田麗，劉娜，鄭麗娜，朱炬，張哲成

(天津市第三中心醫(yī)院，天津300170)

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單纖維傳導(dǎo)檢測對糖尿病大鼠運動神經(jīng)損害的早期診斷價值

田麗，劉娜，鄭麗娜，朱炬，張哲成

(天津市第三中心醫(yī)院，天津300170)

目的以糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)改變作為客觀依據(jù)，探討單纖維傳導(dǎo)檢測對糖尿病大鼠運動神經(jīng)損害的早期檢測價值。方法 選取SD大鼠37只，隨機分為對照組19只、糖尿病組18只；糖尿病組經(jīng)腹腔注射鏈脲佐菌素誘導(dǎo)成糖尿病大鼠模型。在造模第4、8、12周對糖尿病組及對照組進行坐骨神經(jīng)單纖維傳導(dǎo)速度(SF-CV)、單纖維傳導(dǎo)末端運動潛伏期(SF-DML)及坐骨神經(jīng)運動傳導(dǎo)速度(MCV)、末端運動潛伏期(DML)、復(fù)合肌肉動作電位(CMAP)檢測，并利用電鏡觀察大鼠坐骨神經(jīng)的超微結(jié)構(gòu)，比較兩組大鼠不同時期各項神經(jīng)電生理指標(biāo)、電鏡觀察結(jié)果的差異。結(jié)果 造模第4周，糖尿病組大鼠坐骨神經(jīng)SF-CV、SF-DML、MCV、DML、CMAP與對照組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P均>0.05)；電鏡顯示糖尿病組大部分神經(jīng)纖維尚正常。第8周，糖尿病組左側(cè)坐骨神經(jīng)SF-CV較對照組減低、SF-DML較對照組延長(P均<0.05)；電鏡顯示糖尿病組坐骨神經(jīng)可見髓鞘明顯損害。第12周，糖尿病組右側(cè)坐骨神經(jīng)SF-CV、MCV較對照組減低， SF-DML、DML較對照組延長，CMAP較對照組減低(P均<0.01)；電鏡觀察糖尿病組坐骨神經(jīng)嚴重受損。結(jié)論 單纖維傳導(dǎo)檢測可早期發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠運動神經(jīng)纖維異常。

糖尿??；周圍神經(jīng)病變；單纖維傳導(dǎo)；運動神經(jīng)傳導(dǎo)；電鏡;大鼠

糖尿病周圍神經(jīng)病變(DPN)初期大多為肢端麻木疼痛自覺癥狀，而運動神經(jīng)損害表現(xiàn)輕微，往往被忽視且不易被臨床、神經(jīng)電生理檢查發(fā)現(xiàn)。單纖維傳導(dǎo)檢測利用單纖維針電極記錄面積小的特點,可選擇性測量一小組或者單個神經(jīng)纖維的運動傳導(dǎo)，有利于發(fā)現(xiàn)早期、輕度或者部分神經(jīng)損傷。因此我們利用單纖維傳導(dǎo)檢測技術(shù)對糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)運動纖維進行評價，探討其對糖尿病運動神經(jīng)纖維損害的早期診斷價值。

1　材料與方法

1.1 實驗動物及處理 健康雄性SD大鼠37只(由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部動物中心提供)，體質(zhì)量為180～220 g。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后采用隨機數(shù)字表法將大鼠隨機分為對照組19只、糖尿病組18只。糖尿病組大鼠給予一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)制備糖尿病模型，對照組大鼠僅給予注射等量的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。造模第4周末，兩組各取8只進行右側(cè)坐骨神經(jīng)電生理檢測，并另取其中1只大鼠的右側(cè)坐骨神經(jīng)標(biāo)本行電鏡觀察；第8周末，對以上兩組所取8只大鼠再行左側(cè)坐骨神經(jīng)電生理檢測后處死，并取其中1只大鼠的左側(cè)坐骨神經(jīng)標(biāo)本行電鏡觀察。第12周末，對照組10只、糖尿病組9只大鼠進行右側(cè)坐骨神經(jīng)電生理檢測后處死，并取其中1只大鼠坐骨神經(jīng)標(biāo)本行電鏡觀察。

