谷洋洋, 劉 冰, 杜 虹, 張允允, 秦 松

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高純度藻膽蛋白的分離純化研究進展

谷洋洋1, 劉 冰2, 杜 虹1, 張允允2, 秦 松2

(1. 汕頭大學理學院生物系, 廣東汕頭 515041; 2. 中國科學院煙臺海岸帶研究所, 山東煙臺 264003)

藻膽蛋白在食品、化妝品等領域中具有廣泛的應用前景, 同時也可以作為醫(yī)學研究中的熒光標記物和氧化應激疾病的潛在治療藥物。高純度藻膽蛋白的分離純化一直是國內(nèi)外的研究熱點。目前, 藍藻中的螺旋藻和紅藻中的微藻紫球藻是研究較多的材料, 龍須菜近年來的廣泛種植, 擴大了原材料的來源。藻膽蛋白的粗提主要是由物理破碎和化學沉淀組成, 破碎的方法因原料的不同而具有一定的差異。高純度的藻膽蛋白獲取主要是通過離子交換, 疏水層析等方法, 這些方法耗時長, 回收率低; 雙水相萃取, 利凡諾沉淀, 殼聚糖和活性碳吸附沉淀為人們分離純化藻膽蛋白提供了新的思路。

藻膽蛋白; 提取原料; 粗提; 分離純化

藻膽蛋白(phycobiliprotein, PBP)是除葉綠素a之外的另一類光合色素蛋白, 存在于藍藻、紅藻、隱藻和少數(shù)甲藻中。根據(jù)藻膽蛋白紫外吸收光譜的特點藻膽蛋白可以分為三類: 藻藍蛋白(phycocyanin, PC, λmax610~620 nm), 別藻藍蛋白(allophycocyanin, APC, λmax650~655 nm)和藻紅蛋白(phycoerythrin, PE, λmax540~570 nm); 通常PE根據(jù)來源和光譜特性的不同又可分為B-PE, R-PE和C-PE[1]。藻膽蛋白是由脫輔基蛋白和以四毗咯為基本結(jié)構(gòu)的幾種色基組成, 其蛋白部分是一類寡聚蛋白, 基本構(gòu)建單位是和亞基, 在PE中還存在少量的亞基[2]。藻膽蛋白在光合作用中作為捕光色素系統(tǒng)進行吸收和傳遞能量, 在藻體細胞中還作為儲存蛋白能夠使藻類在氮源缺乏的季節(jié)得以生存[3]。

藻膽蛋白作為一種水溶性的色素蛋白, 用途極為廣泛。一般合成的著色劑具有毒性和致癌等不安全因素, 因此藻膽蛋白做為天然色素可以廣泛應用于食品工業(yè)(糖果、口香糖、冰激凌、乳制品、軟飲料、芥末醬等), 在亞洲一些國家藻膽蛋白也被用于化妝品行業(yè)(眼臉膏、眼線膏、口紅); 藻膽蛋白尤其是PE具有吸收系數(shù)大, 熒光量子產(chǎn)率高, 斯托克位移寬, 穩(wěn)定性強等特性常做為熒光試劑應用于生物醫(yī)學分析(流式細胞儀、熒光活細胞分選、熒光免疫分析、熒光顯微鏡等)[4-6]; 同時藻膽蛋白還是一種重要的生理活性物質(zhì), 如抗氧化, 抗腫瘤, 抗病毒, 提高人體免疫力等[7-14](如表1), 可制成食品和藥品用于醫(yī)療保健上; 此外, 藻膽蛋白也是一種最具有開發(fā)潛力的光敏劑, 可介導腫瘤光動力學治療等[15]。

