李　明　張龍杰　石　萌　林小明　王開榮　鄭新強　陸建良　梁月榮*

(1.余姚市林業(yè)特產技術推廣總站，余姚 315499； 2.寧波黃金韻茶業(yè)科技有限公司，余姚 315400；3.浙江大學茶葉研究所，浙江 杭州 310058； 4.寧波市森林病蟲防治檢疫站，寧波 315000)

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光照敏感型新梢白化茶新品種‘御金香’春梢化學成分研究

李明1張龍杰2石萌3林小明3王開榮4鄭新強3陸建良3梁月榮3*

(1.余姚市林業(yè)特產技術推廣總站，余姚 315499； 2.寧波黃金韻茶業(yè)科技有限公司，余姚 315400；3.浙江大學茶葉研究所，浙江 杭州 310058； 4.寧波市森林病蟲防治檢疫站，寧波 315000)

用HLPC法檢測了光照敏感型新梢白化茶品種‘御金香’春梢生物堿、兒茶素類、氨基酸類和光合色素類化合物含量，并以溫度敏感型新梢白化茶品種‘白葉1號’和常規(guī)茶樹品種‘福鼎大白茶’為對照。結果顯示，‘御金香’咖啡堿和可可堿含量顯著高于‘福鼎大白茶’和‘白葉1號’；兒茶素類總含量顯著低于‘福鼎大白茶’和‘白葉1號。光照敏感新梢白化茶‘御金香’和溫度敏感型新梢白化茶‘白葉1號’的氨基酸含量顯著高于‘福鼎大白茶’，但葉綠素a和葉綠素b、β-胡蘿卜素、黃體素和新黃質等光合色素含量顯著低于‘福鼎大白茶’。‘御金香’呈現黃色葉片的白化現象主要是因為葉綠素含量低，而并非類胡蘿卜素含量高所致。

茶樹；光照敏感；品質成分; 新梢白化；葉綠素；類胡蘿卜素

茶樹新梢白化品種有光照敏感型和溫度敏感型兩大類[1-2]。‘御金香’是光照敏感型新梢白化茶品種之一[3]，在強光照條件下新梢葉片因缺乏葉綠素而呈現黃白色；其特點與其它新梢白化茶品種一樣，具有多酚類含量適中，氨基酸含量高，加工綠茶滋味鮮爽醇和，是開發(fā)名優(yōu)綠茶的有優(yōu)良品種[4-5]。雖然‘御金香’品種對夏季高溫強光的抵御能力明顯高于同類品種的‘黃金芽’，但其幼苗期仍然存在光合作用能力較弱，新建茶園移栽初期對管理要求高等問題[6-7]。針對‘御金香’茶樹品種的生物學特性，本研究以‘低溫誘導新梢白化茶品種‘白葉1號’和常規(guī)茶樹品種‘福鼎大白茶’為參照，分析比較春季一芽二葉新梢的生物堿、兒茶素類、氨基酸類和光合色素類化合物含量，以期進一步了解‘御金香’品種的化學特性，分析光照敏感型新梢白化茶品種產生白化現象的生物化學機理；同時為開發(fā)‘御金香’茶樹品種的配套栽培技術措施提供依據。

1　材料和方法

1.1實驗材料

供試茶樹品種為寧波黃金韻茶業(yè)科技有限公司茶園的3年生光照敏感型新梢白化茶品種‘御金香’、對照品種為同期移栽的溫度敏感型新梢白化茶品種‘白葉1號’和常規(guī)茶樹品種‘福鼎大白茶’。于2016年4月18日采摘一芽二葉新梢，然后將樣品分成兩部分，一部分用于茶葉品質成分(生物堿、兒茶素類、氨基酸類化合物)測定，用700W微波爐高溫殺青30秒，在80℃烘12 h至干燥，用植物粉碎機粉碎并過24目篩，4℃冷藏備用；另一部分用于光合色素類檢測，冷凍于液氮中取回實驗室保存于-70℃?zhèn)溆谩z測時測定茶葉含水量，方法是110℃恒重法[8]。

