王馳，李柱，李才明,2,3，顧正彪,2,3*，洪雁,2,3，程力,2,3，李兆豐,2,3*

1(江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214122)　2(江南大學，食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫，214122)　3(江南大學，食品安全與質(zhì)量控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 無錫，214122)

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兩階段溫度控制策略以及助劑促進淀粉分支酶的胞外表達

王馳1，李柱1，李才明1,2,3，顧正彪1,2,3*，洪雁1,2,3，程力1,2,3，李兆豐1,2,3*

1(江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214122)2(江南大學，食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫，214122)3(江南大學，食品安全與質(zhì)量控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 無錫，214122)

為了促進重組淀粉分支酶在枯草芽孢桿菌(BacillussubtilisWB600)中的胞外表達，對重組淀粉分支酶在搖瓶水平上進行了發(fā)酵優(yōu)化。首先，以胞外酶活力為指標，先后考察了初始培養(yǎng)基、pH、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間4種因素對胞外表達的影響；然后，通過兩階段溫度策略和助劑的添加進一步提高胞外表達水平。結(jié)果表明，當發(fā)酵培養(yǎng)基為TB、pH為7.5時，25 ℃培養(yǎng)24 h后胞外酶活力達到19.9 U/mL；同時，菌體生長最適溫度和酶分泌的最適溫度是不一致的，通過兩階段溫度控制策略(即0～12 h控制溫度30 ℃，12 h后溫度調(diào)至25 ℃)，胞外酶活力與單一溫度條件下的最高水平(25 ℃)相比提高了1.4倍，達到了47.1 U/mL；在此基礎上，進一步添加0.05%的吐溫-80，將胞外酶活進一步提高40%，達到65.8 U/mL。

淀粉分支酶；胞外表達；兩階段溫度控制策略；發(fā)酵優(yōu)化

近年來，改性淀粉研究成為熱點[1-3]，而且更加側(cè)重其構效關系的研究[4-6]。通常人們采用物理、化學和酶法對淀粉進行改性，其中酶法改性較物理、化學法更加溫和。

淀粉分支酶(Starch Branching Enzyme，SBE)是一種糖基轉(zhuǎn)移酶，通過切開α-1,4-糖苷鍵連接的葡聚糖鏈，把切下的非還原末端通過α-1,6-糖苷鍵連接于受體鏈上，使得淀粉產(chǎn)生更多分支[7]，可以對天然淀粉進行高支化修飾，使得淀粉擁有更好的抗回生性和更好的抗消化性[ 6,8-9]。因此，利用淀粉分支酶制備高支化淀粉是一種新型的改性手段。然而，淀粉分支酶主要來源于植物，而微生物來源的淀粉分支酶又通常是胞內(nèi)酶，天然菌產(chǎn)酶能力低下，嚴重制約了該酶的發(fā)展應用。為了克服這一缺陷，通過構建基因工程菌實現(xiàn)酶的胞外過量表達是行之有效的途徑之一。目前，采用Escherichiacoli過量表達淀粉分支酶已有研究報道[10]，本實驗室前期研究中已實現(xiàn)了來源于GeobacillusthermoglucosidansSTB02的SBE酶在E.coliBL21(DE3)中的表達，但僅實現(xiàn)了胞內(nèi)表達[11]，而且E.coli表達系統(tǒng)的安全性相對較低，限制了重組淀粉分支酶的應用，尤其是應用于食品領域。相比于E.coli表達系統(tǒng)，枯草芽孢桿菌表達系統(tǒng)是基因工程安全的宿主菌，是良好的分泌型宿主，可以將異源蛋白分泌至胞外而不會形成包涵體。因此，淀粉分支酶在枯草芽孢桿菌中的胞外表達將會為該酶的應用奠定良好基礎，也將為該酶的進一步研究提供保障。

本實驗室的前期研究已將來源于GeobacillusthermoglucosidansSTB02的SBE酶基因插入質(zhì)粒pST中，構建了分泌性表達載體sbe/pST，實現(xiàn)了在B.subtilisWB600中的胞外表達，但是初始酶活不高，因此，本研究著重對其發(fā)酵條件進行優(yōu)化，提高其胞外酶活力。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

