祃棟猛，陸信曜，陳文強，宗紅，諸葛斌*，宋健，戚夢杰

1(江南大學,糖化學與生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122)　2(江南大學,工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，生物工程學院，工業(yè)微生物研究室，江蘇 無錫，214122)　3(陜西理工大學，生物科學與工程學院，陜西 漢中，723001)　4(江南大學，化學與材料工程學院，江蘇 無錫，214122)

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發(fā)酵后期補加2種氮源對克雷伯氏菌合成1,3-丙二醇的影響

祃棟猛1,2，陸信曜1,2，陳文強3，宗紅1,2，諸葛斌1,2*，宋健4，戚夢杰1,2

1(江南大學,糖化學與生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122)2(江南大學,工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，生物工程學院，工業(yè)微生物研究室，江蘇 無錫，214122)3(陜西理工大學，生物科學與工程學院，陜西 漢中，723001)4(江南大學，化學與材料工程學院，江蘇 無錫，214122)

為探尋解決重要平臺化合物1,3-丙二醇發(fā)酵后期菌體生長和1,3-丙二醇合成受限的方法，通過從菌體量、產物和關鍵酶活性及基因轉錄水平等方面，較全面地考察了發(fā)酵后期補加酵母膏和硫酸銨對克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)合成1,3-丙二醇的影響，結果為：添加兩種氮源均有利于菌體生長；補加10 g/L酵母膏和硫酸銨，1,3-丙二醇產量由58.6 g/L分別提高到70.6 g/L和77.2 g/L；相對于酵母膏，硫酸銨對關鍵酶活性的增強更為明顯，并使甘油脫氫酶(glycerol dehydrogenase，DhaD)在發(fā)酵后期始終維持較高水平，促進細胞生長和產物合成。此外，與補加酵母膏相比，補加硫酸銨后關鍵酶基因轉錄水平上調并不顯著。表明硫酸銨主要通過直接激活關鍵酶活性促進細胞生長和產物合成。綜上所述，發(fā)酵后期補加硫酸銨更利于1,3-丙二醇的生物合成，是提高發(fā)酵合成1,3-丙二醇水平的有效方式之一。

1,3-丙二醇；氮源；克雷伯氏菌；補料-分批發(fā)酵

1,3-丙二醇(1,3-propanediol，1,3-PDO)可作為新型聚酯纖維聚對苯二酸丙二醇酯(polytrimethylene-tereph-thalate，PTT)的單體，具有廣闊的市場應用前景。當前1,3-PDO的生產以化學合成法為主，其生產成本高且對環(huán)境污染嚴重。而生物法生產流程簡單且對環(huán)境友好，成為近年來的研究熱點。

克雷伯氏菌屬是已有報道能夠高效轉化甘油合成1,3-PDO的自然菌屬之一[1]。為提高K.pneumoniae發(fā)酵甘油產1,3-PDO水平，季廣建等[2]研究得出采用混合碳源策略能夠激活K.pneumoniae的1,3-PDO合成途徑關鍵酶的表達，提高1,3-PDO的產量，證實了混合碳源發(fā)酵策略的優(yōu)越性。ZENG等[3]研究指出,K.pneumoniae在分批補料發(fā)酵相比持續(xù)補料發(fā)酵具有更高的產量。K.pneumoniae合成1,3-PDO為半生長耦聯(lián)型[4]，因此分批補料下發(fā)酵后期菌體生長是限制高產的重要原因。前述研究多集中在碳源補料策略，相比之下，發(fā)酵后期氮源濃度可能是菌體生長代謝更為重要的限制因素。

為探尋解決1,3-PDO發(fā)酵后期菌體生長和合成受限的方法，本研究對發(fā)酵培養(yǎng)基中兩種常用氮源組分(硫酸銨與酵母膏)分別進行補加，考察兩種氮源補加對生物量、1,3-PDO合成及關鍵酶基因轉錄水平和活性的影響，旨在通過氮源優(yōu)化方式提高K.pneumoniae分批補料發(fā)酵1,3-PDO產量及探究其原因，并為生物法生產1,3-PDO打下基礎。

