陳利云，王弋博，李三相，汪之波

(天水師范學(xué)院生物工程與技術(shù)學(xué)院, 甘肅省農(nóng)業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 天水 741001)

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苜蓿-根瘤菌復(fù)合鹽高效抗性共生體系構(gòu)建

陳利云，王弋博，李三相，汪之波

(天水師范學(xué)院生物工程與技術(shù)學(xué)院, 甘肅省農(nóng)業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 天水 741001)

為構(gòu)建具有鹽漬土環(huán)境競爭力與遺傳穩(wěn)定性的苜蓿(Medicago)-根瘤菌高效共生體系，以12個(gè)苜蓿品種為材料，進(jìn)行了復(fù)合鹽種子萌發(fā)、種子內(nèi)生根瘤菌抗鹽堿篩選及接種試驗(yàn)。結(jié)果表明，不同品種間種子復(fù)合鹽抗性差異較大，成活率以中苜1號最高，甘農(nóng)7號、新疆大葉次之，但三者間無顯著差異；種子內(nèi)生根瘤菌復(fù)合鹽抗性以甘農(nóng)1號最強(qiáng)，菌株數(shù)目最豐，為2.58×106，中苜1號次之，為2.49×106，根瘤菌固氮酶活性以中苜1號最高；以新疆大葉種子接種中苜1號根瘤菌匹配度為最佳，共生體系地上生物量、莖葉粗蛋白含量以及固氮酶活性均為最高。

苜蓿；內(nèi)生根瘤菌；復(fù)合鹽；固氮酶活性；共生體系

土壤鹽漬化是世界各國高度關(guān)注的生態(tài)問題，近年來，隨著人類活動對自然環(huán)境影響的不斷加劇，土壤鹽漬化已成為制約現(xiàn)代農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要因素[1]。實(shí)踐證明，土壤鹽漬化無法根治，但耐鹽植物對鹽漬土有明顯的改良作用，是鹽漬土治理中最具潛力的措施[2]。苜蓿(Medicago)是中等耐鹽性豆科牧草，固氮量大、產(chǎn)量高、抗逆性強(qiáng)，被廣泛應(yīng)用于鹽漬土改良[3-4]，根瘤菌是能與豆科植物共生的一類植物內(nèi)生菌，除能固氮外，還能通過分泌生長素、溶解有機(jī)磷等多種促生作用促進(jìn)宿主植物生長并增強(qiáng)抗逆性[5]。目前，利用植物內(nèi)生菌的這種生物強(qiáng)化作用構(gòu)建植物-微生物體系進(jìn)行聯(lián)合修復(fù)是鹽漬土治理的新方向，苜蓿-根瘤菌共生體系是其中的應(yīng)用典范。

自然界中鹽、堿脅迫通常同時(shí)發(fā)生，高濃度混合鹽堿對生物的損傷強(qiáng)于單鹽或單堿，但已有的苜蓿與根瘤菌耐鹽性研究大多都在單鹽條件下進(jìn)行，在生產(chǎn)實(shí)踐中的應(yīng)用效果往往較差。因此，要使苜蓿、根瘤菌菌株在實(shí)際生產(chǎn)中真正發(fā)揮作用，耐鹽共生體的構(gòu)建必須緊密結(jié)合實(shí)際的復(fù)合鹽堿土壤環(huán)境。本研究以12個(gè)苜蓿品種及種子內(nèi)生根瘤菌為材料，采用平板抗性篩選及盆栽試驗(yàn)，在苜蓿與內(nèi)生根瘤菌復(fù)合鹽抗性研究的基礎(chǔ)上，構(gòu)建適應(yīng)實(shí)際鹽漬土環(huán)境的苜蓿-根瘤菌高效共生體系，以期為植物-微生物聯(lián)合體系在鹽漬土改良中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

選取12個(gè)苜蓿品種，其中7個(gè)為國內(nèi)育成品種，主要種植地為甘肅、新疆等西部省(區(qū))，5個(gè)為國外引進(jìn)的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)品種，原產(chǎn)地及種子來源見表1。