1.2 神經(jīng)電生理檢測 將大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，俯臥固定于平板上。環(huán)境溫度22～25 ℃。應(yīng)用美敦力Keypointnet肌電圖儀進行神經(jīng)電生理檢測，帶通2～100 kHz。①運動神經(jīng)傳導(dǎo)檢測：參照 Terata等[1]方法，根據(jù)大鼠坐骨神經(jīng)走向，采用單極針經(jīng)皮插入作為刺激電極；第1刺激點陰極置于坐骨切跡，陽極旁開5 mm；第2刺激點陰極置于同側(cè)內(nèi)踝后方，陽極旁開5 mm，用方形波(強度5～15 mA、脈寬0.2 ms)刺激神經(jīng)。以單極針電極作為記錄電極，陰極插入右足底骨間肌，陽極插入右足底皮下，地線置于尾部皮下。分別測量末端運動潛伏期(DML)和復(fù)合肌肉動作電位(CMAP)、運動神經(jīng)傳導(dǎo)速度(MCV)。②單纖維傳導(dǎo)檢測：包括單纖維傳導(dǎo)速度(SF-CV)及單纖維傳導(dǎo)末端運動潛伏期(SF-DML)檢測。參照 Terata等[1]方法，以單纖維針電極作為記錄電極，插入右足底骨間肌，地線置于尾部皮下。分別測量SF-DML及SF-CV。SF-DML為由內(nèi)踝后方刺激開始至單纖維動作電位起始點之間的時間。SF-CV 為兩個刺激部位之間的距離/兩刺激部位潛伏期差值。移動單纖維針電極以獲得3個不同記錄點的SF-CV及SF-DML數(shù)值，并取平均值。

1.3電鏡觀察取坐骨神經(jīng)組織，即刻投入預(yù)冷的電鏡固定液中送檢，標(biāo)本經(jīng)2.5%戊二醛固定液、1%四氧化鋨固定，上升梯度乙醇脫水，環(huán)氧丙烷過渡，Epon812環(huán)氧樹脂包埋。經(jīng)半薄切片定位后，以LEICA ULTRACUT-R超薄切片機制備超薄切片，厚度50 nm；醋酸鈾及檸檬酸鉛雙重染色，HITACHI-7500透射電鏡觀察，Megaview數(shù)字化電鏡攝影系統(tǒng)攝片。

2　結(jié)果

2.1 糖尿病大鼠模型造模情況 糖尿病組大鼠腹腔注射STZ后第1、8、12周，尾靜脈取血測血糖，血糖水平分別為(25.45±3.93)、(23.06±4.3)、(23.23±3.59) mmol/L；對照組血糖水平分別為(5.06±0.54)、(5.14±0.52)、(5.39±0.70) mmol/L。兩組血糖比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.01)。

2.2造模第4周兩組神經(jīng)電生理、電鏡檢查結(jié)果兩組右側(cè)坐骨神經(jīng)SF-CV、SF-DML、MCV、DML、CMAP差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。電鏡觀察：對照組坐骨神經(jīng)髓鞘、軸索完整，微管微絲正常，神經(jīng)髓鞘板層規(guī)則、整齊。糖尿病組可見坐骨神經(jīng)輕微損傷，低倍鏡觀察大部分神經(jīng)纖維尚正常，高倍鏡觀察部分神經(jīng)髓鞘局灶板層熔融，出現(xiàn)小裂隙。

表1　造模第4周兩組右側(cè)坐骨神經(jīng)電生理檢查結(jié)果比較±s)

2.3造模第8周兩組神經(jīng)電生理、電鏡檢查結(jié)果糖尿病組左側(cè)坐骨神經(jīng)SF-CV較對照組減低(P<0.05)，SF-DML較對照組延長(P<0.05);MCV、DML、CMAP較對照組無統(tǒng)計學(xué)差異(P均>0.05)。見表2。電鏡觀察：對照組坐骨神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)正常。糖尿病組坐骨神經(jīng)可見明顯髓鞘損害，髓鞘板層松散、分離，結(jié)構(gòu)不清，外側(cè)部分有熔融灶。

表2　 造模第8周兩組左側(cè)坐骨神經(jīng)電生理檢測結(jié)果比較±s)

2.4造模第12周兩組神經(jīng)電生理、電鏡檢查結(jié)果糖尿病組右側(cè)坐骨神經(jīng)SF-CV、MCV較對照組減低(P均<0.01)， SF-DML、DML較對照組延長(P均<0.01)，CMAP較對照組減低(P<0.01)。見表3。電鏡觀察：對照組坐骨神經(jīng)組織超微結(jié)構(gòu)正常。糖尿病組坐骨神經(jīng)受損嚴重，髓鞘板層結(jié)構(gòu)破壞，蓬松變厚，有折疊、熔融，軸索受擠壓，軸索內(nèi)微管微絲紊亂。

