李永川，王思江，毛洪艷，顏識涵，劉毅，魏東山，夏良平*，黃慶*

（1.第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院檢驗科，重慶400038；2.中國科學(xué)院重慶綠色智能技術(shù)研究院，跨尺度制造技術(shù)重慶市重點(diǎn)實驗室，重慶400714）

太赫茲波段超材料在核酸恒溫指數(shù)擴(kuò)增檢測上的應(yīng)用*

李永川1，王思江2，毛洪艷2，顏識涵2，劉毅2，魏東山2，夏良平2*，黃慶1*

（1.第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院檢驗科，重慶400038；2.中國科學(xué)院重慶綠色智能技術(shù)研究院，跨尺度制造技術(shù)重慶市重點(diǎn)實驗室，重慶400714）

超材料對電磁場具有介電環(huán)境敏感和局域電場增強(qiáng)等奇特的電磁特性，近年來廣泛用于無標(biāo)記生物檢測。文中設(shè)計并制作了一種金屬開口諧振環(huán)陣列結(jié)構(gòu)的超材料，在太赫茲波段下分別檢測核酸恒溫指數(shù)擴(kuò)增前后反應(yīng)體系，在氮?dú)飧稍锃h(huán)境下，擴(kuò)增反應(yīng)前后的頻率偏移量分別為Δf1=（54±3）GHz、Δf2=（60±5）GHz。實驗結(jié)果顯示金屬開口諧振環(huán)陣列結(jié)構(gòu)的超材料可以作為一種生物傳感器快速無標(biāo)記檢測核酸擴(kuò)增前后的變化。

太赫茲；超材料；金屬開口諧振環(huán)陣列

EEACC：7230doi：10.3969/j.issn.1004-1699.2016.09.007

太赫茲THz（Terahertz）波是指頻率為0.1 THz～10 THz的電磁波，它具有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)：能量低，不會對生物大分子產(chǎn)生破壞作用［1］；相干性，可通過獲得THz的相位和幅度變化，得到生物大分子的吸收系數(shù)和折射率［2］；指紋譜特性，生物大分子的內(nèi)/間的弱相互作用力和骨架振動等正好位于THz頻譜范圍［3］。因此，近年來，THz技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域的研究越發(fā)受到重視。但由于目前THz生物檢測技術(shù)的靈敏度較低，不能有效檢測微量的生物大分子，因此，發(fā)展一種操作簡便、可進(jìn)行高靈敏THz生物檢測的通用手段逐漸成為大家研究的焦點(diǎn)。

超材料MMs（Metamaterials）主要是由周期性排列的亞波長諧振單元和載體構(gòu)成的人工復(fù)合電磁材料［4］，它具有奇異的電磁諧振特性，如異常透射［5］、局域電場增強(qiáng)［6］、介電環(huán)境敏感［7］等特性。在入射THz波的作用下，通過超材料的局域場增強(qiáng)特性，可增強(qiáng)超材料與生物分子之間的相互作用，籍此可提高THz生物檢測的靈敏度。如Hee-Jo Lee等［8］設(shè)計的雙環(huán)金屬開口諧振環(huán)DSRRs（Double Split-ring Resonators）共振頻率為12.35 GHz，能夠分辨出單鏈DNA與互補(bǔ)鏈雜交后的前后變化。Wu Xiaojun等［9］設(shè)計了一種簡單的矩形單開口SRRs，利用0.4 THz和1.2 THz的兩個共振頻率頻率偏移量的組合，檢測了不同濃度的鏈霉親和素。

恒溫指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)EXPAR（Isothermal Expo?nential Amplification Reaction）是近幾年發(fā)展的一種核酸擴(kuò)增反應(yīng)。它在DNA聚合酶和切口酶作用下，反復(fù)進(jìn)行“切割-延伸-鏈置換”，等溫條件下即可快速對短鏈DNA（8-16堿基）進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增［10］，一般能夠在10 min之內(nèi)對靶目標(biāo)DNA擴(kuò)增到106倍～109倍［11］，從而能夠從溶液中眾多生物大分子中選擇性極端放大靶DNA，間接提高THz技術(shù)在生物大分子檢測應(yīng)用的靈敏性。