表1　12個(gè)苜蓿品種產(chǎn)地及來源Table 1　Origin and source of 12 alfalfa cultivars

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1土樣采集和鹽分測定土樣來自“甘肅省河西走廊蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院臨澤試驗(yàn)站”中度鹽漬土壤，采集時(shí)間為2014年7月，主要以硫酸鹽-氯化物為主，pH為8.3，呈堿性。土壤采集采用正方形五點(diǎn)取樣法，每點(diǎn)取土壤上層0-30 cm土樣3份，每份約5 kg，充分混合自然風(fēng)干碾碎，置4 ℃保存。復(fù)合鹽由土壤水浸提液熬制結(jié)晶而成，取混合土樣3 kg于5 L蒸餾水中浸泡24 h，每1 h攪拌1次，8 h取1次上清液，共浸提3次，將浸提液加熱蒸發(fā)析出晶體，采用過氧化氫除去晶體色素得到復(fù)合鹽，復(fù)合鹽組成及含量采用原子吸收法和滴定方法進(jìn)行測定。得出每千克土樣離子含量CO32-為4.21%、HCO3-為3.75%、 SO42-為33.72%、Cl-為13.56%、 Na+為17.24%、Mg2+為27.65%、 Ca2+為7.93%、 K+為2.17%，根據(jù)土樣中各離子濃度配制復(fù)合鹽溶液以模擬中度鹽漬土含鹽量，即每千克復(fù)合鹽溶液含Na2CO342.1 g、KCl 21.7 g、CaCl279.3 g、NaHCO337.5 g、MgSO4276.5 g、Na2SO460.7 g。

1.2.2種子萌發(fā)將精選的苜蓿種子先用95%乙醇處理5 min，再用0.1%氯化汞處理5 min，無菌水沖洗7次后，平鋪于滅菌培養(yǎng)皿中含有少量復(fù)合鹽溶液的無菌紗布之上，根據(jù)缺水情況加入適量復(fù)合鹽溶液，28 ℃黑暗培養(yǎng)，觀察記錄種子發(fā)芽情況；相同萌發(fā)條件下設(shè)置對照，即把復(fù)合鹽溶液換為蒸餾水，每處理3個(gè)重復(fù)。

發(fā)芽率=種子發(fā)芽數(shù)/種子總數(shù)×100%；

校正發(fā)芽率=復(fù)合鹽的種子發(fā)芽率/對照的種子發(fā)芽率×100%。

死亡率是指有胚芽活力的種子在萌發(fā)過程中的死亡率，計(jì)算公式：

死亡率=萌發(fā)死亡數(shù)/種子總數(shù)×100%;

校正死亡率=復(fù)合鹽的種子死亡率/對照的種子死亡率×100%。

1.2.3種子內(nèi)生根瘤菌復(fù)合鹽培養(yǎng)將以上處理好的苜蓿種子0.1 g在滅菌研缽中加2 mL無菌水充分研磨，離心10 min (4 000 r·min-1)后取(上清液1 mL配制濃度為10-6)稀釋液80 μL接種于YMA剛果紅培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中的蒸餾水以復(fù)合鹽溶液濃度代替，28 ℃培養(yǎng)；相同培養(yǎng)條件下設(shè)置對照，即把復(fù)合鹽溶液換為蒸餾水，每處理3個(gè)重復(fù)，6 d后記錄單菌落數(shù)量，進(jìn)行革蘭氏染色及形態(tài)學(xué)鏡檢區(qū)分，選擇菌落均勻、每平板1～30個(gè)菌落的稀釋度計(jì)算每品種種子內(nèi)生根瘤菌的最大可能的菌株數(shù)，初步鑒別確定為根瘤菌后再進(jìn)行固氮酶活性檢測(乙炔還原法)[6]，置平板于4 ℃保存。

