趙旭鴻，沈菊英，蔡惠萍，陳魯藝，李　智，徐　龍

(同濟(jì)大學(xué)附屬楊浦醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200090)

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·論著·

流式細(xì)胞術(shù)用于鮑曼不動(dòng)桿菌體外藥敏試驗(yàn)的研究

趙旭鴻，沈菊英，蔡惠萍，陳魯藝，李智，徐龍△

(同濟(jì)大學(xué)附屬楊浦醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200090)

目的探討流式細(xì)胞術(shù)(FCM)方法快速檢測鮑曼不動(dòng)桿菌體外藥敏試驗(yàn)的臨床應(yīng)用價(jià)值。方法選用碘化丙啶(PI)作為熒光染料，用FCM檢測大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和66株鮑曼不動(dòng)桿菌臨床菌株對舒氨西林、左氧氟沙星、美羅培南、頭孢噻肟鈉的敏感性。根據(jù)細(xì)菌培養(yǎng)物在不同濃度藥物作用后所檢測到的熒光強(qiáng)度來判斷細(xì)菌存活率，從而推斷MIC值。并與微量稀釋法和VITEK儀檢測結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果66株鮑曼不動(dòng)桿菌流式細(xì)胞熒光法抗菌藥物敏感試驗(yàn)(FCST)結(jié)果測得舒氨西林耐藥35株，左氧氟沙星耐藥30株，美羅培南耐藥13株，頭孢噻肟鈉耐藥38株。采用χ2檢驗(yàn)，分別比較與微量稀釋法、VITEK儀檢測判斷的敏感性結(jié)果，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論鮑曼不動(dòng)桿菌流式細(xì)胞熒光法藥敏試驗(yàn)與常規(guī)方法檢測結(jié)果具有一致性，并且更快速、靈敏、客觀。

流式細(xì)胞熒光法抗生素敏感試驗(yàn)；鮑曼不動(dòng)桿菌；舒氨西林；左氧氟沙星；美羅培南；頭孢噻肟鈉

通過抗菌藥物體外藥敏試驗(yàn)檢測最低抑菌濃度(MIC)是臨床判斷細(xì)菌對抗菌藥物敏感性、合理使用抗菌藥物的重要依據(jù)。目前臨床上MIC的檢測方法包括微量稀釋法、紙片擴(kuò)散法、試管肉湯稀釋法、瓊脂稀釋法和Q試驗(yàn)等。這些方法通常能提供細(xì)菌群體對抗菌藥物敏感性的均值，但不能發(fā)現(xiàn)細(xì)菌個(gè)體間藥敏反應(yīng)的異質(zhì)性，且操作煩瑣、耗時(shí)較長。鮑曼不動(dòng)桿菌是引起醫(yī)院內(nèi)感染的重要病原菌之一，其耐藥性日益嚴(yán)重，尤其多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌，在臨床上選用抗菌藥物十分棘手?，F(xiàn)有抗菌藥物藥敏試驗(yàn)難以對多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌提供有價(jià)值的藥敏結(jié)果，不利于及時(shí)、有效地指導(dǎo)抗菌藥物使用[1-2]。自1982年有學(xué)者探索用FCM對大腸埃希菌進(jìn)行抗菌藥物藥敏試驗(yàn)，流式細(xì)胞熒光法抗菌藥物敏感試驗(yàn)(FCST) 逐漸得到研究和發(fā)展[3]。FCST可以檢測到細(xì)菌群體中具有藥敏異質(zhì)性的菌細(xì)胞，可為細(xì)菌藥敏試驗(yàn)提供一種更為簡便快速、靈敏可靠的診斷方法[4]。本研究應(yīng)用FCST檢測鮑曼不動(dòng)桿菌MIC，并與常規(guī)藥敏試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較，探討其臨床應(yīng)用價(jià)值。

1　資料與方法

1.1菌株大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 25922由北京中國藥品生物制品檢定所提供；鮑曼不動(dòng)桿菌臨床分離株收集至2013年4月至2014年9月本院細(xì)菌室，均經(jīng)過VITEK全自動(dòng)微生物鑒定儀鑒定。

1.2儀器與試劑流式細(xì)胞儀為美國Beckman-coulter公司EPICS-XL型；全自動(dòng)微生物鑒定和藥敏系統(tǒng)為法國生物梅里埃公司VITEK32型。舒氨西林、左氧氟沙星、美羅培南、頭孢噻肟鈉標(biāo)準(zhǔn)品來自北京中國藥品生物制品檢定所；碘化丙啶(PI)為美國Sigma公司產(chǎn)品。