基因工程菌B.subtilisWB600(sbe/pST)保藏于本實驗室。

馬鈴薯支鏈淀粉標準品購自Sigma-Aldrich(上海)公司；SDS-PAGE凝膠電泳試劑盒購自碧云天生物技術研究所；5種典型的培養(yǎng)基(LB、LB+1%葡萄糖、SOB、SOC和TB)參照文獻[12]中方法配置。

ZQZY-70BF振蕩培養(yǎng)箱，上海知楚儀器有限公司；G136TR立式壓力蒸氣滅菌器，致微儀器有限公司；SW-CJ-G 單人凈化工作臺，蘇州凈化設備有限公司；3K15型高速冷凍離心機，Sigma-Aldrich(上海)公司；可見光分光光度計(T6-v)，南京菲勒儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1種子培養(yǎng)

將保藏的重組菌B.subtilisWB600(sbe/pST)接100 μL至裝有50 mL LB培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min，37 ℃，培養(yǎng)8 h。接種前添加終濃度為5 μg/mL的硫酸卡那霉素。

1.2.2搖瓶發(fā)酵

將活化好的種子培養(yǎng)液按4%(v/v)的接種量接入50 mL特定發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，轉(zhuǎn)速200 r/min。需要優(yōu)化的參數(shù)是發(fā)酵初始培養(yǎng)基，發(fā)酵初始pH，發(fā)酵溫度和時間。各培養(yǎng)基使用前添加5 μg/mL的硫酸卡那霉素。

1.2.3菌體濃度測定

采用OD600值表示。

1.2.4酶活測定方法

參照文獻[11]中方法進行，略有改動。將0.9 mL馬鈴薯支鏈淀粉溶液[0.25%(w/v)]在50 ℃保溫10 min，加入0.1 mL酶液在50 ℃下反應15 min。反應結(jié)束后沸水浴滅酶15 min終止反應，10 000 r/min離心2 min待顯色用；顯色體系為0.3 mL反應液與4.0 mL顯色液[0.05%(w/v) KI, 0.005%(w/v) I2, pH 6.0]于7 mL離心管中混合，顯色20 min后530 nm處測定吸光值。酶活單位定義：在上述條件下，吸光值每分鐘降低1%為1個酶活單位。

1.2.5數(shù)據(jù)處理

實驗結(jié)果為3次平行實驗的平均值，用平均值和標準偏差表示。采用軟件Excel2010(Microsoft公司)分析數(shù)據(jù)和作圖；顯著性分析(P< 0.05)采用SPSS軟件進行，通過單因素方差分析(ANOVA)、Student-Newman-Keuls (SNK)程序來實現(xiàn)。

2　結(jié)果與討論

2.1初始培養(yǎng)基

將B.subtilisWB600(sbe/pST)分別置于5種較典型的適合B.subtilis生長的培養(yǎng)基(LB、LB+1%葡萄糖、TB、SOB和SOC)中進行發(fā)酵，結(jié)果如圖1所示。在這些培養(yǎng)基中，TB培養(yǎng)基最有利于重組SBE酶的胞外生產(chǎn)，SOC培養(yǎng)基次之。30 ℃下，B.subtlis在TB培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，胞外酶活達到12.1 U/mL，是在LB培養(yǎng)基中的約8倍。

原因主要包括：(1) TB培養(yǎng)基中磷酸鹽緩沖液提供緩沖環(huán)境，有利于菌體的生長和重組SBE酶的穩(wěn)定；(2)相對其他培養(yǎng)基，TB培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富，更適合B.subtilis生長，能有更多的菌體生產(chǎn)重組SBE酶。因此，選擇TB培養(yǎng)基作為初始培養(yǎng)基。

圖1　發(fā)酵培養(yǎng)基對重組枯草芽孢桿菌產(chǎn)淀粉>分支酶的影響Fig.1　Effect of culture media on production of starch branching enzyme in the recombinant B.subtilis(每個值為3個單獨測定值的平均值，相對偏差小于5%)

