospitalofGuangxiMedicalUniversity，Nanning，Guangxi530021，China)

ObjectiveTo investigate the relationship on the excision repair cross complementing gene 1(ERCC1)-4533/8092 site single nucleotide polymorphisms(SNPs) and the susceptibility to hepatocellular carcinoma(HCC) in Guangxi Zhuang population.MethodsPolymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP) method was used to detect the ERCC1-4533/8092 gene polymorphism in 88 cases with primary liver cancer and 82 cases of normal controls.ResultsThere was no difference in the frequency distribution of ERCC1-4533 in the case group and the control group,the frequency distribution of the ERCC1-8092 in the case group and the control group was different(P<0.05).Compared with ERCC1-8092 CC，ERCC1-C8092 CA/AA had higher risk of primary hepatocellular carcinoma(CA：OR=2.556，95%CI：1.345-4.855；AA：OR=8.667，95%CI：1.000-75.092).ERCC1-8092 C allele as a reference，ERCC1-8092 A allele can increase the risk of primary liver cancer(OR=2.387，95%CI：1.428-3.992).ConclusionThe genetic polymorphisms of ERCC1-8092 sites are associated with susceptibility to hepatocellular carcinoma in Guangxi Zhuang population.

ERCC1；primary hepatocellular carcinoma；polymorphisms；susceptibility

廣西自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2012GXNSFAA053170)。

李艷秋，女，廣西醫(yī)科大學(xué)在讀研究生，主要從事血清腫瘤標(biāo)志物檢驗(yàn)、腫瘤基金分型等方面的研究。#共同第一作者：趙惠柳，女，副主任技師，主要從事腫瘤的診斷、發(fā)生、發(fā)展等方面的研究?！?/p>

，E-mail：bozhu196@163.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.18.007

A

1673-4130(2016)18-2523-03

2016-04-03

2016-06-11)