表1 藻膽蛋白生理特性和機制

Tab.1 Physiological property and mechanisms of phycobiliprotein

注: 此表是根據(jù)Eriksen等[7]修改后的表

藻膽蛋白在不同領域應用時對其純度(Aλmax/ A280)要求不同[16-17], 一般純度大于0.7是食品級, 大于3.0是醫(yī)藥級, 大于3.9是反應級, 試劑級大于4.0。藻膽蛋白在不同領域中應用時, 因其純度要求不同, 所以藻膽蛋白的價格也不盡相同。2014年Sigma公司生產(chǎn)的試劑級R-PE的價格為1572.48元/mg, APC的價格為1233.76元/mg; C-PC(A620/A280>3.5)的價格為1590.03元/mg?；谠迥懙鞍纵^強的生理活性和熒光特性, 以及在其強大的經(jīng)濟利益驅(qū)動下, 使藻膽蛋白尤其高純度的藻膽蛋白分離純化方法成為國內(nèi)外研究的熱點。

本文主要基于近年來已發(fā)表的文獻對高純度藻膽蛋白的分離純化方法的研究進行了綜述, 以期為讀者提供一個完整的有關藻膽蛋白分離純化發(fā)展趨勢的構(gòu)架。

1 高純度藻膽蛋白的制備

用于分離純化藻膽蛋白的材料很多, 它們在細胞結(jié)構(gòu), 藻膽蛋白種類和含量等方面差別很大, 以至今日都沒有形成一個標準的方法來分離純化藻膽蛋白[5]。一般藻膽蛋白的分離純化流程為三步(圖1), 首先是植物組織體的破碎, 浸提獲得粗提液; 其次是粗提, 此步主要為進一步的分離純化做準備; 最后就是分離純化制備出高純度的藻膽蛋白。

1.1 提取原料

目前, 分離純化比較多的藻膽蛋白主要為來自于藍藻中的PC, APC及來自紅藻中R-PE和B-PE; 藍藻中的螺旋藻和紅藻中的微藻紫球藻是研究較多的材料[1, 18]。

螺旋藻自20世紀80年代初引入我國, 經(jīng)過近30年的快速發(fā)展, 在我國螺旋藻養(yǎng)殖業(yè)已占據(jù)重要地位; 我國的沿海大部分地區(qū)和部分內(nèi)陸地區(qū)都有大規(guī)模的螺旋藻養(yǎng)殖基地。張學成等[19]統(tǒng)計我國螺旋藻養(yǎng)殖面積約750萬m3, 養(yǎng)殖基地多達60余家, 年產(chǎn)量高達9600 t, 經(jīng)濟價值約40億元。螺旋藻當中生物活性物質(zhì)含量多且比較豐富, 干細胞中蛋白質(zhì)的含量達到50%以上, 其中藻藍蛋白占10%~15%, 這為人們提取PC提供了充足的原材料。除此之外, Miyamoto等[20-23]利用,,,等來分離純化藻藍蛋白; Parmar等[24-27]從sp.A32DM,sp. KC45,和sp.中分別分離純化得到了高純度的C-PE。紅藻作為提取PE的主要原材料, 在我國也有廣泛的種植。紫球藻是我們分離純化PE的理想材料, 但其目前在我國還沒有取得大規(guī)模的種植; 而紅藻中的龍須菜在我國具有廣泛的種植。自2000年, 張學成等[28]選育的國家水產(chǎn)新品種“龍須菜良種981”在廣東汕頭南澳島示范栽培獲得成功以來, 龍須菜栽培面積不斷擴大, 目前南澳龍須菜養(yǎng)殖已形成規(guī)模化, 平均達到5kg/m2, 養(yǎng)殖周期從原產(chǎn)地春秋兩季各45天延長至5個月以上。全國龍須菜的栽培面積超過1.3萬hm2, 年產(chǎn)量15萬t干品, 成為繼海帶和紫菜之后第三大海藻栽培業(yè), 這為大規(guī)模分離純化PE提供了可能。Rossano等[29-31]從和等紅藻中也分離純化得到高純度的R-PE。

Zhao等[32]利用裂解酶(PecE和PecF)催化體外重組的藻藍蛋白亞基與藻藍膽素結(jié)合, 獲得了具有熒光特性的重組亞基。這使得轉(zhuǎn)基因和酶催化相結(jié)合的方法生產(chǎn)具有熒光活性的藻膽蛋白成為可能, 此方法為獲取藻膽蛋白提供了新的來源。

