張凱凱，陳興銀，楊 鵬，關 萍

(貴州大學生命科學學院，貴州 貴陽 550025)

?

不同濃度鎘脅迫對孔雀草DNA甲基化的影響

張凱凱，陳興銀，楊 鵬，關 萍

(貴州大學生命科學學院，貴州 貴陽 550025)

隨著人類活動、工業(yè)化發(fā)展進程的加快，重金屬污染對環(huán)境造成了嚴重危害。本研究通過盆栽試驗，利用甲基化敏感擴增多態(tài)性(MSAP)技術，對不同濃度鎘(Cd)脅迫下孔雀草(Tagetespatula)基因組DNA甲基化變化情況進行了分析研究。結(jié)果表明，經(jīng)0、50、250和500 mg·kg-1濃度Cd2+處理后，基因組MSAP比率分別為24%、30%、35%和41%，全甲基化率分別為20%、23%、25%和27%，這表明重金屬脅迫處理后，DNA總甲基化水平隨Cd2+濃度升高而呈上升趨勢；在DNA甲基化模式變化方面，50、250和500 mg·kg-1濃度脅迫下重新甲基化率分別為10%、10%和11%，重新甲基化為主要的甲基化變化模式。本研究可以為揭示重金屬脅迫對植物DNA甲基化變化規(guī)律及植物對重金屬脅迫耐受性機制提供理論參考。

孔雀草；Cd2+脅迫；DNA甲基化；MSAP技術

隨著人類活動的加劇，工業(yè)化發(fā)展進程加快，大量重金屬污染物進入環(huán)境中，其中以鎘(Cd)、砷(As)、鎳(Ni)、鉛(Pb)等重金屬污染為主。重金屬微量元素具有遷移性強且易富集等特點，因而能長時間滯留在環(huán)境中，對動、植物造成嚴重危害，同時給環(huán)境保護工作增加了難度。Cd是當今重金屬污染的主要元素之一，其污染面積大且毒性強，僅次于汞(Hg)[1-2]，對人類健康造成了嚴重影響，如致病、致癌、致畸等[3]。Cd不是植物生長發(fā)育所需的營養(yǎng)元素，但在含Cd土壤中易通過植物根部進入植物體內(nèi)；當植物所生長的土壤中Cd含量超過一定濃度時，便會在植物體內(nèi)累積并發(fā)生一系列活性氧反應，阻滯植物的生長發(fā)育，使得植物出現(xiàn)生長緩慢、植株矮小、葉片褪綠、產(chǎn)量降低等癥狀，有時甚至出現(xiàn)植株死亡的現(xiàn)象[4-5]。目前關于重金屬對植物的危害研究多停留在生理生化反應方面，較少涉及對植物遺傳物質(zhì)影響的研究。前人研究證實重金屬會對植物DNA等生物大分子造成損害，破壞DNA的分子構象、改變DNA特異性結(jié)合位點活性、造成DNA單雙鏈斷裂、姐妹染色單體交換、影響DNA與蛋白質(zhì)的相互作用[6-7]等，嚴重影響DNA的空間結(jié)構、基因的穩(wěn)定遺傳和DNA甲基化水平，同時在基因的表觀修飾調(diào)控方面也產(chǎn)生影響，還能遺傳給下一代，這對植物的生長發(fā)育和繁殖是不利的。

DNA甲基化是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)催化下，將S腺苷甲硫氨酸上的(SAM)甲基基團(-CH3)結(jié)合到DNA分子鏈上的過程[8]，其中甲基化合物主要在CpG位點發(fā)生，形成5-甲基胞嘧啶(5-mC)。DNA甲基化作為一種重要的表現(xiàn)遺傳修飾形式，在生物界普遍存在，是真核細胞調(diào)控基因表達、維持基因組穩(wěn)定從而確保植物正常生長發(fā)育的重要手段之一[9]。重金屬能顯著提高小麥(Triticumaestivum)和水稻(Oryzasativa)DNA甲基化的水平[10]。研究表明，植物在應對重金屬Cd脅迫時，基因組DNA甲基化水平和狀態(tài)會發(fā)生較大程度的動態(tài)變化，引起基因調(diào)控功能失常，影響植物的正常生長[11]。由于重金屬脅迫引起了玉米(Zeamays)DNA胞嘧啶甲基化不同程度的改變，使得葉片中蛋白質(zhì)的合成明顯受阻；同時鋅(Zn)對玉米幼苗的脅迫使得DNA甲基化升高，并且體內(nèi)激素含量明顯降低[12-13]。