本論文提出了一種幾何結(jié)構(gòu)為五環(huán)矩形金屬開口的THz超材料生物傳感器FSRRs（Five Split-ring Resonators），利用光刻工藝制作出了大面積的、結(jié)構(gòu)均一性良好的傳感器件。以核酸恒溫指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)前后的反應(yīng)體系為測試對象進(jìn)行傳感實驗測試發(fā)現(xiàn)，相對于FSRRs本身的THz共振透射譜而言，擴(kuò)增反應(yīng)前體系的THz譜向低頻移動了Δf1=（54±3）GHz，而擴(kuò)增反應(yīng)后體系的THz譜向低頻移動了Δf2=（60±5）GHz的頻移，取得了較高靈敏度的探測結(jié)果。

1　主要試劑和材料

VentR（exo-）DNA聚合酶、Nt.BstNBI內(nèi)切酶、10×Thermopol反應(yīng)緩沖液、10×NEBuffer 3.1緩沖液等以上試劑均購自美國New England Biolabs（NEB）公司；20×Evagreen熒光染料購自美國Biotium公司；滅菌雙蒸水ddH2O購自北京鼎國昌盛生物公司；dNTPs購自美國Promega公司；引物Trigger和模板Template均購自上海生工公司；Secure-Seal?Adhesive Spacers墊片（美國Molecular Probes公司）；Tray-5000太赫茲時域光譜儀（Advanced Photonix Inc，美國API公司）。

1.1FSRRs結(jié)構(gòu)的制備及表征

超材料的諧振頻率與其結(jié)構(gòu)和尺寸相關(guān)，文中所設(shè)計的FSRRs結(jié)構(gòu)如圖1（a）所示，襯底為硅，金屬結(jié)構(gòu)所選材料為金。應(yīng)用光刻工藝制作FSRRs結(jié)構(gòu)，制作流程為①鍍膜：在潔凈的硅表面蒸鍍厚150 nm的金膜。②涂膠：將S1805正膠均勻旋涂在金膜表面，前烘、冷卻。③曝光：采用URE-2 000A/55移動掩模曝光系統(tǒng)，在均勻涂膠的表面進(jìn)行接觸式定時曝光，然后顯影。④濕法刻蝕：使用碘∶碘化鉀∶水=6 g∶20 g∶100 mL的混合液，刻蝕金膜，之后用去大量離子水沖洗。⑤去膠：無水乙醇去除光刻膠，即可獲得FSRRs結(jié)構(gòu)。

圖1　SRRs結(jié)構(gòu)

經(jīng)以上光刻工藝流程，制備得到的FSRRs如圖1（b）所示。這一結(jié)果為10×偏光顯微鏡下的光學(xué)顯微圖像，可見該FSRRs是大面積均一的，這為它在THz生物檢測中可重復(fù)利用提供了保障。該結(jié)構(gòu)的細(xì)節(jié)放大圖，如圖1（b）中插圖所示，為50×顯微鏡下的顯微圖像。結(jié)果表明，所制備的FSRRs的棱角分明，對應(yīng)各金屬環(huán)的形狀、大小一致，結(jié)構(gòu)參數(shù)如圖1（a）所示：襯底硅的厚度h=500μm，金屬環(huán)最外的邊長l=48 μm，開口寬度g=2.5 μm，結(jié)構(gòu)單元內(nèi)的環(huán)與環(huán)之間距離p= 2 μm，結(jié)構(gòu)單元之間的間距w=10 μm，金膜的厚度150 nm。

1.2核酸恒溫指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)體系

核酸序列詳細(xì)信息具體見表1。

表1　核酸序列

核酸擴(kuò)增每管反應(yīng)體系中各反應(yīng)物質(zhì)濃度為0.05 U/μL VentR（exo-）DNA聚合酶，0.05 U/μL Nt.BstNBI內(nèi)切酶，400 μmol/L dNTPs，1×Thermopol反應(yīng)緩沖液，0.5×NEBuffer 3.1緩沖液，1×Evagreen熒光染料，1pmol/L引物序列（Trigger），100 nmol/L模板序列（Tempalte），加入ddH2O使反應(yīng)體系總體積至20 μL，60℃放入熒光定量PCR儀反應(yīng)。