1.2 藻膽蛋白的粗提

藻膽蛋白是水溶性的胞內(nèi)蛋白, 要獲得高純度、高回收率的藻膽蛋白, 對藻體的破碎顯得尤為重要。目前用于藻體破碎的方法主要是物理法破碎。Gantar等[21-22, 33-36]將藻體在–20℃和4℃到30℃之間進行反復凍融, 此方法利于蛋白溶出并且易于放大。Liao等[37-41]利用超聲波破碎的方法對藻體進行破碎, 發(fā)現(xiàn)可以大大提高藻膽蛋白的溶出率, 但此方法不利于大規(guī)模制備藻膽蛋白, 并且生產(chǎn)的過程會產(chǎn)生熱量, 這對藻膽蛋白活性有很大影響, 應用范圍有限。Patil等[42]利用從滲透壓破碎法破碎, 該操作簡單, 是比較理想的細胞破碎法, 但該方法對處理的樣品有要求, 一般大型藻類很難直接運用此方法對藻體進行破碎。除此之外, 還有液氮研磨破碎等方法。上述方法都有一定的局限性, 實際生產(chǎn)中, 常常幾種方法經(jīng)常混合使用, 以最大的限度破碎使藻膽蛋白溶出。

破碎后的藻體按一定的物料比與不同的提取液混合浸提獲得藻膽蛋白的粗提液。由于此粗提液里常含有其他蛋白和多糖等成分, 一般在傳統(tǒng)的藻膽蛋白分離純化前多先經(jīng)過粗提, 傳統(tǒng)的粗提方法有(NH4)2SO4鹽析, 丙酮沉淀等[26], 進年還來出現(xiàn)了利凡諾沉淀, 殼聚糖和活性碳吸附等新方法處理粗提液[33, 41-49], 為下進一步的分離純化做準備。

1.3 藻膽蛋白的分離純化

1.3.1 傳統(tǒng)分離純化藻膽蛋白的方法

對于不同藻類藻膽蛋白的分離純化方法有很多種(表2), 傳統(tǒng)上都是通過數(shù)次的羥基磷灰石柱層析結(jié)合離子交換層析或凝膠過濾層析來進行的。

表2 不同藻類的藻膽蛋白分離純化方法比較

注: 1、細胞破碎(Cell disruption, CD): 液氮研磨(CD1), 超聲波破碎(CD2), 反復凍融(CD3), 滲透壓破碎法(CD4); 2、抽提(Extraction, E): 緩沖液(E1), 雙水相萃取(E2), 水抽提(E3); 3、沉淀(Precipitation, P): (NH4)2S04鹽析(P1), 利凡諾沉淀(P2), 丙酮沉淀(P3); 4、雜質(zhì)吸附(Impurity adsorption, A): 活性碳吸附(A1), 殼聚糖吸附(A2); 5、濃縮(Concentration, C): 透析(C1), 膜超濾(C2); 6、色譜層析(Chromatography, CH): 離子交換色譜(CH1), 凝膠層析(CH2), 膨脹床吸附層析(CH3), 羥基磷灰石層析(CH4), 疏水層析(CH5)

Miyamoto等[20]通過硫酸銨鹽析并結(jié)合羥基磷灰石柱層析對中的PC進行純化, 獲得了純度超過大于4.0的PC; Liu等[31]用DEAE-Sepharose FF進行PH梯度洗脫(pH 5.6~4.0), 最終獲得藻紅蛋白的純度達到5.6, 回收率達到67.33%。Mishra等[27]利用兩步色譜技術分離純化假魚腥藻中的C-PE, 首先將粗提液用硫酸銨分級鹽析(25%~60%); 然后用Sephadex G-150層析柱(35cm× 1 cm, 柱床高25cm)分離, 收集樣品; 最后用DEAE- cellulose層析柱進行NaCl(0~0.5 mol/L)梯度洗脫, 洗脫速度為0.5 ml/min獲得的藻紅蛋白純度為6.8, 回收率為46%。膨脹床吸附技術也常常被用于分離純化藻紅蛋白, Bermejo等[49]探究了膨脹床結(jié)合離子交換技術對螺旋藻藻藍蛋白分離純化的效果, 并在不同水平上進行了研究; 在實驗室水平上, 其能夠獲得純度大于4.0, 回收率為69%的藻藍蛋白, 在中試水平上, 生產(chǎn)出來的藻藍蛋白純度大于4.0, 回收率為59%。