1.3方法

1.3.1FCST檢測挑取血瓊脂平板上單個(gè)待檢菌落，接種于MH液體培養(yǎng)基并用VITEK儀加以鑒定。將接種于MH液體培養(yǎng)基的待檢菌置于37 ℃水浴2 h孵育后，調(diào)整菌液濃度至0.5號(hào)麥?zhǔn)蠞岫?相當(dāng)于1.5×108cfu/mL)。在各FCST測定管中按抗菌藥物濃度梯度分別加入相應(yīng)抗菌藥物和待檢菌液，制成終濃度為7.5×106cfu/mL、每管總體積為1 mL的細(xì)菌懸液，輕輕混勻，置37 ℃水浴孵育3 h后加入PI 10 μL/每管，搖勻并室溫避光15 min后上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。FCST檢測每管至少獲取104個(gè)菌細(xì)胞。設(shè)置FCST數(shù)據(jù)收集分析方案，通過檢測散射光信號(hào)(SC)和碘化丙啶熒光信號(hào)(PI)對樣本進(jìn)行分析。散射光信號(hào)包括前向散射光(FS)和側(cè)向散射光(SS)，F(xiàn)S強(qiáng)度與細(xì)胞大小呈正相關(guān)，SS強(qiáng)度與細(xì)胞顆粒度呈正相關(guān)。分別設(shè)置FS-SS雙參數(shù)圖和前向散射光/碘化丙啶熒光(FS/PI)雙參數(shù)圖。在FS-SS雙參數(shù)圖中調(diào)整電壓使擬進(jìn)行分析的細(xì)菌群密集出現(xiàn)，并設(shè)門圈定菌細(xì)菌群，使其熒光信號(hào)出現(xiàn)在FS/PI雙參數(shù)圖中。FS/PI雙參數(shù)圖中PI表示PI的熒光信號(hào)強(qiáng)度(在X軸上以對數(shù)值表示)，分別以活菌和死菌作為陰性對照和陽性對照在圖上設(shè)定十字門，可提供陽性區(qū)域內(nèi)PI陽性的細(xì)胞百分率(PI%)和X軸平均熒光強(qiáng)度(MFIx)等多種參數(shù)。檢測不同抗菌藥物濃度作用下菌株的PI%每株菌，同時(shí)以無藥活菌為陰性對照、以加熱死菌為陽性對照，其中敏感菌株的PI%隨著藥物濃度增加顯著增高，而耐藥菌株的PI%并不隨藥物濃度增高而有明顯變化，從而可推斷菌株的藥物敏感性和MIC。本文共檢測了66株鮑曼不動(dòng)桿菌分離株及1株大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)菌株。

1.3.2微量稀釋法參照衛(wèi)生部《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》進(jìn)行[5]。正式試驗(yàn)前選擇部分菌株與試管稀釋法進(jìn)行比較，敏感性結(jié)果相符。

1.3.3VITEK儀器檢測使用GNS-448檢測卡，微孔板中舒氨西林、左氧氟沙星、美羅培南、頭孢噻肟鈉的濃度分別為:8、32、64 μg/mL，1、4、8 μg/mL，2、4、8 μg/mL，6、24 μg/mL，菌液濃度為1.5×107cfu/mL。次日儀器報(bào)告結(jié)果。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)作χ2檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　　果

2.1無菌空白MH液體培養(yǎng)基FCM檢測結(jié)果僅在FS-SS圖左下角顯示少量肉湯顆粒，見圖1。

圖1　　無菌MH培養(yǎng)液

2.2不同生活狀態(tài)細(xì)菌FCM檢測結(jié)果取不加抗菌藥物正常生長的細(xì)菌作為陰性對照，用加熱處死的細(xì)菌作為陽性對照，用PI染色，上機(jī)檢測。活菌懸液(不含藥物)的結(jié)果顯示，一群集中較小的菌細(xì)胞處于熒光陰性的區(qū)域，死菌懸液的結(jié)果顯示，一群大小一致的細(xì)菌(92.15%)處于熒光強(qiáng)度很高的區(qū)域，表示大多數(shù)細(xì)菌已死亡，見圖2。