1.2生物堿和兒茶素類測定

將上述磨碎樣(0.15 g)置于放有25 mL 50%酒精溶液的50 mL離心管并蓋緊，在70℃恒溫水浴提取30min，期間每隔每10 min振搖一次；提取完成后取出冷卻至室溫，在4℃和15984 ×g離心10 min，吸取上清液用于HPLC檢測。

生物堿和兒茶素類含量檢測使用本研究室開發(fā)的HPLC法，儀器為‘島津’LC-20AD型HPLC，色譜柱為‘安捷倫’TC-C18(5 μm，4.6×250 mm)。HPLC條件：進樣量10 μL，柱溫35℃；流動相有A、B兩種，A為乙腈/乙酸/水 (6/1/193，v/v/v)， B為乙腈/乙酸/水(60/1/139，v/v/v)；由80%A/20%B在35min內線性洗脫至35%A/65%B，流速1 mL/min；監(jiān)測波長為280 nm。根據3種茶葉生物堿和8種茶葉兒茶素類化合物標準品(SIGMA公司產品)的保留時間和峰面積分別定性和定量。圖1為‘御金香’生物堿和兒茶素類HPLC圖。

圖1　‘御金香’兒茶素類和咖啡堿HPLC

1.3氨基酸類化合物測定

柱前反應劑制備：以2,4二硝基氟苯(DNFB)為柱前反應劑，將DNFB (1.00 g)溶解于100 mL乙腈，保存于棕色瓶作為貯備液，用封口膜密封，4℃冷藏。

標準氨基酸試液制備：用0.1 M NaOH試劑溶解天冬氨酸、半胱氨酸和酪氨酸(5 mg/mL左右)；用0.1 M HCl試劑溶解谷氨酸、天冬酰胺、絲氨酸、組氨酸、蘇氨酸、精氨酸、脯氨酸、茶氨酸、丙氨酸、γ-氨基丁酸、甲硫氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、頡氨酸、谷氨酰胺和賴氨酸(5 mg/mL左右)；根據本研究室以往對茶葉氨基酸檢測發(fā)現的主要氨基酸取適量19種氨基酸以及茶氨酸儲備液混合后制成氨基酸混標，并依次稀釋成5個濃度梯度。

柱前反應：取上述茶葉提取液或者氨基酸標準物的混合標準液180 μL，加1%DNFB貯備液100 μL、0.5 M NaHCO3溶液100 μL(pH 9.0)、ddH2O 20 μL，封口膜密封，漩渦震蕩混勻，黑暗條件下60℃保溫1 h，冷卻至室溫；再加入0.01 M KH2PO4水溶液400 μL(pH 7.0)，搖勻后靜置15 min；經0.22 μm Millipak過濾器過濾，用于HPLC檢測。

HPLC檢測：檢測設備為‘島津’LC-20AD型HPLC，色譜柱為‘安捷倫’TC-C18(5 μm，4.6×250 mm)。HPLC條件：進樣量20 μL，柱溫35℃；流動相有A和B兩種，A為5 mM NaAc (pH 5.7)和四氫呋喃混合液(95/5，v/v)， B為甲醇和水混合液(80/20，v/v)，流速1 mL/min，按照表1所示梯度洗脫；監(jiān)測波長360 nm。

表1　氨基酸HPLC檢測梯度洗脫條件

1.4光合色素檢測

將冷凍鮮葉(0.20g)在研缽與0.10 g PVPP、10 mL預冷丙酮及其適量石英砂在冰浴上研磨，勻漿轉移至2 mL離心管在4℃和15984 ×g下離心10 min，上清液用于HPLC檢測。