1.2.4接種與盆栽分別將篩選出的耐復(fù)合鹽苜蓿種子進(jìn)行萌發(fā)和根瘤菌振蕩培養(yǎng)，同時(shí)將鹽漬土樣裝入口徑10 cm、深13 cm的盆中，種子萌發(fā)至芽長1 cm時(shí)，用菌液浸泡苜蓿幼苗15 min后，每盆栽植10株，3個(gè)重復(fù)；相同條件下設(shè)置對照，即把鹽漬土換為田間土壤，培養(yǎng)溫度為(22±3) ℃、光強(qiáng)7 000～8 000 lx，光照時(shí)間12 h，根據(jù)盆中失水情況適時(shí)補(bǔ)充蒸餾水，管理期為60 d。

1.2.5測定方法培養(yǎng)至60 d時(shí)開始觀測結(jié)果，測定項(xiàng)目包括每盆總瘤數(shù)及根瘤固氮酶活性(乙炔還原法)、地上和地下部分鮮重(在收獲時(shí)稱重)、地上部分干重(先在烘箱中120 ℃殺青40 min，然后在60 ℃烘干48 h稱重)和粗蛋白含量(采用凱氏定氮法測定[7])。

1.3數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行復(fù)合鹽種子萌發(fā)、內(nèi)生根瘤菌與盆栽處理的單因素方差分析(One-way ANOVA)，并對有顯著效應(yīng)的各處理數(shù)據(jù)進(jìn)行DUNCAN檢驗(yàn)。

2　結(jié)果與分析

2.1不同復(fù)合鹽處理下12個(gè)苜蓿品種的發(fā)芽率與死亡率

由于種子的產(chǎn)地來源及休眠級別不同，種子發(fā)芽率也不同(表2)，以阿爾岡金和甘農(nóng)8號最高(100%)，太陽神、甘農(nóng)1號、中苜1號、三得利和金皇后5個(gè)品種較低，金皇后最低(46.7%)。與對照相比，復(fù)合鹽溶液導(dǎo)致種子發(fā)芽率明顯下降，其中阿爾岡金最高(76.0%)，金皇后最低(20.7%)。校正發(fā)芽率以阿爾岡金、甘農(nóng)8號、隴東苜蓿、太陽神、中苜1號較高，顯著高于新疆大葉、牧歌、甘農(nóng)1號、三得利以及金皇后(P<0.05)。復(fù)合鹽試驗(yàn)中，已發(fā)芽的種子隨著生長時(shí)間的推移出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，對照培養(yǎng)中種子死亡率與復(fù)合鹽種子死亡率相比，阿爾岡金校正死亡率最高，為69.4%，甘農(nóng)7號與中苜1號最低，均為8%。

表2　不同品種苜蓿復(fù)合鹽發(fā)芽率與死亡率Table 2　Germination percentage and death rate of 12 alfalfa cultivars under complex salt

注：數(shù)據(jù)均為均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(n=3)，同列不同小寫字母差異顯著(P<0.05)。表3、表4同。

Notes: Data present as mean±standard error. Values with different lower case letters within the same column indicate significant difference at 0.05 level. The same in Table 4 and Table 5.

2.212個(gè)苜蓿品種幼苗復(fù)合鹽存活率

復(fù)合鹽種子萌發(fā)7 d后將其置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待幼苗長勢穩(wěn)定后，記錄不同品種幼苗的存活率(圖1)，幼苗存活率以中苜1號最高(55.1%)，甘農(nóng)7號(51.1%)次之，與新疆大葉(48.1%)、牧歌(44.4%)和三得利()間無顯著差異(P>0.05)，與其它品種間有顯著差異(P<0.05)，甘農(nóng)3號、太陽神、甘農(nóng)1號較低，隴東最低,僅為0.4%。

圖1　不同品種苜蓿萌發(fā)種子復(fù)合鹽幼苗成活率Fig.1　Survival rate of different alfalfa cultivars combined with salt

注：圖中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note: Different lower case letters indicate significant difference among different alfalfa cultivars at 0.05 level.