甲基化敏感擴增多態(tài)性(MSAP)技術最初由Reyna-Lopez建立，是以擴增片段長度多態(tài)性(AFLP)的基礎上建立起來的分子標記技術[14]，采用能夠識別同一5’-CCGG-3’位點的同裂酶HapⅡ和MspⅠ消化基因組DNA，依據(jù)兩種酶對CCGG位點不同甲基化的敏感性差異來檢測CCGG位點的甲基化水平和模式[15]。HapⅡ和MspⅠ均可以識別未甲基化的CCGG位點，當CCGG位點內(nèi)部胞嘧啶發(fā)生雙鏈甲基化時，MspⅠ可以切割，而HapⅡ則可以切割外側(cè)胞嘧啶發(fā)生單鏈甲基化的CCGG位點，此外，對內(nèi)部胞嘧啶單鏈甲基化的CCGG位點，兩種酶也表現(xiàn)出一定的活性，而其它的甲基化形式則不能切割。

孔雀草(Tagetespatula)為菊科萬壽菊屬一年生草本植物，是目前花壇應用的主要花草之一[16]，從重金屬生理脅迫方面的研究表明，孔雀草對Cd具有很強的富集及抗性能力[17]，而關于重金屬Cd脅迫對孔雀草基因組DNA甲基化水平影響的研究，未見報道。本研究運用MSAP分子標記技術，分析孔雀草基因組DNA甲基化水平和模式隨不同濃度Cd脅迫處理的變化情況，以期為揭示重金屬脅迫對植物DNA甲基化變化規(guī)律及植物對重金屬脅迫耐受性機制提供理論參考。

1　材料與方法

1.1供試材料與植物培養(yǎng)

供試孔雀草種子采自貴陽市花溪區(qū)生態(tài)園。選取大小均一且飽滿的種子用75%酒精消毒3 min，蒸餾水沖洗數(shù)次，于光照培養(yǎng)箱中26 ℃蒸餾水浸泡催芽24 h，將種子播種于含500 g全營養(yǎng)土的15 cm口徑花盆中，每盆15粒種子，在光照培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，溫度控制在25～30 ℃。用蒸餾水進行澆灌培養(yǎng)，每天一次，水量以不滲出盆底為準。

1.2Cd脅迫處理

在播種完后，對土壤進行Cd脅迫，分別按50、250和500 mg·kg-1Cd2+濃度稱取CdCl2·2.5H2O，分別溶于適量蒸餾水中并澆灌土壤，每濃度處理設3個重復，以蒸餾水處理組作為對照組。脅迫處理時間為30 d。

1.3DNA提取與檢測

DNA提取采用天根公司的植物基因組DNA提取試劑盒提取，選取生長一致的真葉約200 mg提取基因組DNA。基因組DNA用TE溶解，DNA濃度用ThermoFisher公司的超微量紫外可見分光光度儀(NanoDrop2000)檢測，檢測結(jié)果OD(260/280)比值在1.80左右，DNA用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，保存于-20 ℃冰箱中作為后續(xù)試驗模板。

1.4MSAP分析

用EcoRⅠ/HapⅡ和EcoRⅠ/MspⅠ兩組酶，對不同Cd濃度處理的孔雀草基因組DNA分別進行雙酶切。其中分兩次對DNA進行酶切，EcoRⅠ酶切體系(40 μL)：4 μL 10×Buffer EcoRⅠ，1 μL EcoRⅠ(10 U·μL-1)，DNA模板30 μL(約300 ng)，5 μL ddH2O，充分混勻后37 ℃酶切4 h。HapⅡ或MspⅠ酶切體系(20 μL)：2 μL 10×BufferTango，0.25 μL HapⅡ(10 U·μL-1)或MspⅠ(10 U·μL-1)，10 μL EcoRⅠ酶切產(chǎn)物，7.75 μL ddH2O,充分混勻后37 ℃酶切5 h。

將酶切產(chǎn)物片段兩端分別接上與EcoRⅠ和HapⅡ/MspⅠ酶切產(chǎn)物互補的特異性接頭(表1)，接頭序列連接前需要進行變性退火，得到雙鏈接頭終濃度為5 pmol·μL-1(E)和50 pmol·μL-1(H/M)的接頭母液，連接體系(30 μL):3 μL 10×T4DNA Ligase buffer，EcoRⅠ和HapⅡ/MspⅠ接頭各1 μL，酶切產(chǎn)物20 μL，T4連接酶(5 U·μL-1)0.5 μL，4.5 μL ddH2O，充分混勻后22 ℃連接5 h，產(chǎn)物-20 ℃保存作為預擴增模板。