1　材料與方法

1.1主要材料、試劑與儀器

K.pneumoniaeZG25由本實驗室保藏；1,3-PDO標準品購自Sigma公司；Trizol總RNA提取試劑、HiFiScript快速去基因組cDNA第一鏈合成試劑盒及Ultra SYBR Mixture均購自康為世紀公司；其他試劑為國產分析純；發(fā)酵罐(BIOG-M 5L)，韓國BIOTRO公司；320-S pH計，METTLER TOLEDO；分光光度計，尤尼柯儀器有限公司；生物傳感儀SBA-40B，山東省科學院；HPLC高效液相色譜儀，美國戴安公司；液相色譜柱，Aminex HPX-87H column；酶標儀，美國分子儀器公司；實時熒光定量基因擴增儀，美國伯樂公司。

1.2培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基(g/L)：NaCl 10，胰蛋白胨 10，酵母提取物 5，瓊脂 20。

種子培養(yǎng)基(g/L)：NaCl 10，胰蛋白胨 10，酵母提取物 5。

5 L罐發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：甘油 20，葡萄糖 6，酵母膏 8，KH2PO47.5，MgSO4·7H2O 2，(NH4)2SO42，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.005，VB120.015，微量元素溶液 0.1 mL/L，KOH調pH 8.5。

微量元素溶液(g/L)：ZnCl20.7，MnCl2·4H2O 1，H3BO30.6，CoCl2·6H2O 2，CuCl20.2，NiCl2·6H2O 0.25，Na2MoO4·2H2O 0.35。

1.3培養(yǎng)方法

種子培養(yǎng)：LB培養(yǎng)基用于種子培養(yǎng)，接種量1%、37 ℃、150 r/min培養(yǎng)8 h。

分批補料發(fā)酵：5 L發(fā)酵罐裝液量為2.5 L，接種量4%，初始甘油濃度20 g/L，37 ℃，轉速150 r/min，通氣量0.1 L/min。pH通過在線pH電極監(jiān)控，用10 mol/L的KOH調節(jié)控制pH維持在7，維持發(fā)酵過程甘油濃度范圍在10～40 g/L。

1.4分析方法

生物量的測定：采用分光光度計測量OD600值，細胞干重(DCW)根據(jù)吸光度與干重對應關系， OD600=0.36 g/L。

代謝產物的測定：采用高效液相色譜法，發(fā)酵液中1,3-PDO、甘油、琥珀酸、乙酸、2,3-丁二醇(2,3-butanediol，2,3-BDO)用Dionex高效液相色譜儀測定，色譜柱：Amines HPX-87H(Bio-Rad)有機酸離子交換柱；柱溫60 ℃；流動相5 mmol/L H2SO4；流速0.6 mL/min；檢測器：為紫外及示差折光檢測器；定量方法：外標法。

粗酶液的提取方法見參考文獻[5]，酶活測定方法見參考文獻[6]。

蛋白質含量的測定采用Bradford法[7]，以牛血清白蛋白為標準蛋白。

1.5實時熒光定量RT-PCR(qRT-PCR)

RT-PCR方法見參考文獻[8]，內參基因選用NCBI公布的K.pneumoniae的16S rRNA基因，根據(jù)NCBI公布的K.pneumoniae的甘油脫水酶基因(dhaB)、1,3-丙二醇氧化還原酶基因(dhaT)與甘油脫氫酶基因(dhaD)的基因序列設計引物，見表1， 所有實時定量PCR反應均在Bio-Rad CFX96TMreal-time System中進行。