2.3種子內(nèi)生根瘤菌復(fù)合鹽抗性菌株數(shù)及固氮酶活性

種子內(nèi)生根瘤菌復(fù)合鹽抗性培養(yǎng)根瘤菌菌株數(shù)目以甘農(nóng)1號和中苜1號最高，與其它品種間有顯著差異，甘農(nóng)3號和甘農(nóng)7號最低，顯示出中苜1號種子內(nèi)生根瘤菌復(fù)合鹽抗性最強(qiáng)(表3)。根瘤菌固氮酶活性結(jié)果表明，中苜1號最高，為3.54 μmol C2H2·(m2·h)-1，阿爾岡金次之，為3.31 μmol C2H2·(m2·h)-1，甘農(nóng)7號最低，為1.09 μmol C2H2·(m2·h)-1，與新疆大葉、金皇后外的其它品種間差異顯著(P<0.05)。

2.4紫花苜蓿-根瘤菌最佳共生體系構(gòu)建

以中苜1號種子內(nèi)生根瘤菌接種中苜1號、甘農(nóng)7號、新疆大葉和牧歌4個(gè)苜蓿品種構(gòu)建共生體系(表4)，與對照相比，4個(gè)苜蓿品種接種后地上生物量、粗蛋白含量、結(jié)瘤數(shù)及根瘤固氮酶活性均有明顯增加;單株地上生物量干重以新疆大葉最高，為0.453 g，甘農(nóng)7號次之(0.407 g)，且二者間無顯著差異(P>0.05)，粗蛋白含量以牧歌最低，為18.09%，與新疆大葉、中苜1號及甘農(nóng)7號間差異顯著(P<0.05)，單株根系結(jié)瘤數(shù)以中苜1號最多，為78.13個(gè)，根瘤固氮酶活性以新疆大葉最高，為3.921 μmol C2H2·(m2·h)-1。以上結(jié)果表明，新疆大葉接種中苜1號種子內(nèi)生根瘤菌為復(fù)合鹽條件下的最佳共生體系。

表3　不同品種苜蓿種子內(nèi)生根瘤菌復(fù)合鹽 菌株數(shù)及固氮酶活性Table 3　Number rhizobia of different alfalfa varieties seeds strains and nitrogenase activity of mixed salt

3　討論

種子萌發(fā)是種子植物生命的起點(diǎn)，是植物生活史中對外界環(huán)境最為敏感的階段，也是決定植物能否在環(huán)境中定居的關(guān)鍵時(shí)期[8]，本研究中12個(gè)品種的苜蓿種子復(fù)合鹽抗性不同，地方品種普遍強(qiáng)于引進(jìn)品種，這可能與品種自身的進(jìn)化和對當(dāng)?shù)刈匀画h(huán)境的適應(yīng)過程有關(guān)。研究表明，鹽脅迫能加速蛋白質(zhì)的分解，使脯氨酸含量升高，促進(jìn)植物對水分的吸收，減輕鹽害程度[9]。自然界中鹽堿土壤是一種復(fù)雜的復(fù)合生態(tài)環(huán)境，與單一的中性鹽或堿性鹽脅迫不同，在復(fù)合鹽堿土壤中生長的植物，除了滲透脅迫和離子毒害兩個(gè)方面的脅迫，還涉及到高pH脅迫，幾種中性鹽和堿性鹽混合在一起后，離子之間具有協(xié)同效應(yīng)與交互作用，要比單純的某種因素復(fù)雜得多，通常堿性鹽分脅迫對種子萌發(fā)的抑制作用要大于中性鹽脅迫[10-11]。如根據(jù)東北松嫩草原鹽堿土的成分設(shè)置的混合鹽堿條件對羊草(Leymuschinensis)的脅迫程度強(qiáng)于堿脅迫的[12]，單純的鹽度或高pH對紫花苜蓿的危害遠(yuǎn)不如二者共同作用時(shí)嚴(yán)重[13]。本研究中所采土樣是以硫酸鹽-氯化物為主的復(fù)合鹽漬土，pH為8.3，雖然隴東、甘農(nóng)8號在復(fù)合鹽條件下種子萌發(fā)率很高，但萌發(fā)種子在復(fù)合鹽條件下的死亡率同樣很高，致使種子成活率極低，可能與這些紫花苜蓿品種對復(fù)合鹽中少量的堿性鹽與高pH環(huán)境較為敏感有關(guān)。