2.2發(fā)酵初始pH值

在菌體發(fā)酵過程中，pH對菌體新陳代謝速度和代謝方式均有影響[13]。因此，有必要對發(fā)酵初始pH進行控制。如圖2所示，初始pH為6.5～8有利于產(chǎn)酶；在pH5.5～7.5范圍內(nèi)，酶活隨著pH值的升高而增大，在pH7.5時達到最大，為13.0 U/mL；隨著pH的繼續(xù)升高，酶活呈現(xiàn)下降趨勢，可能是因為堿性條件抑制了菌體生長，同時堿性環(huán)境抑制了淀粉分支酶的酶活。

圖2　初始pH重組枯草芽孢桿菌產(chǎn)淀粉分支酶的影響Fig.2　Effect of initial pH on production of starch branching enzyme in the recombinant B.subtilis(每個值為3個單獨測定值的平均值，相對偏差小于5%)

2.3培養(yǎng)溫度和時間

培養(yǎng)溫度影響菌體生長和代謝速度，因此有必要控制好培養(yǎng)溫度。4種不同培養(yǎng)溫度對菌體生長和產(chǎn)酶的影響如圖3所示。從圖3A可以看出，當發(fā)酵時間為12 h時，30 ℃下的酶活最大；進一步發(fā)酵至24 h時，25 ℃下的酶活最大，而20 ℃和37 ℃均不利于酶的分泌。從圖3B可以看出，發(fā)酵前期，隨著溫度的升高，菌體生長速率加快。可能原因是：(1)溫度太低時，菌體代謝速度太慢，限制了重組SBE的胞外表達；(2)溫度較高時質(zhì)粒丟失率較大，穩(wěn)定性大大降低，從而影響產(chǎn)酶；(3)溫度較高時SBE前體蛋白合成速率太快，導致部分在跨膜之前就自發(fā)折疊，不能成為正確的構象；(4)溫度越高，菌體利用營養(yǎng)的速度加快，當養(yǎng)分利用完全，菌體開始發(fā)生自溶。綜合考慮，選擇25 ℃，發(fā)酵24 h為較優(yōu)條件，酶活達到19.9 U/mL。

A：發(fā)酵溫度對胞外酶活力的影響；B：發(fā)酵溫度對菌體生長的影響圖3　發(fā)酵溫度對重組枯草芽孢桿菌產(chǎn)淀粉分支酶的影響Fig.3　Effect of temperature on production of starch branching enzyme in the recombinant B.subtilis(每個值為3次獨立實驗的平均值，相對偏差小于5%)

2.4兩階段溫度控制策略提高酶的胞外表達

溫度對微生物的菌體生長和酶的分泌有重大影響，國內(nèi)外已有學者采用了溫度調(diào)控策略進行發(fā)酵，并取得了一定的效果。李兆豐等[14]采用先25 ℃后30 ℃的策略生產(chǎn)α-CGT酶，酶活相比恒定25 ℃時提高了45%。ZHU等[15]采用先37 ℃后35 ℃的策略生產(chǎn)1,3-丙二醇，產(chǎn)量比恒定35 ℃時提高了11%。從前面實驗結(jié)果可以看出，在發(fā)酵前期0～12 h，30 ℃最有利于重組淀粉分支酶的分泌，從12 h至發(fā)酵結(jié)束，25 ℃最有利于重組酶的表達。而菌體的生長最適溫度37 ℃與酶的最適分泌溫度25 ℃是不一致?；诖耍瑖L試兩階段溫度控制策略，先利用較高的溫度促進菌體生長，再利用較低溫度促進其分泌。當在37 ℃或者30 ℃下發(fā)酵12 h，然后變溫到25 ℃繼續(xù)發(fā)酵12 h，酶活分別為30.3 U/mL和47.1 U/mL，比恒定25 ℃條件下的酶活分別提高了50%和140%。