表1　MSAP反應接頭與引物Table 1　Sequence of adapters and primers in MSAP

預擴增反應體系(20 μL)：2 μL連接產(chǎn)物，2 μL的E-00及HapⅡ/MspⅠ-00預擴增引物(表1)，10 μL 2× PCR Master Mix，4 μL ddH2O，反應混合液輕輕混勻，預擴增反應程序為：94 ℃，2 min；(94 ℃，30 s；56 ℃，30 s；72 ℃，2 min)35 個循壞；72 ℃，10 min；4 ℃保存。將預擴增產(chǎn)物稀釋50倍用于選擇性擴增模板。

選擇性擴增反應體系(20 μL)：3 μL預擴增稀釋產(chǎn)物，2 μL選擇性擴增引物E+ANN(5 μmol·L-1)及H/M+TNN(5 μmol·L-1)(表1)，5 μL 2×PCR Master Mix，8 μL ddH2O，充分混勻反應液，擴增反應程序為：94 ℃，30 s；65 ℃，30 s，每個循環(huán)減少 0.7 ℃；72 ℃，2 min;13個循環(huán);(94 ℃，30 s；56 ℃，30 s；72 ℃，2 min)29 個循壞；72 ℃，10 min；4 ℃保存。

MSAP擴增產(chǎn)物用6%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，0.1%硝酸銀染色，拍照及條帶記錄；同一酶切位點條帶的有、無分別用1、0表示，最后對帶型統(tǒng)計分析。

2　結(jié)果與分析

2.1Cd2+脅迫處理對孔雀草基因組DNA甲基化水平的影響

MspⅠ和HapⅡ兩種酶都識別5′-CCGG-3′位點，利用與EcoRⅠ組成雙酶切組合對孔雀草總DNA進行切割。由于MspⅠ和HapⅡ兩種酶對CCGG位點甲基化不同模式敏感性的不同，產(chǎn)生不同大小的酶切片段，在PAGE圖上也產(chǎn)生了不同類型的條帶。如圖1所示，雙酶切后的PAGE膠圖上出現(xiàn)了3種甲基化形式：1)E+M有條帶，E+H無條帶，即(1、0)型，表明只有MspⅠ酶切割， CCGG位點發(fā)生全甲基化(圖1A)；2)E+M無條帶，E+H有條帶，即(0、1)型，表明只有HapⅡ切割，CCGG位點發(fā)生半甲基化(圖1B)；3)E+M和E+H兩種酶切都有條帶，表明CCGG未發(fā)生甲基化(圖1C)?？兹覆軲SAP甲基化形式跟黃瓜(Cucumissativus)、小麥、蘿卜(Raphanussativus)、水稻等研究結(jié)果一致[18-20]。

圖1　孔雀草DNA全甲基化(A)、半甲基化(B)和 未甲基化(C)MSAP條帶類型Fig.1　MSAP band type of fully methylated (A),hemimethylated (B) and unmethylated (C) of Tagetes patula genome DNA

注：(M1、H1)、(M2、H2)和(M3、H3)代表不同引物擴增條帶。

Note: (M1,H1), (M2,H2) and (M3,H3) are amplification fragments of the different primers, respectively.

從24對選擇性擴增引物(3條E引物和8條H/M引物配對)中(表1)，根據(jù)MSAP產(chǎn)物擴增條帶清晰度、擴增條數(shù)、重復性好壞程度篩選出11對引物，對4種不同濃度Cd脅迫下孔雀草DNA甲基化進行甲基化敏感擴增多態(tài)性分析。結(jié)果得出，0、50、250和500 mg·kg-1Cd2+濃度脅迫下，孔雀草DNA甲基化電泳圖中總擴增條帶數(shù)分別為197、208、220和237(表2)，總MSAP率(包括全甲基化率和半甲基化率)分別為24%、30%、35%和41%；全甲基化帶型條數(shù)分別為39、48、55和63條，全甲基化率分別為20%、23%、25%和27%，半甲基化率分別為4%、6%、10%和14%。