檢測方法為HPLC法[9]，檢測設備是日本‘島津’LC-20AD型 HPLC，色譜柱為‘安捷倫’TC-C18(5 μm，4.6×150 mm)；HPLC條件：進樣量20 μL，柱溫35℃；流動相由A和B兩種組成，A為乙腈/乙酸/水混合液(6/1/193，v/v/v)，B為乙腈/甲醇/氯仿混合液(15/4/1，v/v/v)，線性梯度洗脫，最初20 min流動相B從80%線性增加至100%，保持15 min，隨后將B從100%在5 min內線性降低至80%；流動相流速1 mL/min；檢測波長440 nm。定性和定量用的色素標準品為葉綠素a、葉綠素b、β-胡蘿卜素、黃體素、新黃質、紫黃質(SIGMA公司產品)，根據標準物的保留時間和峰面積分別定性和定量。

1.5結果統(tǒng)計

本研究測試的樣本數n=2，以“算數平均數±標準差”表示測試結果；試驗樣本平均數分別與‘福鼎大白茶’和‘百葉1號’的平均數比較，采用T測驗法，P<0.05時，標示為差異顯著。

2　結果和討論

2.1生物堿和兒茶素類含量比較

在‘御金香’春梢中檢出咖啡堿、可可堿和茶堿3種生物堿，在‘白葉1號’和‘福鼎大白茶’中檢出咖啡堿和可可堿2種生物堿(表2)。三種生物堿的含量水平高低依次為：咖啡堿>可可堿>茶堿。品種間生物堿含量差異顯著，表現為‘御金香’的咖啡堿和可可堿含量顯著高于‘白葉1號’和‘福鼎大白茶’。在檢出的8種兒茶素類化合物中，EGCG含量最高，其次為EGC 和ECG，C和CG的含量最低，3個品種的趨勢相同(表2)。品種間比較時發(fā)現，‘御金香’的兒茶素類總含量顯著低于‘白葉1號’和 ‘福鼎大白茶’；從兒茶素類單體分析，‘御金香’的EGC顯著低于‘白葉1號’和 ‘福鼎大白茶’，EGCG與‘白葉1號’相當(表2)。說明‘御金香’總兒茶素類含量低的原因是因為EGC含量水平低所致。

表2　茶葉兒茶素類組成和咖啡堿含量比較 (mg/g)

*與‘福鼎大白茶’比較差異顯著(P<0.05)；Δ與‘白葉1號’比較差異顯著(P<0.05)；a：TC=Total catechins (兒茶素類總含量)；ND：未檢出。

2.2茶葉游離氨基酸類化合物含量比較

雖然用了19種氨基酸標準物進行鑒定，但在供試樣品中僅檢出9種游離氨基酸類化合物，其它未檢出氨基酸可能是因為含量太低的緣故。在檢出的氨基酸化合物中，茶氨酸含量水平最高，其次為谷氨酸和天門冬氨酸；γ-氨基丁酸含量最低，3個品種表現趨勢一致(表3)。氨基酸總含量是新梢白化茶品種‘御金香’和‘白葉1號’顯著高于常規(guī)品種‘福鼎大白茶’；從氨基酸組成方面分析，‘御金香’和‘白葉1號’的茶氨酸含量分別占氨基酸總含量的41.0%和42.1%，而‘福鼎大白茶’的該比例為46.7%?？赡苁且驗樾律野谆杵贩N的總氨基酸含量高，而茶氨酸卻不是按比例上升，以致茶氨酸占總氨基酸的比例低于常規(guī)品種。

表3　茶葉氨基酸類化合物組成比較(mg/g)

*與‘福鼎大白茶’比較差異顯著(P<0.05)；Δ與‘白葉1號’比較差異顯著(P<0.05)。

2.3光合色素含量比較

植物光合色素除了葉綠素a和葉綠素b以外，還有類胡蘿卜素，因為他們在光能捕獲和光淬滅中發(fā)揮作用。類胡蘿卜素又有含氧的葉黃素類(如黃體素、新黃質、紫黃質等)和不含氧的胡蘿卜素類(如α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素等)。不同光合色素對光輻射的吸收波長存在差異，葉綠素吸收紅光和藍紫光，類胡蘿卜素吸收藍紫光。不同植物由于生存環(huán)境不同，光合色素組成存在差異。一般蔭生植物葉片含有較高的類胡蘿卜素，有利于在弱光環(huán)境下吸收較多的藍紫光并轉遞給葉綠素進行光合作用，使其在弱光條件下仍然具有較高的光合作用能力。