2　結(jié)果

在完成了FSRRs結(jié)構(gòu)的制備后，下面將對其傳感性能進(jìn)行實驗測試，所選取的測試對象為核酸恒溫指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)前后的體系。采用太赫茲時域光譜系統(tǒng)（THz-TDS）TRay-5000，在透射模式下進(jìn)行實驗。在測量過程中，為減少空氣中水對太赫茲波的吸收干擾，須將整個裝置置于通入氮?dú)饬鞯牟Ａ渲小Ｔ跐穸鹊陀?%，溫度為（21.02±0.01）℃的環(huán)境下進(jìn)行實驗測試。

檢測樣品前，在FSRRs表面粘貼一空白區(qū)域為直徑15 mm、厚度100 μm的墊片，THz波下檢測并獲得未放入樣品前充滿氮?dú)猸h(huán)境的參考信號IReference和THz波透過潔凈的FSRRs表面獲得的信號IBare。測試核酸擴(kuò)增反應(yīng)前后方法為：在制備完成的SRRs表面上空白圓形區(qū)域，分別滴入核酸擴(kuò)增前或擴(kuò)增后的樣品溶液8 μL和ddH2O 22 μL，然后輕微搖勻使混合液均勻分布在空白的圓形區(qū)域，50℃烘干后分別檢測，得到透射譜結(jié)果為IPre-amplification和IAfteramplification。FSRRs、核酸擴(kuò)增反應(yīng)前體系和反應(yīng)后體系歸一化透過率分別為

將檢測獲得的數(shù)據(jù)經(jīng)過歸一化處理后獲得的透過率結(jié)果如圖2所示。未加入樣品前，超材料結(jié)構(gòu)的諧振頻率處位于1.33 THz處。分別加入核酸擴(kuò)增前溶液和核酸擴(kuò)增后溶液并進(jìn)行烘干后，經(jīng)多次重復(fù)實驗發(fā)現(xiàn)：與超材料結(jié)構(gòu)本身的THz透射譜相比，核酸擴(kuò)增前的溶液的THz透射譜向低頻偏移了（54±3）GHz，而擴(kuò)增后則為（60±5）GHz?？梢?，所制備得到的超材料結(jié)構(gòu)對核酸恒溫指數(shù)擴(kuò)增的反應(yīng)前后的差異具有較高的靈敏度，適用于THz生物檢測。

圖2　恒溫核酸指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)前后的檢測結(jié)果

3　討論

所制備的FSRRs結(jié)構(gòu)在入射THz波的驅(qū)動下，可等效為一電容-電感LC（Inductor-Capacitor）回路，它的開口處可等效為電容器，其余金屬環(huán)部分可等效為電感，其共振頻率為［12］

式中，Leq為等效電感，主要為FSRRs的結(jié)構(gòu)參數(shù)決定；Ceq為等效電容，與FSRRs結(jié)構(gòu)周圍的媒質(zhì)的介電常數(shù)有關(guān)。將待測物質(zhì)加入到FSRRs結(jié)構(gòu)表面時，其周圍環(huán)境的介電常數(shù)將會增大，從而導(dǎo)致Ceq減小，最終引起體系的共振頻率f向低頻移動。根據(jù)O’Hara J F的理論［13］，諧振環(huán)陣列結(jié)構(gòu)的整體電容

式中，C1為硅基底的電容，C2為硅基底與金屬陣列結(jié)構(gòu)之間的電容，C3為金屬陣列結(jié)構(gòu)的電容，C4為金屬陣列與待測物質(zhì)間的電容，C5為待測物質(zhì)的電容。由于文中檢測核酸擴(kuò)增前后使用的FSRRs結(jié)構(gòu)相同，故待測物質(zhì)電容C5的改變是引起共振頻率偏移量不同的原因。待測物質(zhì)電容C5是指FSRRs結(jié)構(gòu)上滴加的溶液中各個組成成分在烘干后的電容C值之和。而EXPAR本質(zhì)上是將反應(yīng)溶液中大量游離的dNTPs合成多核苷酸鏈，溶液中使用的酶、蛋白質(zhì)、鹽離子等在擴(kuò)增前后的量幾乎不會有變化，烘干后，這些物質(zhì)的在FSRRs結(jié)構(gòu)單元上產(chǎn)生的電容C幾乎相同，所以擴(kuò)增前溶液體系中游離的dNTPs和擴(kuò)增后溶液體系中的多核苷酸鏈的C值不同導(dǎo)致了待測物質(zhì)電容C5的不同，從而引起反應(yīng)體系前后THz透射譜的頻移量不同。