由此可知，在重金屬Cd2+脅迫處理下，孔雀草基因組DNA甲基化程度明顯增強，并且甲基化增加水平與Cd2+濃度之間呈明顯的劑量效應關系，同時，發(fā)生重新甲基化的擴增位點數(shù)要高于去甲基化的擴增位點數(shù)，并且全甲基化率高于半甲基化率，得出雙鏈全甲基化在孔雀草基因組CCGG位點甲基化中占主要比例。所以，隨著脅迫濃度的升高，總甲基化水平最終升高。

2.2Cd2+脅迫處理對孔雀草基因組DNA甲基化狀態(tài)的影響

為檢測孔雀草在重金屬Cd2+脅迫處理下DNA甲基化的動態(tài)變化情況，對擴增條帶做了統(tǒng)計分析。為了方便統(tǒng)計，在帶型分析中，將EcoRⅠ/MspⅠ酶切擴增泳道記作M，EcoRⅠ/HapⅡ酶切擴增的泳道記作H。同一位點，有擴增條帶用“1”表示，無擴增條帶的用“0”表示(表3)。

3種不同濃度Cd2+濃度脅迫處理與對照的甲基化敏感性擴增共出現(xiàn)了9種帶型，總體可以分為兩大類。1)單態(tài)類，這一類的特點是處理組的甲基化狀態(tài)跟對照組的甲基化模式一樣(圖2中D1、D2、D3)，表明在重金屬Cd2+處理前、后CCGG位點甲基化狀態(tài)未變化。D1為未甲基化類型，此時MspⅠ酶及HapⅡ酶都可以識別并切割位點，得到(1、1、1、1)的帶型；D2為半甲基化類型，此時HapⅡ酶能識別并切割，MspⅠ酶不能識別，從而得到(0、1、0、1)的帶型；D3為全甲基化類型，此時MspⅠ酶識別并切割，HapⅡ酶不能識別，從而得到(1、0、1、0)的帶型；2)多態(tài)類，這一類的特點是處理組跟對照組的甲基化模式不一樣(圖2中A、B、C)，表明在重金屬Cd2+處理前、后CCGG位點甲基化狀態(tài)發(fā)生了變化，包括重新甲基化A類，其特點是對照沒有發(fā)生甲基化(M、H都有條帶)，但處理后發(fā)生了甲基化(M有帶或是H有帶)，表明孔雀草經(jīng)Cd2+處理后基因組DNA甲基化程度增加，如對照組CCGG位點處未甲基化，處理后發(fā)生了半甲基化，而得到(1、1、0、1)型條帶(A1)；去甲基化B類，其特點是與A類相反，表明孔雀草經(jīng)Cd2+處理后基因組DNA甲基化程度降低，如對照組CCGG位點處全甲基化，處理后該位點發(fā)生去甲基化而得到(1、0、1、1)型條帶(B1)；不定類型C類，其特點是處理組與對照組的甲基化變化程度不能確定。

表2　不同Cd2+濃度脅迫對孔雀草基因組DNA甲基化水平的影響Table 2　Methylation levels of Tagetes patula genome DNA under Cd2+ stress at different concentrations

表3　不同Cd2+濃度脅迫對孔雀草基因組DNA甲基化狀態(tài)的變化Table 3　Pattern changes of Tagetes patula genome DNA under Cd2+ stress at different concentrations

50、250、500 mg·kg-1Cd2+脅迫處理的孔雀草基因組DNA多態(tài)性甲基化位點數(shù)分別為36、36和45，重新甲基化 (A類)位點數(shù)分別為20、21、25，占基因總擴增位點數(shù)的10%、10%、11%(表3)；去甲基化 (B類)位點數(shù)分別為15、9、16，占基因總擴增位點數(shù)的7%、4%、5%；不定類型(C類)位點數(shù)分別為1、6、4，占基因總擴增位點數(shù)的0.5%、2%、1%。由此可知，孔雀草在Cd2+脅迫處理下，基因組DNA凈甲基化水平不斷提高，植物總體甲基化變化程度呈上升趨勢。

3　討論與結(jié)論

DNA甲基化作為一種相對保守的表觀遺傳修飾形式，對維持植物的正常生長發(fā)育、抵御外界不良環(huán)境變化具有重要的作用[21]，甲基化水平的改變往往對植物造成不良影響。研究[22]認為，編碼基因啟動子區(qū)的胞嘧啶經(jīng)過甲基化修飾后，啟動因子、RNA轉(zhuǎn)錄酶的轉(zhuǎn)錄起始反應會受到阻礙，從而引起基因沉默表達；而基因啟動子區(qū)的去甲基化對基因具有激活作用，能促進基因表達。通過研究植物基因組DNA甲基化水平變化，探索植物抗逆性、生長發(fā)育、代謝調(diào)控機理，揭示植物表觀遺傳調(diào)控的分子機制，對植物的改良、育種具有重要意義。