在被測的茶葉光合色素中，葉綠素a含量最高，葉綠素b次之；紫黃質含量最低；β-胡蘿卜素、黃體素和新黃質居中(表4)。品種之間，‘御金香’和‘白葉 1號’的葉綠素a和葉綠素b、β-胡蘿卜素、黃體素和新黃質含量顯著低于‘福鼎大白茶’；‘御金香’的紫黃質含量顯著高于‘白葉1號’和‘福鼎大白茶’。該結果顯示，葉綠素含量低是導致‘御金香’和‘白葉1號’新梢葉片白化的根本原因?！鹣恪摩?胡蘿卜素、黃體素、新黃質和紫黃質等呈現黃色的色素含量高于‘白葉1號’，這就解釋了為什么兩類新梢白化茶樹品種中，溫度敏感型新梢白化茶‘白葉1號’葉色呈現白色，而光照敏感型新梢白化茶‘御金香’的葉色則是黃色的。葉色黃色的‘御金香’的β-胡蘿卜素、黃體素和新黃質含量或者類胡蘿卜素總含量仍然低于葉色綠色的常規(guī)品種‘福鼎大白茶’，說明‘御金香’的黃葉性狀主要是葉綠素含量低所致，并非因為類胡蘿卜素含量高造成。

植物生長需要捕獲光能進行光合作用合成碳水化合物，但光照強度如果高于植物光合作用的光飽和點時，植物有可能發(fā)生光抑制[10]，嚴重時使葉片升溫對植株造成傷害。此時植物體內的光合器官必須具有自衛(wèi)的功能，啟動其光保護機制，通過熱耗散途徑等散耗多余的光輻射，避免強光脅迫引起溫度上升造成的傷害[11]。類胡蘿卜素除了具有協助葉綠素捕光的功能以外，還在保護植物免受光脅迫傷害發(fā)揮特殊作用。如葉黃素類是結合于光系統(tǒng) 的捕光色素復合體(LHCⅡ)的一類色素[12]，其中黃體素可以直接行使熱耗散的功能[13]。表4顯示，‘御金香’的黃體素等含量明顯低于‘福鼎大白茶’，可能是其在夏季高溫強光條件下容易受到強光脅迫傷害的原因。為了提高光照敏感型新梢白化茶品種抵御夏季高溫強光的能力，在品種篩選中應該把類胡蘿卜素，尤其是葉黃素類含量作為篩選指標，培育黃體素等葉黃素含量高的品種，增強茶樹抗性，提高移栽成活率。

表4　茶葉色素類化合物含量比較 (μg/g，干重)

*與‘福鼎大白茶’比較差異顯著(P<0.05)；Δ與‘白葉1號’比較差異顯著(P<0.05)。

1王開榮,梁月榮,李明,張龍杰. 白化茶骨干親本及其家系種質性狀分析. 茶葉, 2015, 41: 130-132.

2王開榮,李明,張龍杰,梁月榮. 白化茶種質資源分類研究. 茶葉, 2015, 41: 126-129.

3王開榮,韓震,梁月榮,張龍杰,李明,王盛彬. 黃色白化茶樹新品種“御金香”選育研究. 中國茶葉, 2013(6)：24-25.

4李明,張龍杰,王開榮,梁月榮,沈立銘,王盛彬,陸建良.光照敏感型白化茶新品種“黃金芽”白化特性研究. 茶葉, 2008, 34: 98-101.