表1　本研究所用RT-PCR引物

2　結果與討論

2.1不同濃度酵母膏和硫酸銨補加下生物量與1,3-PDO合成的比較

在穩(wěn)定發(fā)酵期(12 h后)分別補加5、10、20 g/L的酵母膏和硫酸銨，菌體生長、1,3-PDO合成及發(fā)酵終產物情況如圖1所示。

分析可知，分別補加不同濃度的酵母膏與硫酸銨均能顯著提高發(fā)酵后期的生物量。由發(fā)酵終產物情況可知，補加5 g/L酵母膏與硫酸銨條件下，1,3-PDO產量均未見明顯提高，副產物略有增加。補加10 g/L酵母膏后，1,3-PDO產量達到70.6 g/L，提高17.3%，單位菌體產率為0.298 g/(g干菌體·h)，2,3-BDO增加43.6%；而補加10 g/L硫酸銨后，1,3-PDO產量達到77.2 g/L，提高29.9%，單位菌體產率為0.315 g/(g干菌體·h)，2,3-BDO增加45.2%，相比酵母膏，1,3-PDO產量及合成效率均進一步提高。在補加20 g/L酵母膏或硫酸銨的情況下，1,3-PDO產量未見明顯提高，副產物略有增加。綜上表明，發(fā)酵后期補加硫酸銨或酵母膏均能明顯促進細胞生長，且在一定程度上提高1,3-PDO的合成。與此類似，陶春平等[9]研究發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵中后期補加適當濃度的氨水有利于細胞生長和產物合成。此外，本研究中添加不同種類的氮源對發(fā)酵后期1,3-PDO合成的影響也存在一定差異，其中添加10 g/L酵母膏和硫酸銨更利于發(fā)酵后期1,3-PDO的積累。為揭示該現(xiàn)象的本質原因，進一步考察了補加不同氮源對甘油還原途徑與氧化途徑中關鍵酶活性和基因轉錄表達的影響。

圖1　補加不同濃度酵母膏與硫酸銨對發(fā)酵過程的影響Fig.1　Effects of different concentrations of yeast extract and ammonium nitrogen feeding on fed-batch fermentation

2.2補加10 g/L酵母膏或硫酸銨下代謝關鍵酶活性的變化

在K.pneumoniae發(fā)酵甘油生產1,3-PDO過程中，甘油還原途徑中甘油脫水酶(glycerol dehydratase，DhaB)催化甘油合成3-羥基丙醛(3-hydroxypropionaldehyde，3-HPA)，1,3-丙二醇氧化還原酶(1,3-propanediol oxidoreductase，DhaT)則將3-HPA轉化為1,3-PDO；而DhaD則是甘油氧化途徑關鍵酶，該途徑為細胞生長提供能量(ATP)、碳骨架和1,3-PDO的合成提供還原力(NADH)[10-11]。圖2結合圖3分析可知，與對照相比，添加酵母膏與硫酸銨后DhaB與DhaD活性均有所提高，DhaT峰值活性則分別提高了約76%與120%，有利于1,3-PDO的積累。

與酵母膏相比，添加硫酸銨對關鍵酶活性的增強更明顯。其中，添加硫酸銨后DhaD在12 h后保持更高活性，提高了甘油氧化途徑通量，使得生物量在發(fā)酵中后期要高于酵母膏組；同時提供更多NADH，有利于1,3-PDO的合成。此外，添加硫酸銨組的DhaB和DhaT活性在25～50 h內高于酵母膏組，使得該段時間內產物積累速率高于酵母膏組。而在50 h后兩實驗組的DhaB和DhaT酶活基本相似，但酵母膏組DhaD活性顯著上升，同時產物積累速率增加，表明發(fā)酵后期NADH的供給可能是產物合成的限制因素。兩個實驗組的乳酸脫氫酶活性無明顯區(qū)別，但酵母膏組的2,3-丁二醇脫氫酶

(2,3-butanediol dehydrogenase，BudC)活性略高。因此，添加硫酸銨組積累略多副產物的原因并非酶活差異，可能是因為甘油氧化途徑積累更多的NADH。綜上所述，添加硫酸銨對關鍵酶(特別是DhaD)具有更明顯的增強作用，從而積累較多1,3-PDO。

事實上，已有研究表明，NH4+對DhaD具有顯著的激活作用[12-14]。因此，本研究添加硫酸銨后，游離NH4+激活DhaD活性，強化了甘油氧化途徑，加速ATP和NADH再生。而ATP供應的增加又有利于DhaB的復活[15-16]，使得1,3-PDO合成途徑得到強化，進而提高了發(fā)酵后期產物的合成水平。

圖2　分別補加10 g/L酵母膏與10 g/L硫酸銨發(fā)酵還原途徑關鍵酶活性變化曲線Fig.2　Time curves of key enzymes activities of the reductive pathway in fed-batch fermentation through 10 g/L yeast extract and 10 g/L ammonium sulphate feeding, respectively

圖3　分別補加10 g/L酵母膏與10 g/L硫酸銨發(fā)酵氧化途徑關鍵酶活性變化曲線Fig.3　Time curves of key enzymes activities of the oxidative pathway in fed-batch fermentation through 10 g/L yeast extract and 10 g/L ammonium sulphate feeding, respectively