當植物體受到環(huán)境中重金屬脅迫時，植物體通過改變DNA甲基化來調(diào)控基因的表達，以抑制某些基因或啟動某些基因的方式來應對不良環(huán)境對自身的影響，從而達到抵御重金屬脅迫的作用。研究表明，重金屬脅迫與植物基因組DNA甲基化水平的提高有直接關系[23-25]，有研究證明，在Pb脅迫下，蘿卜肉質(zhì)根基因組DNA甲基化水平明顯高于對照(12.1%)[26]，鉻(Cr)脅迫能誘導油菜(Brassicacampestris)幼苗基因組DNA甲基化水平提高，并與脅迫濃度呈顯著的劑量效應關系[27]。本研究首次運用MSAP技術對不同濃度Cd2+脅迫下孔雀草基因組DNA甲基化的變化情況進行了分析，結(jié)果表明，隨著Cd2+脅迫濃度的升高，孔雀草基因組DNA甲基化多態(tài)性呈增高趨勢(高于對照24%)，這與前述蘿卜和油菜的研究結(jié)果相符。

圖2　對照與處理孔雀草基因組DNA的MSAP部分擴增圖譜Fig.2　Profiles of MSAP in Tagetes patula L DNA between control and treated plants

注：E+AAC/H/M+TCA引物擴增；M、H為對照組；M1、H1為50 mg·kg-1Cd2+處理組；M2、H2為250 mg·kg-1Cd2+處理組；Marker為PBR322DNA/MspⅠ。

Note: (M,H),(M1,H1) and (M2,H2) are amplification fragments of E+AAC/H/M+TCA primer, respectively; M1 and H1 are the MSAP patterns under the treatment of 50 mg·kg-1Cd2+; M2 and H2 are the MSAP patterns under the treatment of 250 mg·kg-1Cd2+; M and H are those of the control; Marker is PBR322DNA/MSPⅠ.

植物DNA甲基化主要通過兩種方式發(fā)生，一種是通過DNA甲基轉(zhuǎn)移酶來完成，這種酶主要包括3類:域重排甲基轉(zhuǎn)移酶DRM、甲基轉(zhuǎn)移酶MET和染色質(zhì)域甲基轉(zhuǎn)移酶CMT，它們序列上的同源性表現(xiàn)在都含有一個保守的DMTase結(jié)構域，分別被認為與不同形式DNA序列的甲基化有關[28]，植物通過甲基轉(zhuǎn)移酶來維持正常的DNA甲基化，進而調(diào)控植株的生長，對植物的抗逆境脅迫起著重要的保護作用；另一種方式是通過外界刺激而導致植物體氧化損傷和非氧化損傷造成DNA甲基化。研究表明，經(jīng)X-射線照射后DNA的甲基化變化跟氧化脅迫有直接關系[29]，趙景龍等[30]認為，重金屬脅迫會打破植物體內(nèi)的正常生理平衡，造成活性氧的大量積累，此甲基化方式即是在逆境脅迫超過植物自身所能承受能力時發(fā)生的，由于損傷造成而非基因組正常抗逆調(diào)控的甲基化。因此，植物受到重金屬脅迫時，啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)的變化是植物應對逆境脅迫、降低毒害的一種重要基因調(diào)控方式；當重金屬脅迫超過一定濃度時，質(zhì)膜過氧化使得植物體內(nèi)大量甲基自由基生成，并對DNA中胞嘧啶進行甲基取代而導致甲基化異常。

植物在受重金屬脅迫時， MSAP模式的改變主要包括重新甲基化和去甲基化兩種類型[31]。本研究中，隨著Cd2+濃度(0、50、250和500 mg·kg-1)的提高，重新甲基化數(shù)分別占總甲基化多態(tài)性擴增位點數(shù)的10%、10%、11%；去甲基化數(shù)分別占總甲基化多態(tài)性擴增位點數(shù)的7%、4%、5%，基因組DNA凈甲基化水平不斷提高，植物總體甲基化變化程度呈上升趨勢，表明孔雀草經(jīng)重金屬Cd2+脅迫處理后，基因組 DNA重新甲基化和去甲基化是調(diào)控基因表達的主要方式，以此來減少重金屬對植物的損傷，而當重金屬持續(xù)脅迫并濃度升高時，植株可能由于過氧化產(chǎn)生過量的自由基而直接導致DNA的氧化損傷，使其甲基化異常，并導致植物的生長發(fā)育受阻甚至死亡。