5韓震,王開榮,鄧隆,李明,張龍杰.白化茶樹新品系-黃金斑. 茶葉, 2013, 39: 125-126.

6王開榮,李娜娜,陸建良,鄭新強,梁月榮,韓震,張龍杰. 遮光對茶樹品種“黃金芽”葉片基因表達譜的影響. 茶葉, 2012, 38: 229-232.

7邵淑宏,王開榮,林晨,葉倩,梁月榮. 茶氨酸制備和檢測研究進展. 茶葉, 2009, 35:145-159..

8董尚勝,翁蔚,查森俊,童啟慶. 復火對杜仲茶品質成分的影響. 浙江大學(農業(yè)與生命科學版), 2000, 26(5)：571-572.

9Li NN，Yang YP，Ye JH，Lu JL，Zheng XQ，Liang YR.Effects of sunlight on gene expression and chemical composition of light-sensi-tive albino tea plant.Plant Growth Regulation，2016，78: 253-262.

10Anderson JM，Park YI，Chow WS.Photoinactivation and photoprotection of phtosystem Ⅱ in nature.Physiologia Plantarum，1997，100: 214-223.

11Niyogi KK.Photoprotection revisited: Genetic and molecular approaches.Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology，1999，50: 333-359.

12Ruban AV，Young AJ，Pascal AA，Horton P.The effects of illumination on the xanthophylls composition of thephotosystem-Ⅱ light-harvesting complexes of spinach thylakoid membranes.Plant Physiology，1994，104:227-234.

13Baroli I M，Do A D，Niyogi K K.Suppression of the light sensitivity of a zeaxanthin- and lutein-deficient mutant of Chlamydomonas reinhardtii: Zeaxanthin is sufficient for protection from high light stress.Photosynthesis Research，69(1-3): 24.

Chemical composition of spring shoots in light-sensitive albino tea cultivar ‘Yujinxiang’

LI Ming1，ZHANG Longjie2，SHI Meng3，LIN Xiaoming3，WANG Kairong4，ZHENG Xinqiang3，LU Jianliang3，LIANG YueRong3*

(1.General Station of Forestry Speciality Technology Extension of Yuyao City，Yuyao 315499;2.Ningbo Huangjinyun Tea Science and Technology Co.，Ltd，Yuyao 315400;3.Tea Research Institute，Zhejiang University，Hangzhou 310058;4.Prevention and Quarantine Station of Forest Diseases and Pests of Ningbo City，Ningbo 315010)

Contents of alkaloid，catechins，amino acids and photosynthetic pigments in spring shoots of light-sensitive albino tea cultivars ‘Yujinxiang’ were determined by HPLC，with a temperature-sensitive albino tea cultivar ‘Baiye-1’and a normal tea cultivar ‘Fudingdabai’ as controls.The results showed that the cultivar ‘Yujinxiang’ had significantly higher levels of caffeine and theobromine，but significantly lower level of catehicns than cultivars ‘Baiye-1’ and ‘Fudingdabai’.The light-sensitive albino cultivar ‘Yujinxiang’ and temperature-sensitive albino cultivar ‘Baiye-1’ had significantly higher level of amino acids，but significantly lower levels of chlorophylls (chlorophyll a and chlorophyll b) and carotenoid (β-carotene，lutein and neoxanthin) than the normal tea cultivar ‘Fudingdabai’.The phynotype with yellow leaves in light-sensitive albino tea cultivar ‘Yujinxiang’ was induced by significant decrease in chlorophylls，instead by increase in carotenoid.

Camelliasinensis; light sensitivity; quality related components; albino shoots; chlorophylls; carotenoid

2016-06-27

寧波市重大科技項目(2014C10008)和浙江省茶樹農業(yè)新品種選育重大科技專項(2012C12905)。

李明(1970年-)，高級工程師，從事茶葉技術推廣工作。*

yrliang@zju.edu.cn.

Q948.112+1；Q5

A

0577-8921(2016)03-146-04