超材料可作為一種生物傳感器應(yīng)用于THz生物檢測，得益于許多生物大分子的集體振蕩模式位于THz波段。如果將具有奇異電磁諧振特性的超材料和生物大分子進(jìn)行特異性結(jié)合，將會有效提高傳感器的靈敏度。另外THz技術(shù)尚未突破THz對水敏感性的限制，生物醫(yī)學(xué)樣本中液態(tài)水和檢測環(huán)境中的水蒸氣會導(dǎo)致嚴(yán)重的THz波水吸收干擾，結(jié)果通常是在干燥狀態(tài)下進(jìn)行測量。然而，許多生物大分子只有在水溶液環(huán)境中才有生物活性，導(dǎo)致THz波段下超材料生物傳感器在生物醫(yī)學(xué)上實際應(yīng)用遇到了瓶頸，這促使我們應(yīng)著重加強(qiáng)研究THz技術(shù)在水相環(huán)境中的應(yīng)用。

本文結(jié)合THz波的快速、無標(biāo)記和超材料的高靈敏度檢測的優(yōu)勢，利用THz-TDS檢測并得到了核酸恒溫指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)前后體系的共振頻率偏移量。相較于FSRRs結(jié)構(gòu)本身而言，由于核酸擴(kuò)增前后反應(yīng)體系的等效電容Ceq不同，導(dǎo)致反應(yīng)前后體系的頻率偏移量分別為（54±3）GHz、（60±5）GHz?？梢?，THz波段超材料可作為一種高靈敏度生物傳感器應(yīng)用于核酸擴(kuò)增檢測。但是基于生物醫(yī)學(xué)實際需求，還需進(jìn)一步研究THz水敏感性的問題，隨著THz技術(shù)的發(fā)展和超材料微結(jié)構(gòu)加工技術(shù)的提高，THz波段下超材料生物傳感器將會得到更廣泛的應(yīng)用。

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李永川（1989-），男，在讀碩士，2013年畢業(yè)于四川大學(xué)，獲得醫(yī)學(xué)學(xué)士學(xué)位，現(xiàn)就讀于第三軍醫(yī)大學(xué)攻讀碩士，主要從事于太赫茲波在生物大分子的應(yīng)用研究，yongchuanli511@163.com；

夏良平（1986-），男，博士，重慶中科院綠色智能技術(shù)研究院助理研究員，主要從事微納光學(xué)理論、微納加工工藝與器件、金屬表面等離子體、亞波長金屬結(jié)構(gòu)以及在生物傳感方面的應(yīng)用研究；

黃慶（1972-），男，博士，第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院檢驗科副主任、教授、主任醫(yī)師、博士生導(dǎo)師；兼任西南大學(xué)碩士生導(dǎo)師，主要從事分子診斷學(xué)方面研究。

Detection of Isothermal Exponential Amplification Reaction Using Terahertz Metamaterials*

LI Yongchuan1，WANG Sijiang2，MAO Hongyan2，YAN Shihan2，LIU Yi2，WEI Dongshan2，XIA Liangping2*，HUANG Qing1*
（1.Department of Medical Laboratory，Southwest Hospital of the Third Military Medical University，Chongqing 400038，China；2.Research Center for Terahertz Technology，Key Laboratory of Multi-scale Manufacturing Technology，Chongqing Institute of Green and Intelligent Technology，Chongqing 400714，China）

Metamaterial has a dielectric environmentally sensitive and local electric-field enhancement in electro?magnetic field，It was widely used in label-free biodetection in recent years.We designed and fabricated a metama?terial structure assembled by split ring resonator.Before and after the isothermal exponential amplification reaction system were detected at the terahertz band.In dry nitrogen gas environment，the resonance frequency offset were Δf1=（54±3）GHz and Δf2=（60±5）GHz at before and after reaction.The experimental result show that the metamateri?al assembled by split ring resonator can be used as a biosensor for rapid label-free detection in changes of before and after nucleic acid amplification.

terahertz；metamaterials；split ring resonators

O456

A

1004-1699（2016）09-1341-04

項目來源：國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃項目（2015CB755400；2015CB755402）；國家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項目（81430054）；物理與生物醫(yī)學(xué)交叉實驗室孵化基金項目（WSS-2012～501）

2015-12-24修改日期：2016-05-03