綜上所述，孔雀草經(jīng)Cd2+脅迫處理后，基因組DNA甲基化水平和模式都發(fā)生了改變，不同Cd2+濃度處理DNA甲基化水平均明顯高于無Cd脅迫，且與濃度呈劑量效應關系。重金屬脅迫程度的升高，使孔雀草DNA甲基化模式也發(fā)生了變化，重新甲基化率隨Cd2+濃度升高而提高，去甲基化率則隨脅迫濃度的升高而呈現(xiàn)下降趨勢，且以重新甲基化率的增加為主，最終導致總體甲基化率的升高。

References：

[1]陳圣安.鎘污染對水稻生理生化的影響.農(nóng)技服務,2011,28(7):1033-1035.

[2]鄧一飛,徐佳敏,張文舉,鄧志瑞.鎘脅迫對匍匐剪股穎生長及生理生化的影響.草業(yè)科學,2015,32(2):217-223.

Deng Y F,Xu J M,Zhang W J,Deng Z R.Effects of cadmium stress on growth and physiological and biochemical characteristics of creeping bentgrass.Pratacultural Science,2015,32(2):217-223.(in Chinese)

[3]郭丹蒂.重金屬Pb、Cd對中華水韭甲基化的影響.哈爾濱：哈爾濱師范大學碩士學位論文,2014.

Guo D D.The effect of heavy metals of Pb and Cd on DNA methylation inIsoetessinensis.Master Thesis.Harbin:Harbin Normal University,2014.(in Chinese)

[4]宋建,金鳳媚,薛俊,劉仲齊.鎘脅迫對植物生長及生理生態(tài)效應的研究進展.天津農(nóng)業(yè)科學,2014,20(12):19-22.

Song J,Jin F M,Xue J,Liu Z Q.Advances of cadmium stress on plants growth and physiological and ecological effects.Tianjin Agricultural Sciences,2014,20(12):19-22.(in Chinese)

[5]劉大林,楊俊俏,劉兆明,王奎,孫啟鑫.鎘、鉛脅迫對草地早熟禾幼苗生理的影響.草業(yè)科學,2015,32(2):224-230.

Liu D L,Yang J Q,Liu Z M,Wang K,Sun Q X.Effects of cadmium and lead stress on physiological characyers ofPoapratensisseedlings.Pratacultural Science,2015,32(2):224-230. (in Chinese)

[6]Monteiro V,Cavalcante D G S M,Vilela M B F A,Sofia S H,Martinez C B R.In vivo and in vitro exposures for the evaluation of the genotoxic effects of lead on the Neotrpical freshwater fishProchiloduslineatus.Aquat Toxicology,2011,104(3-4):291-298.

[7]Carmona E R,Creus A,Marcos R.Genotoxicity testing of two lead-compounds in somatic cells ofDrosophilamelanogaster.Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis,2011,724(1-2):35-40.

[8]Razin A,Cedar H,Riggs A D.DNA methylation-biochemistry and biological significance.Spriger-Verlag,1986,4(3):139-140.

[9]黑淑梅.重金屬絡對小麥DNA甲基化水平的影響.安徽農(nóng)業(yè)科學,2011,39(13):7589-7591.

Hei S M.Effects of heavy metal chromium on the DNA methylation in wheat seedling.Journal of Anhui Agricultural Sciences,2011,39(13):7589-7591.(in Chinese)

[10]葛才林,楊小勇,劉向農(nóng),孫錦荷,羅時石,王澤港.重金屬對水稻和小麥DNA甲基化水平的影響.植物生理與分子生物學學報, 2002,28(5):363-368.

Ge C L,Yang X Y,Liu X N,Sun J H,Luo S S,Wang Z G.Effects of heavy metal on the DNA methylation level in rice and wheat.Journal of Plant Physiology and Molecular Biology,2002,28(5):363-368.(in Chinese)

[11]劉婷婷,孫昊,關旸,劉保東.低溫脅迫對極度瀕危植物中華水韭生理特性的影響.西北植物學報,2013,33(10):2031-2036.