目前, 使用羥基磷灰石柱層析分離時間長, 易使蛋白變性; 而離子交換柱雖然成本高, 但有處理量大, 分離時間短, 效果好等特點; 膨脹床吸附層析技術兼有流化床和填充床層析的優(yōu)點, 不需預先除去料液中的顆粒而可以直接從料液中吸附目標產(chǎn)物?，F(xiàn)多采用一步離子交換層析法, 并且常常是其他分離方法與離子交換相結(jié)合。

文獻中報道的藻膽蛋白常用提純方法在實際工業(yè)化生產(chǎn)過程中存在操作步驟復雜, 動力能耗高以及操作周期長等缺點; 據(jù)文獻報道, 分離純化的成本占產(chǎn)品成本的50%~90%[43], 此外, 由于步驟過多而導致產(chǎn)量損失大, 通常每增加一步層析過程目標蛋白就會減少20%, 這對工業(yè)化生產(chǎn)來說成本無疑是十分昂貴的。因此, 一種高效, 經(jīng)濟, 易于放大的分離純化方法對于生產(chǎn)高純度和高回收率的藻膽蛋白來說是十分必要的。

1.3.2 新型分離純化藻膽蛋白的方法

隨著技術的進步, 近年來出現(xiàn)了一些分離純化藻膽蛋白的新方法, 如: 雙水相萃取法分離純化藻膽蛋白具有操作步驟少, 時間短, 回收率高等優(yōu)點, 分離純化的同時還能使藻膽蛋白在一相中濃縮, 因此, 近年該方法獲得了許多學者的青睞。

Patil等[16, 43]采用12.28%的聚乙二醇和11.63%的磷酸鉀緩沖液形成的雙水相體系對藻膽蛋白進行分離, 研究發(fā)現(xiàn), 在PH 7.2時萃取C-PC, 一次萃取后, 其純度從3.96提高到5.22, 經(jīng)雙水相萃取的C-PC再經(jīng) DEAE-Sephadex 離子交換柱純化, 達到6.69。對雙水相萃取過程進行放大, 提取的C-PC純度為5.22, 回收率為66%, 證實了該方法具有現(xiàn)實可行性。后來, Patil等[40]研究了雙水相結(jié)合膜超濾技術分離純化新鮮螺旋藻的藻藍蛋白, 在PEG4000/磷酸鉀雙水相體系中, 當系線長度為18.64%, 相比1.45時, 藻藍蛋白的純度由起始是的1.18 達到3.23, 別藻藍蛋白純度由0.41 升到0.74; 在經(jīng)過三步萃取后藻藍蛋白的純度達到了4.02, 最后作者利用膜超濾技術除鹽, 不僅將鹽除去, 而且別藻藍蛋白的純度由0.74升到了1.5, 回收率分別達到78.58%和51.73%。劉楊等[50]利用磷酸鉀-PEG6000雙水相體系同時分離純化APC和PC, 在pH 7.0系線長度為34%的時候, PC和APC的純化系數(shù)分別為10.64和0.57, 此方法可以同時達到分離PC和APC的目的。

雙水相萃取技術具有原料豐富廉價、溶劑黏度小、易回收、傳質(zhì)和分相速度快、操作簡單、設備要求低、節(jié)約能耗等優(yōu)點, 已經(jīng)在眾多領域展現(xiàn)出工業(yè)化前景。但目前該技術在藻膽蛋白提純的工業(yè)化中還沒有被廣泛利用, 阻礙雙水相萃取技術走向工業(yè)化的最大問題是構(gòu)成雙水相成相組分的價格昂貴。隨著對雙水相體系研究的不斷深入, 性能優(yōu)良的新型成相物質(zhì)不斷發(fā)現(xiàn)以及相關技術的發(fā)展, 雙水相萃取技術必將在生物下游產(chǎn)業(yè)中起到越來越重要的作用[51]。