進一步分析了不同變溫時間對胞外酶活的影響。圖4A為先37 ℃培養(yǎng)，后變溫至25 ℃，發(fā)現(xiàn)在前12個小時內(nèi)變溫的酶活均比恒定25 ℃的要高，當變溫時間9 h時，酶活最高，達到37.6 U/mL。圖4B為先30 ℃培養(yǎng)，后變溫至25 ℃。當變溫時間為12 h時，酶活最高，達到47.1 U/mL?？偘l(fā)酵時間為24 h。因此，選擇較優(yōu)發(fā)酵條件為：以TB為發(fā)酵培養(yǎng)基，初始pH為7.5，先在30 ℃下發(fā)酵12 h，變溫到25 ℃繼續(xù)發(fā)酵12 h。得到的胞外分支酶酶活是單一溫度發(fā)酵模式最高水平(恒溫25 ℃)的2.4倍，達到47.1 U/mL。

A：溫度由37 ℃變至25 ℃；B：溫度由30 ℃變至25 ℃圖4　變溫時間對重組枯草芽孢桿菌產(chǎn)淀粉分支酶的影響Fig.4　Effect of temperature-changing time on production of starch branching enzyme in the recombinant B.subtilis(每個值為3次獨立實驗的平均值，相對偏差小于5%)

2.5助劑的添加對重組淀粉分支酶的胞外表達的影響

有研究表明，在培養(yǎng)基中添加某些助劑，如金屬離子、表面活性劑等，對重組酶在B.subtilis中的分泌有一定的促進作用[16-17]，李才明等[18]研究發(fā)現(xiàn)，0.5 mmol/L 的Fe3+能明顯促進β-CGT酶在B.subtilis中的分泌表達；RAO等[19]研究發(fā)現(xiàn)SDS、吐溫-80對α-淀粉酶的分泌有促進。

在最優(yōu)發(fā)酵條件的基礎上，本文進一步嘗試了添加幾種金屬離子和幾種表面活性劑，研究其對重組SBE酶在B.subtilis中的分泌表達的影響。

2.5.1添加金屬離子對重組SBE酶胞外表達的影響

不同金屬離子對重組SBE酶胞外表達的影響如表1所示，在培養(yǎng)基中添加Co3+、Ba2+顯著抑制SBE酶的胞外分泌，可能是分泌在培養(yǎng)基中的重組SBE酶的活性中心遭到破壞，從而喪失了分支酶的活性；添加Mg2+、Ca2+和K+對酶活幾乎沒有影響；添加Na+使得酶活下降5.3%，原因可能是Na+含量增大，改變了細胞膜內(nèi)外Na+的濃度梯度，影響了蛋白的主動運輸；而在培養(yǎng)基中添加0.2 mmol/L Fe3+能夠?qū)l(fā)酵液中SBE的酶活提高7.2%，有必要對其添加量進一步研究。

表1　金屬離子對重組枯草芽孢桿菌產(chǎn)淀粉分支酶的影響

注：1)不加助劑。每個值為3次獨立實驗的平均值，不同字母表示顯著性差異(P< 0.05)。

進一步研究了不同添加量的Fe3+對重組SBE分泌的影響，如表2所示，添加0.3 mmol/L 的Fe3+時胞外酶活最高，比不添加Fe3+提高了8.5%。繼續(xù)增加Fe3+的濃度，反而會導致酶活下降。

表2　不同濃度Fe3+對重組枯草芽孢桿菌產(chǎn)淀粉分支酶的影響

注：1)不加助劑。每個值為3次獨立實驗的平均值，字母a表示沒有顯著性差異(P> 0.05)。

2.5.2添加表面活性劑對重組SBE酶胞外表達的影響

分析了3種不同濃度添加量的吐溫-80、SDS、PEG 4000和曲拉通-100對重組酶在B.subtilis中分泌表達的影響。如表3所示,與對照相比，添加0.05%的吐溫-80能夠?qū)⒚富钐岣?0.0%；添加0.10%的SDS能夠?qū)⒚富钐岣?7.7%；添加0.05%的PEG 4000能夠?qū)⒚富钐岣?.4%；而添加曲拉通-100酶活反而使得酶活下降。