Liu T T,Sun H,Guan Y,Liu B D.Effects of low temperature stress on physiological characters of critically endangeredIsoetessinensispalmer.Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica,2013,33(10):2031-2036.(in Chinese)

[12]Ge C L,Yang X Y,Liu X N,Sun J H,Luo S S,Wang Z G.Effect of heavy metal stress on levels of methylation in DNA of crop.Agro-environmental Protection,2002,21(4):301-305.

[13]Erturk F A,Agar G,Arslan E,Nardemir G.Analysis of genetic and epigenetic effects of maize seeds in response to heavy metal (Zn) stress.Environmental Science and Pollution Research,2015,22(13):10291-10297.

[14]Rana S V S.Metals and apoptosis:Recent developments.Journal of Trace Elements in Medicine and Biology,2008,22(4):262-284.

[15]王子成,李忠愛,李鎖平.MSAP技術及其在植物上的應用.生物技術通報,2006(S1):195-196.

Wang Z C,Li Z A,Li S P.The thchnology of MSAP and its applications in plant.Biotechnology Bulletin,2006(S1):195-196.(in Chinese)

[16]何燕紅,董淼,馬爽,潘晨,艾葉,張洪義,包滿珠.孔雀草的開花特性與繁殖系統(tǒng).華中農(nóng)業(yè)大學學報,2015,34(2):9-15.

He Y H,Dong M,Ma S,Pan C,Ai Y,Zhang H Y,Bao M Z.Flowering characteristics and breeding system ofTagetespatula.Journal of Huazhong Agricultural University,2015,34(2):9-15.(in Chinese)

[17]孫圓圓.耐鎘植物抗性及富集規(guī)律的研究.貴陽:貴州大學碩士學位論文,2014.

Sun Y Y.Study on resistance and accumulation characteristics of cadmium tolerant plant.Master Thesis.Guiyang:Guizhou University,2014.(in Chinese)

[18]Pan Y J,Wang W S,Zhao X Q,Zhu L H, Fu B Y,Li Z K.DNA methylation alterations of rice in response to cold stress.Plant Omics,2011,4(7):364-369.

[19]Ge C L,Yang X Y,Liu X N,Sun J H,Luo S S,Wang Z G.Effect of heavy metal on levels of methylation in DNA office and wheat.Journal of Plant Physiology and Molecular Biology,2002,28(5):363-368.

[20]黃韞宇,張海軍,邢燕霞,齊艷,孫倩倩,周春蕾,趙冰,郭仰東.NaCl脅迫對黃瓜種子萌發(fā)的影響及DNA甲基化的MSAP分析.中國農(nóng)業(yè)科學,2013,46(8):1646-1656.Huang Y Y,Zhang H J,Xing Y X,Qi Y,Sun Q Q,Zhou C L,Zhao B,Guo Y D.Effects of NaCl stress on seed germination and DNA methylation status detected by MSAP analysis in cucumber.Scientia Agricultura Sinica,2013,46(8):1646-1656.(in Chinese)

[21]趙云雷,葉武威,王俊娟,樊保香,宋麗艷. DNA甲基化與植物抗逆性研究進展.西北植物學報,2009,29(7):1479-1489.

Zhao Y L,Ye W W,Wang J J,Fan B X,Song L Y.Review of DNA methylation and plant stress-tolerance.Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica,2009,29(7):1479-1489.(in Chinese)

[22]劉鵬飛.離體條件對火龍果DNA甲基化變異的影響.貴陽：貴州大學碩士學位論文,2014.

Liu P F.DNA methylation variation induced by in vitro culture of dragon fruit.Master Thesis.Guiyang:Guizhou University,2014.(in Chinese)

[23]朱國念,周新文,孫錦荷.混合重金屬離子誘導的鯽魚DNA損傷與基因表達.核農(nóng)學報,2003,17(3):199-202.

Zhu G N,Zhou X W,Sun J H.DNA damage and its gene expression of fish induced by mixture-metals.Journal of Nuclear Agricultural Sciences,2003,17(3):199-202.(in Chinese)

[24]Bender J.Cytosine methylation of repeated sequences in eukaryotes the role of DNA pairing.Trends in Biochemical Sciences,1998,23(7):252-256.