注：A表示活菌懸液；B表示死菌懸液。

圖2活菌懸液和死菌懸液FS-PI雙參數(shù)熒光圖

2.3不同濃度抗菌藥物作用細(xì)菌FCM檢測結(jié)果當(dāng)抗菌藥物敏感菌株在各藥物濃度作用后，隨藥物濃度成倍增加，F(xiàn)S-SS圖中PI陰性區(qū)域內(nèi)細(xì)胞漸少，PI熒光陽性區(qū)細(xì)胞漸多,如圖3。而抗菌藥物耐藥菌株在各個(gè)藥物濃度作用后，隨藥物濃度增加，F(xiàn)S-SS圖中PI陰性區(qū)域內(nèi)細(xì)胞減少并不明顯，如圖4。

圖3　　敏感菌株經(jīng)抗菌藥物作用后PI%

圖4　　耐藥菌株經(jīng)抗菌藥物作用后PI%

2.4FCM藥敏試驗(yàn)MIC判斷值的設(shè)定分別檢測大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)菌株不加抗菌藥物陰性對照活菌和已知MIC濃度抗菌藥物作用細(xì)菌的PI%，據(jù)此結(jié)果，將PI%逐漸增高達(dá)到80%以上時(shí)的藥物濃度判為MIC值，表明該菌株對藥物敏感。若被測菌株P(guān)I%值不隨藥物濃度增加而明顯上升，說明其MIC值大于試驗(yàn)藥物的最高濃度，則可判為菌株耐藥[6-7]。

2.5常規(guī)藥敏試驗(yàn)與FCST結(jié)果比較本文用常規(guī)方法和FCST雙盲法對臨床分離的66株鮑曼不動(dòng)桿菌分別檢測MIC，用χ2檢驗(yàn)比較FCST與微量稀釋法、VITEK儀檢測判斷的敏感性結(jié)果，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1　　FCST與常規(guī)方法檢測耐藥性的情況(n=66,n)

注：與微量稀釋法比較，*P>0.05；與VITEK儀檢測比較，#P>0.05。

3　討　　論

鮑曼不動(dòng)桿菌原本是一種自然界廣泛存在的條件致病菌，但隨著近年來廣譜抗菌藥物的廣泛使用和抗菌藥物選擇性壓力的不斷增加，它逐漸成為了機(jī)會(huì)感染和醫(yī)院感染的主要菌種之一。多中心研究已表明，鮑曼不動(dòng)桿菌是目前引起醫(yī)院感染的重要病原菌之一[8]。許多醫(yī)院出現(xiàn)鮑曼不動(dòng)桿菌分離率逐年上升，尤其多重耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌，已成為醫(yī)院內(nèi)感染暴發(fā)流行的重要病原菌，是重癥監(jiān)護(hù)病房及老年患者呼吸道感染的主要致病菌之一[9-10]。

抗菌藥物體外藥敏試驗(yàn)是指導(dǎo)臨床合理進(jìn)行抗感染治療的重要依據(jù)，但微量稀釋法等常規(guī)檢測方法通常需要20 h以上，耗時(shí)較長。而引起感染的鮑曼不動(dòng)桿菌往往多重耐藥，對于這類菌株常規(guī)藥敏檢測不僅周期長，而且受試驗(yàn)藥物有限，往往不能滿足臨床需要，給臨床治療帶來很大困難。FCM能夠?qū)?xì)胞(或微粒)的生物學(xué)性狀及功能狀態(tài)進(jìn)行快速、大量地定性或定量檢測，在細(xì)胞研究上應(yīng)用廣泛。近年來，有研究將FCM用于細(xì)菌檢測，F(xiàn)CST也逐漸得到了研究和發(fā)展[11]。建立一種FCM快速檢測鮑曼不動(dòng)桿菌MIC的方法可以為臨床選擇抗菌藥物提供快速、準(zhǔn)確的參考，并且可以擴(kuò)大藥敏試驗(yàn)抗菌藥物選擇的范圍，為臨床合理應(yīng)用抗菌藥物更好地提供參考。此外，建立該檢測方法具有加強(qiáng)對多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌監(jiān)測的意義。