2.3補加10 g/L酵母膏或硫酸銨對1,3-PDO合成關鍵酶基因轉錄水平影響

為從轉錄水平探明硫酸銨對1,3-PDO合成關鍵酶的影響，以添加10 g/L酵母膏組為對照，添加10 g/L硫酸銨為實驗組，利用qRT-PCR考察補料前后不同時間1,3-PDO合成關鍵酶基因(dhaB、dhaT與dhaD)相對轉錄強度的變化。如圖4，相對于添加酵母膏，添加硫酸銨并未顯著影響dhaB在發(fā)酵過程中的相對轉錄，雖然32 h時dhaT與dhaD相對轉錄強度值有顯著變化(P< 0.05)，但實際相對轉錄增強僅有25%左右，而DhaT與DhaD的酶活此時相對于酵母膏組均提高近2倍，進一步表明硫酸銨主要是通過直接激活關鍵酶的活性來促進細胞生長和產物的合成。

圖4　補加硫酸銨對K. pneumoniae ZG25中dhaB、dhaT與dhaD相對轉錄強度的影響Fig.4　Effects on relative gene transcription intensity of dhaB, dhaT and dhaD in K. pneumoniae ZG25 through 10 g/L ammonium sulphate feeding注：相對轉錄強度計算采用2-ΔΔCt法，圖中相對轉錄強度為添加硫酸銨相對于添加酵母膏的計算值

3　結論

針對K.pneumoniaeZG25發(fā)酵生產1,3-PDO過程中生物量水平低且過早進入衰退期限制1,3-PDO合成的問題，本研究通過比較分析發(fā)酵后期補加酵母膏與硫酸銨對K.pneumoniaeZG25產1,3-PDO的影響，發(fā)現(xiàn)補加硫酸銨對生物量水平和1,3-PDO合成產量的提高更為顯著。酶活與轉錄水平研究表明，硫酸銨通過直接激活1,3-PDO合成關鍵酶(特別是DhaD)活性而非調控基因的轉錄水平的方式提高1,3-PDO產量。綜上所述，發(fā)酵后期補加硫酸銨有利于1,3-PDO的生物合成，是提高發(fā)酵合成1,3-PDO水平的有效方式之一。

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Influences on the biosynthesis of 1,3-propanediol inKlebsiellapneumoniaby feeding two types of nitrogen source at the late stage of fermentation

MA Dong-meng1,2, LU Xin-yao1,2, CHEN Wen-qiang3, ZONG Hong1,2,ZHU Ge-bin1,2*, SONG Jian4, QI Meng-jie1,2

1(The Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry and Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology,Jiangnan University, Wuxi 214122, China)2(The Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, Jiangnan University, School of Biotechnology,Research Centre of Industrial Microbiology, Wuxi 214122, China)3(School of Biological Science and Engineering, Shaanxi SCI-TECH University,Hanzhong 723001,China)4(School of Chemistry and Material, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

1,3-Propanediol (1,3-PDO) is an important platform compound. In order to solve the restriction of cell growth and 1,3-PDO production at the late stage of fermentation, feeding of two types of nitrogen source (yeast extract and ammonium sulphate) at the late stage of fermentation was studied. Biomass, products, genes transcription level and activities of key enzymes were studied. The results showed that both yeast extract and ammonium sulphate feeding improved the cell growth, and the 1,3-PDO titers were increased from 58.6 g/L to 70.6 g/L and 77.2 g/L, respectively. In comparison with yeast extract, the feeding of ammonium sulphate further improved activities of key enzymes involved in 1,3-PDO synthesis, and maintained glycerol dehydrogenase (DhaD) at a higher level at the late stage of fermentation. However, the transcription levels of the key genes of the cells incubated with the feeding of different nitrogen source were similar. All above information proved that ammonium sulphate improved the cell growth and product yield by activation of enzymes activities but did not affect their genes transcription. These results suggested that the addition of ammonium sulphate at the late stage of fermentation would be an effective way to improve the biosynthesis of 1,3-PDO.

1,3-propanediol; nitrogen source;Klebsiellapneumoniae; fed-batch fermentation

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201608002

碩士研究生(諸葛斌教授為通訊作者，E-mail：Bzhuge@163.com)。

2015-12-24,改回日期：2016-03-23