表4　不同品種苜蓿接種根瘤菌共生體系復(fù)合鹽構(gòu)建Table 4　Rhizobia inoculated on alfalfa cultivars of high efficient symbiontic under mixed salt

根瘤菌是生活在植物組織內(nèi)部較為典型的植物內(nèi)生菌，經(jīng)過長期的自然選擇與宿主植物間形成了緊密的共生關(guān)系，與根際其它微生物相比，在抵御外界生物及非生物環(huán)境壓力方面都具有較強(qiáng)的生存優(yōu)勢。大量研究表明，根瘤菌與宿主植物共生顯示了多方面的促生作用，在增強(qiáng)植物抗逆性方面起到了積極的作用，與宿主植物其它部位相比，種子內(nèi)生根瘤菌的抗逆性更強(qiáng)[14-15]，復(fù)合鹽環(huán)境中堿性鹽能使植物根系外環(huán)境中的pH升高，而不適宜的pH會影響到根瘤菌的生存繁殖。本研究中，種子內(nèi)生根瘤菌數(shù)量分布與菌株固氮酶活性無相關(guān)性，中苜1號的內(nèi)生根瘤菌與固氮酶活性均較高。高效的紫花苜蓿-根瘤菌共生體系構(gòu)建中，宿主植物對共生體總變異的貢獻(xiàn)約為30%，接種菌株為26%，超過36%的變異是由紫花苜蓿與根瘤菌的互作引起的[16]，因此，根據(jù)紫花苜蓿品種和根瘤菌菌株的匹配關(guān)系，選擇相應(yīng)的菌株接種，或選用匹配的種質(zhì)材料育種，是保證共生體系高效性的物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究在復(fù)合鹽條件下篩選出了以中苜1號種子內(nèi)生根瘤接種新疆大葉紫花苜蓿品種的最佳共生體系，但實(shí)際生產(chǎn)中影響共生體高效性發(fā)揮的因素是復(fù)雜多樣的[17]，許多基礎(chǔ)性的問題還需要進(jìn)一步深入研究，因此，本研究中選出的高效共生體系在實(shí)際應(yīng)用中的對鹽漬土的改良效果尚待鹽漬地大田試驗(yàn)的進(jìn)一步驗(yàn)證。

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(責(zé)任編輯武艷培)

Establishment of highly efficient and salt tolerance alfalfa rhizobia symbiotia Chen Li-yun, Wang Yi-bo, Li San-xiang, Wang Zhi-bo

(School of Bioengineering and Technology , Tianshui Normal University. Key Laboratory of

Agriculture Microbiology in Gansu Province, Tianshui 741001, China)

In order to establish the high efficient alfalfa-rhizobia symbiotia with competitive ability and genetic stability in saline soil, germination, rhizobia salt tolerance and inoculation experiments were conducted using 12 alfalfa cultivars. The results indicated that the seed salt tolerance varied greatly among cultivars. The highest of seed salt tolerant survival percent was Zhongmu No.1 and second highest of that was Xinjiangdaye and Gannong No.7 although there was no significant difference between these three research group. The highest of rhizobia salt tolerant was Ganonng.1 with the rich strains number of 2.49×106. Zhongmu.1. of Xinjiangdaye symbiotic with rhizobia isolated from zhongmu.1 had highest salt resistance and nitrogenase activity of rhizobia and the highest efficiency with the highest aboveground biomass, stem and leaf crude protein content and nitrogenase activity.

alfalfa; endogenous rhizobia; compound salt; nitrogenase activity

Chen Li-yunE-mail:chenliy06@163.com

10.11829/j.issn.1001-0629.2015-0566

2015-10-19接受日期：2016-04-05

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31560164)

陳利云(1974-)，女，甘肅天水人，副教授，碩士，主要從事生態(tài)學(xué)教學(xué)與科研工作。E-mail:chenliy06@163.com

S551+.703.4;Q945.7

A

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