經(jīng)抗菌藥物處理后的細(xì)菌，以PI等特定的熒光染料染色，并通過FCM檢測熒光強(qiáng)度，可以判斷其存活狀態(tài)，進(jìn)而推斷MIC。PI屬于膜非滲透性熒光染料，價(jià)格較低，是FCST檢測理想的熒光染料。PI相對分子質(zhì)量較大，正常情況下不能進(jìn)入細(xì)胞膜完整的活細(xì)菌體內(nèi)，然而當(dāng)細(xì)胞受損害或壞死、外膜完整性破壞，PI即可進(jìn)入細(xì)胞、嵌入到DNA的堿基對中，并且熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。本研究選擇PI作為熒光染料對66株鮑曼不動(dòng)桿菌進(jìn)行FCST檢測，并與常規(guī)方法進(jìn)行比較。藥物敏感細(xì)菌因受抗菌藥物作用而損傷或壞死，導(dǎo)致細(xì)胞膜缺損，可被PI染色。PI進(jìn)入菌細(xì)胞內(nèi)嵌入細(xì)菌DNA中。FCM檢測時(shí)，PI在激光的激發(fā)下可發(fā)出紅色熒光(激發(fā)光譜300～380、440～580 nm，發(fā)光光譜560～680 nm)。本研究使用EPICS-XL型流式細(xì)胞儀，激發(fā)光為488 nm的氬離子激光，儀器中第3個(gè)光電倍增管能檢測PI發(fā)出的熒光信號(hào)(FL3)。既往研究多采用MFIx推斷MIC來反映細(xì)菌對藥物的敏感性。但培養(yǎng)基中顆粒狀物質(zhì)熒光干擾、儀器工作狀態(tài)等多種因素均可影響MFIx，使其欠穩(wěn)定。本試驗(yàn)選擇檢測細(xì)菌在抗菌藥物作用后PI%的變化來推斷MIC、判斷細(xì)菌對藥物的敏感性。結(jié)果顯示，所有66株被檢鮑曼不動(dòng)桿菌的藥敏結(jié)果與微量稀釋法及臨床使用的VITEK儀檢測結(jié)果完全一致。常規(guī)藥敏試驗(yàn)細(xì)菌與藥物共同孵育培養(yǎng)20 h以上才能判讀結(jié)果，而FCST不依賴細(xì)菌大量繁殖，僅需5 h左右即可獲得結(jié)果，大大縮短了試驗(yàn)時(shí)間。并且，由于被測菌與藥物共同孵育時(shí)間較短，藥敏結(jié)果不易受抗菌藥物誘導(dǎo)耐藥的影響。此外，由于是通過流式細(xì)胞儀逐個(gè)測定藥物對采集的菌細(xì)胞個(gè)體生長的影響、了解細(xì)菌的存活狀態(tài)，F(xiàn)CST還可以檢測到細(xì)菌群體中具有藥敏異質(zhì)性的菌細(xì)胞。本試驗(yàn)表明，F(xiàn)CST用于鮑曼不動(dòng)桿菌體外抗菌藥物藥敏檢測具有快速、敏感的優(yōu)點(diǎn)。

FCST精確、客觀，便于自動(dòng)化和標(biāo)準(zhǔn)化。近年來隨著國內(nèi)FCM在臨床檢驗(yàn)多個(gè)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，相信該技術(shù)在快速細(xì)菌藥敏試驗(yàn)方面也將發(fā)揮其應(yīng)有價(jià)值。

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Preliminary study on the sensitivity test of Acinetobacter baumannii in vitro by flow cytometry

ZHAOXuhong,SHENJuying,CAIHuiping,CHENLuyi,LIZhi,XULong△

(DepartmentofClinicalLaboratory,YangpuHospital,TongjiUniversity,Shanghai200090,China)

ObjectiveTo investigate the clinical application significance of flow cytofluroometric(FCM) antibiotic susceptibility test for A.baumannii in vitro.MethodsThe sensitivity to Ampicillin/Sulbactam,Levofloxacin,Meropenem,Cefotaxime of an Escherichia coli standard strain and 66 isolates of A.baumannii were tested with FCM by using propidium iodide as a fluorescent probe.The survival rates of the bacteria in the culture after treatment with different dosages of the antibiotics were determined according to the fluorescence strength.The MIC value of the antibiotics against the 66 strains were judged with FCM,compared with microdilution and VITEK methods.ResultsThe antibiotic resistant strains number of sultamicillin,levofloxacin,meropenem and cefotaxime sodium were 35,30,13 and 38 respectively in flow cytofluorometric antibiotic sensitivity test(FCST) of 66 strains of A.baumannii.There was no significant difference(P>0.05) compared with the antibiotic susceptibility results by the methods of VITEK instrument and microdilution by measuring withχ2test respectively.ConclusionThe established method of FCST for A.baumannii is suitable for dectecting bacterial drug-sensitivity,which is more rapid,accurate and objective.

flow cytofluorometric antibiotic test(FCST);acinetobacter baumannii;sultamicillin;levofloxacin;meropenem;cefotaxime

趙旭鴻，女，主管技師，主要從事臨床實(shí)驗(yàn)室診斷研究。△

,E-mail：ypxulong@163.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.18.019

A

1673-4130(2016)18-2555-03

2016-03-14

2016-05-22)