除了雙水相萃取之外, 利凡諾沉淀, 殼聚糖和活性碳吸附沉淀也為人們分離純化藻膽蛋白提供了新的思路。Minkova等[41]在細胞破碎液中加入利凡諾試劑反復沉淀重復4次得純度為3.90的C-PC。Minkova等[21]后來對該方法還對該法進行改良, C-PC最終純度達4.52, 回收率為55.00%。Gantar等[33]向獲得的粗提液中加入活性炭和殼聚糖, 離心獲得的C-PC溶液純度為3.60, 隨后對C-PC溶液進行鹽析和超濾最終純度達到4.30, 含量占干重的8.00%。

利凡諾沉淀, 殼聚糖和活性碳吸附沉淀分離純化藻膽蛋白能避免層析純化過程中的繁雜步驟, 提高了純化效率, 而且產(chǎn)量高, 成本低, 易于擴大。

2 展望

藻膽蛋白是一種具有廣泛用途的活性物質(zhì), 當前藻膽蛋白的應用正由食品, 化妝品行業(yè)逐漸延伸到醫(yī)學診斷, 光療和藥物領域中去。現(xiàn)已有公司在從事與藻膽蛋白相關的生產(chǎn), 2008年, Sekar和Chandramohan兩家公司就已經(jīng)有了297項與藻膽蛋白有關的專利[52]。我國擁有豐富的螺旋藻和龍須菜等海藻植物資源, 這為藻膽蛋白的來源提供豐富的原材料。但藻膽蛋白的分離純化過程較為繁雜, 回收率低, 耗時長, 目前還沒有一種高效的分離純化方法應用到高純度藻膽蛋白的純化中去, 這使得高純度藻膽蛋白的大范圍使用受到了很大的限制, 如何開發(fā)出短時高效, 純度高和回收率高的提取純化技術仍然是今后研究的重點。

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The research progress on isolation and purification of high- purified phycobiliprotein

GU Yang-yang1, LIU Bing2, DU Hong1, ZHANG Yun-yun2, QIN Song2

(1. College of science, Shantou University, Shantou 515041, China; 2. Yantai institute of Coastal Zone Research, Chinese Academy of Sciences, Yantai 264003, China)Received：Oct. 12, 2015

phycobiliprotein; raw material; crude extract; isolation and purification

Phycobiliprotein has promising applications in nutrient ingredient and natural color for food and cosmetics. It is also used as potential therapeutic agent in oxidative stress-induced diseases and as fluorescent markers in biomedical research. Recently, more and more reseachs are concentrated on isolation and purification of high-purified phycobiliprotein. Currently,andare used primarily to extract phycobiliprotein. The extensive cultivation ofexpanded the sources of raw materials. Crude extract of phycobiliprotein is used by physical fragmentation and chemical deposition. Several methods have been developed for purification of phycobiliprotein such as ion exchange chromatography and hydrophobic interaction chromatography. However, theses methods are time consuming and the recovery of phycobiliprotein is low. Aqueous two phase extraction, rivanol precipitation, chitosan-active carbon adsorption and precipitation are the potential purification techniques.

Q949.2

A

1000-3096(2016)07-0170-08

10.11759/hykx20121216001

2015-10-12;

2016-03-09;

海洋公益性行業(yè)科研專項經(jīng)費資助(200905021, 201105008-9, 201205027); 廣東省中國科學院全面戰(zhàn)略合作項目(2011A090100040)

[Foundation: Public Science and Technology Research Funds Projects of the Ocean, No.200905021, No.201105008-9, No.201205027; Guangdong province comprehensive strategic cooperation project of the Chinese Academy of Sciences, No. 2011A090100040]

谷洋洋(1986-), 男, 安徽阜陽人, 碩士研究生, 主要從事海洋天然活性物質(zhì)研究, 電話: 15914795189, E-mail: yygu-1022@126.com; 秦松,通信作者, 山東萊州人, 研究員, 博士, 主要從事海岸帶生物技術研究, E-mail: sqin@yic.ac.cn.

(本文編輯: 梁德海)