[25]楊金蘭,柳李旺,龔義勤,黃丹瓊,王峰,何玲莉.鎘脅迫下蘿卜基因組DNA甲基化敏感擴增多態(tài)性分析.植物生理與分子生物學學報,2007,33(3):219-226．

Yang J L，Liu L W,Gong Y Q,Huang D Q,Wang F，He L L.Analysis of genomic DNA methylation level in radishunder cadmium stress by methylation-sensitive amplified polymorphisme technique.Journal of Plant Physiology and Molecular Biology，2007,33(3)：219-226.(in Chinese)

[26]何玲莉,沈哄,王燕,王娟娟,龔義勤,徐良,柳李旺.鉛脅迫下蘿卜基因組DNA甲基化分析.核農(nóng)學報,2015,29(7):1278-1284.

He L L，Sheng H，Wang Y，Wang J J,Gong Y Q，Xu L，Liu L W.Analysis of genomic DNA methylation level in radish under lead stress.Journal of Nuclear Agricultural Sciences，2015,29(7)：1278-1284.(in Chinese)

[27]Labra M,Grassi F,Imazio S,Fabio T D,Citterio S,Sgorbati S,Agradi E.Genetic and DNA-methylation changes induced by potassium dichromate inBrassicanapusL.Chemosphere,2004,54(8):1049-1058.

[28]Jullien P E,Susaki D,Yelagandula R,Higashiyama T,Berger F.DNA methylation dynamics during sexual reproduction inArabidopsisthaliana.Current Biology,2012,22(19):1825-1830.

[29]Aypar U,Morgan W F,Baulch J E.Radiation-induced epigenetic alterations after low and high LET irradiations.Mutation Research,2010,707(1-2):24-33.

[30]趙景龍,張帆,萬雪琴,肖朝.早開堇菜對鎘污染的耐性及其富集特征.草業(yè)科學,2016,33(11):54-60.

Zhao J L,Zhang F,Wan X Q,Xiao Z.Cadmium tolerance and enrichment characteristics ofViolaprionantha.Pratacultural Science,2016,33(11):54-60.(in Chinese)

[31]王子成,馬洪霞,何艷霞.重金屬鎘對擬南芥DNA甲基化的影響.植物生理學通訊,2009,45(2):115-118.

Wang Z C,Ma H X,He Y X.Effects of cadmium onArabidopsisthalianaDNA methylation.Plant Physiology Communication,2009,45(2):115-118.(in Chinese)

(責任編輯 王芳)

Effects of different concentrations Cd stress on DNA methylation ofTagetespatula

Zhang Kai-kai, Chen Xing-yin, Yang Peng, Guan Ping

(College of life Sciences, Guizhou University, Guiyang 550025，China)

With the speeding up of human’s activity and industrialization process, heavy metal pollution has caused serious harm to the environment. In the present study, the methylation-sensitive amplified polymorphism (MSAP) technique was employed to analyze the DNA methylation inTagetespatulaunder different concentrations of cadmium(Cd) in pots experiment. The results showed that the genomic MSAP rate ofT.patulawas 24%, 30%, 35% and 41%, and the total methylation rate ofT.patulawas 20%, 23%, 25% and 27%, respectively, when treated with the different concetrations of Cd2+(0, 50, 250, 500 mg·kg-1). The results indicated that the total methylation level of DNA increased with the increase of Cd2+concentration. Moreover, in regards of the change pattern of DNA methylation, the denove methylation rates were 10%, 10% and 11%, respectively, under stress of 50, 250 and 500 mg·kg-1Cd2+, which indicated that the denove methylation was the main methylation pattern. In summay, the current study provides a theoretical reference for revealing the variation trend of heavy metal stress on plant DNA methylation and the mechanism of plant tolerance to heavy metal stress.

Tagetespatula; Cd stress; DNA methylation; MSAP technique

Guan PingE-mail:guanp508@163.com

2016-06-03接受日期：2016-07-20

貴州大學研究生創(chuàng)新基金(研農(nóng)2016005)；貴州省社會發(fā)展攻關課題(201303137)

張凱凱(1991-)，男，貴州鎮(zhèn)遠人，在讀碩士生，研究方向為植物發(fā)育分子生物學。E-mail:1329487810@qq.com

關萍(1962-)，女，安徽渦陽人，教授，博士，研究方向為植物分子生物學。 E-mail:guanp508@163.com

S543+.9034;Q945.78

A

1001-0629(2016)9-1673-08*

張凱凱，陳興銀，楊鵬，關萍.不同濃度鎘脅迫對孔雀草DNA甲基化的影響.草業(yè)科學,2016,33(9)：1673-1680.

Zhang K K,Chen X Y,Yang P,Guan P.Effects of different concentrations Cd stress on DNA methylation ofTagetespatula.Pratacultural Science，2016,33(9)：1673-1680.