表3　 造模第12周兩組右側(cè)坐骨神經(jīng)電生理檢測結(jié)果比較±s)

3　討論

DPN起病隱匿，患者常因肢體麻木、疼痛等感覺癥狀就診，早期電生理表現(xiàn)以感覺神經(jīng)纖維受損為主，小纖維受累明顯[2]，臨床及電生理檢測對運動神經(jīng)纖維的關(guān)注度較低。而糖尿病運動神經(jīng)纖維的損害可導(dǎo)致肌肉無力、肌容積減少，增加跌倒風(fēng)險，在DPN早期并不易被發(fā)現(xiàn)[3]。

單纖維傳導(dǎo)檢測是基于單纖維肌電圖而發(fā)展起來的神經(jīng)電生理技術(shù)[4, 5]，2007年開始有研究者以單纖維針電極代替表面電極作為記錄電極進行單纖維傳導(dǎo)檢測[6]。由于單纖維針電極側(cè)孔的記錄范圍遠小于表面電極的記錄范圍[7]，因此將其應(yīng)用于傳導(dǎo)速度檢測時，可以收集少量肌纖維電位，進一步計算少量甚至單個神經(jīng)纖維的傳導(dǎo)速度，利于發(fā)現(xiàn)早期、輕度運動神經(jīng)纖維功能異常。

Padua等[8]在常規(guī)運動神經(jīng)傳導(dǎo)正常糖尿病患者發(fā)現(xiàn)SF-CV下降。我們前期的研究將SF-CV檢測應(yīng)用于腕管綜合征患者及糖尿病患者，顯示SF-CV檢測較常規(guī)運動神經(jīng)傳導(dǎo)檢測對周圍神經(jīng)運動纖維早期損害診斷更為敏感[9, 10]。但是神經(jīng)電生理顯示的結(jié)果異常是否與DPN的病理性改變相一致，是否能反映周圍神經(jīng)的真實狀況，應(yīng)進一步行病理學(xué)觀察。鑒于無法對糖尿病患者運動神經(jīng)纖維活檢取材檢測，故本文利用糖尿病大鼠模型進行研究。Shi等[11]測定正常大鼠坐骨神經(jīng)MCV為50 m/s。本研究結(jié)果為51.45 m/s。與其基本一致。陳偉等[12]發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠造模后4周時少數(shù)腓腸神經(jīng)纖維髓鞘扭曲，部分髓鞘松散。Souayah等[13]在小鼠高血糖后4周即觀察到運動神經(jīng)纖維末端側(cè)支芽生，提示糖尿病的早期階段即出現(xiàn)運動神經(jīng)纖維損害，而高血糖后6周，MCV及CMAP仍為正常。本研究在糖尿病造模后4周電鏡觀察坐骨神經(jīng)也發(fā)現(xiàn)少量神經(jīng)髓鞘局灶性損害，神經(jīng)電生理檢測與正常對照組相比均未發(fā)現(xiàn)差異。8周時電鏡觀察局灶性髓鞘板層松散、分離，此時糖尿病大鼠MCV、DML及CMAP檢測均未顯示異常，但應(yīng)用單纖維傳導(dǎo)檢測將神經(jīng)分為若干小部分進行研究，發(fā)現(xiàn)了SF-CV下降及SF-DML延長，顯示單纖維傳導(dǎo)較運動神經(jīng)傳導(dǎo)檢測更易于發(fā)現(xiàn)早期部分的神經(jīng)損害。衛(wèi)重娟等[14]發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠造模后15周坐骨神經(jīng)MCV下降。本研究中發(fā)現(xiàn)DM大鼠高血糖后12周出現(xiàn)坐骨神經(jīng)MCV下降，CMAP減低，單纖維傳導(dǎo)異常進一步加重。此檢測結(jié)果與電鏡顯示髓鞘折曲、軸索受擠壓等嚴重損害基本一致。電鏡證實的糖尿病大鼠模型的周圍神經(jīng)損害，為單纖維傳導(dǎo)檢測早期發(fā)現(xiàn)糖尿病周圍神經(jīng)運動纖維異常的應(yīng)用價值提供了客觀支持依據(jù)。

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2016-02-16)