表3　不同表面活性劑對重組枯草芽孢桿菌產(chǎn)淀粉分支酶的影響

注：1)不加助劑。每個值為3次獨立實驗的平均值，不同字母表示顯著性差異(P< 0.05)。

吐溫-80是非離子表面活性劑，SDS是陰離子表面活性劑，二者對細胞膜的通透性均有一定的改善作用[20-21]；PEG 4000是一種乳化劑，也能改善細胞膜的通透性[22]；細胞膜通透性的改善有利于更多的重組SBE酶分泌到胞外[20-22]。隨著三者的濃度增加，酶活都出現(xiàn)先增大后降低的趨勢，這是因為三者均使得培養(yǎng)基的稠度增大，減少了菌體對氧氣的利用率，稠度過高，抑制了菌體的生長[21]，不利于酶的分泌表達。曲拉通-100也是一種非離子表面活性劑，當其添加濃度為0.10%時，顯著抑制了SBE酶的胞外表達，可能是因為曲拉通-100中的羥基容易與蛋白質(zhì)分子形成氫鍵,改變了蛋白質(zhì)分子的構象,降低蛋白質(zhì)的活性[23-24]。

2.5.3復合添加Fe3+以及吐溫-80對重組SBE酶胞外表達的影響

在培養(yǎng)基中添加0.3 mmol/L 的Fe3+和0.05%的吐溫-80，檢測出胞外酶活66.0 U/mL，與單獨添加0.05%的吐溫-80酶活水平接近，說明二種助劑未顯示出協(xié)同作用。

3　結(jié)論

本文對淀粉分支酶的胞外表達體系B.subtilisWB600(sbe/pST)進行了搖瓶優(yōu)化。在搖瓶發(fā)酵優(yōu)化的基礎上，利用兩階段溫度控制策略，進一步提高了酶活，達到47.1 U/mL。在此基礎上添加微量吐溫-80，進一步提高分泌水平達到65.8 U/mL，這是目前國內(nèi)首次報道對淀粉分支酶在B.subtilis中的胞外表達。雖然在發(fā)酵水平上，此胞外表達體系的酶活依然低于其在胞內(nèi)表達的酶活[11]，但是從下游工藝來說，減少了破壁的步驟，大大降低了經(jīng)濟成本；另一方面，B.subtilis的表達體系較大腸桿菌的胞內(nèi)表達體系，更安全，不易形成包涵體和基本無內(nèi)毒素[25-26]。

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Higher extracellular expression of starch branching enzyme by two-staged temperature strategy and additives

WANG Chi1，LI Zhu1，LI Cai-ming1,2,3，GU Zheng-biao1,2,3*，HONG Yan1,2,3，CHENG Li1,2,3，LI Zhao-feng1,2,3*

1(School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)2(The Start Key Laboratory of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)3(Collaborative Innovation Center for Food Safety and Quality Control, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

The fermentation conditions were optimized in the shake flask in order to further enhance the extracellular expression of recombinant Starch Branching Enzyme (SBE) byBacillussubtilisWB600. Effects of four factors including culture media, initial pH, temperature and culture time were firstly investigated in succession on extracellular expression with extracellular enzyme activity as an index. The level of extracellular expression was further improved by a two-staged temperature strategy. The results showed that the extracellular SBE activity was 19.9 U/mL while the culture was performed in TB medium, pH7.5, at 25 ℃ for 24 h. Meanwhile the optimum temperature for cell growth is inconsistent with that for secretion. By the two-staged temperature strategy (temperature was controlled at 30 ℃ for the first 12 h and then switched to 25 ℃ till the end of the fermentation), the extracellular activity reached 47.1 U/mL, increased by 140% compared to the constant temperature operation at 25 ℃. It was further increased by 40% to 65.8 U/mL after addition of Tween-80(0.05%,w/v).

starch branching enzyme (SBE); extracellular expression; two-staged temperature strategy; optimization of fermentation

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201608004

碩士研究生(顧正彪教授和李兆豐副教授為共同通訊作者，E-mail: zhengbiaogu@jiangnan.edu.cn; zfli@jiangnan.edu.cn)。

高校博士點基金專項課題優(yōu)先發(fā)展領域課題(20130093130001)；中國博士后科學基金-面上資助(2014M560394)；江蘇省博士后科研資助計劃(1401100C)；江蘇省科技支撐計劃-農(nóng)業(yè)部分(BE2014305)。

2016-02-07，改回日期：2015-03-18