李婷,張小麗,蔣予箭
(浙江工商大學(xué),浙江 杭州,310018)
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脹袋醬油中產(chǎn)氣微生物來(lái)源的調(diào)查
李婷,張小麗,蔣予箭*
(浙江工商大學(xué),浙江 杭州,310018)
導(dǎo)致醬油脹袋的微生物一般來(lái)自醬油的生產(chǎn)和包裝環(huán)境,通過(guò)對(duì)醬油生產(chǎn)過(guò)程中發(fā)酵醬醅間、灌裝間和貼標(biāo)間的空氣中微生物和生產(chǎn)環(huán)節(jié)發(fā)酵醬醅、沉淀罐、生油儲(chǔ)罐、成品油儲(chǔ)罐中醬油產(chǎn)氣微生物的情況進(jìn)行調(diào)查。對(duì)車間空氣中的微生物情況調(diào)查顯示,發(fā)酵車間以霉菌為主,灌裝車間空氣中存在枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)及其亞種(Bacillus subtilissubsp. natto)(J1和J4含量均在102CFU/L左右),和破布子乳酸菌(Lactobacillus pobuzihii)(J6)兩種類似產(chǎn)氣微生物。生產(chǎn)環(huán)節(jié)的發(fā)酵醬醅、沉淀罐、熟油罐、成品罐醬油樣品中檢測(cè)到類似枯草芽孢桿菌的含量分別在105、104、103、102CFU/mL以上,熟油罐和成品罐中檢測(cè)到類似破布子乳酸菌的細(xì)菌濃度分別在104、102CFU/mL左右。在生產(chǎn)條件及殺菌指標(biāo)均正常的情況下,提高灌裝車間空氣清潔度和防止熟油罐和成品罐中二次污染是減少醬油產(chǎn)品產(chǎn)生脹袋的必要途徑。
脹袋醬油;車間空氣;生產(chǎn)環(huán)節(jié);微生物來(lái)源
醬油是以黃豆(或豆粕)、小麥(或面粉、麩皮)為主要原料經(jīng)微生物發(fā)酵釀制而成的一種傳統(tǒng)調(diào)味品,富含氨基酸、糖分等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[1]。在環(huán)境氣溫高、濕度大的春夏季時(shí),醬油容易出現(xiàn)脹袋現(xiàn)象。通過(guò)對(duì)產(chǎn)自浙江紹興某廠生產(chǎn)后脹袋醬油中的微生物進(jìn)行分離,分離出了3種細(xì)菌,經(jīng)鑒定分別是枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)(J1)、枯草芽孢桿菌亞種(Bacillus subtilissubsp. natto)(J4)和破布子乳酸菌(Lactobacillus pobuzihii)(J6),它們共同作用導(dǎo)致醬油出現(xiàn)明顯的脹袋現(xiàn)象[2]。污染食品的微生物一般是來(lái)自食品所在的環(huán)境,環(huán)境中的微生物利用食品中豐富營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行侵入,繼而生長(zhǎng)繁殖[2-5]。浙江紹興某廠生長(zhǎng)醬油的工藝流程如下:
種曲
↓
豆粕、小麥(麩皮)→蒸料→混合接種→圓盤制曲→成曲→制醅→淋澆發(fā)酵→淋油→沉淀罐→殺菌→熟油儲(chǔ)罐→配兌→殺菌→成品罐→灌裝→成品
調(diào)查脹袋醬油中產(chǎn)氣微生物的來(lái)源,應(yīng)重點(diǎn)研究醬油生產(chǎn)后期環(huán)境和環(huán)節(jié),可以找出造成醬油二次污染的污染源;對(duì)于醬油一次殺菌前的環(huán)節(jié)也應(yīng)有所調(diào)查,若是污染嚴(yán)重,芽孢桿菌的含量較高,后期的滅菌很難將其殺死,也將為后期成品的安全性帶來(lái)一定的隱患。由于醬油脹袋大多發(fā)生于春、夏季節(jié),這個(gè)時(shí)候是產(chǎn)氣微生物生長(zhǎng)旺盛的季節(jié),故采樣在3~6月份進(jìn)行[3]。
通過(guò)對(duì)醬油生產(chǎn)過(guò)程中,關(guān)鍵工序的醬油中微生物及生產(chǎn)車間環(huán)境空氣中微生物的調(diào)查,掌握導(dǎo)致醬油脹袋的微生物主要來(lái)源,可以切斷污染途徑和控制產(chǎn)氣微生物,這對(duì)防治醬油產(chǎn)品的污染具有十分重要的意義。
1.1材料與設(shè)備
1.1.1產(chǎn)氣微生物
已經(jīng)分離出枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)(J1)、枯草芽孢桿菌亞種(Bacillus subtilissubsp. natto)(J4)和破布子乳酸菌(Lactobacillus pobuzihii)(J6)共同作用導(dǎo)致醬油嚴(yán)重脹袋[4]。
J1菌株、J4菌株、J6菌株在醬油固體培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)及革蘭氏染色后100倍顯微鏡觀察的個(gè)體形態(tài)如圖1,圖2,圖3所示。
1.1.2主要培養(yǎng)基
(1)營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基:蛋白胨10.0g,牛肉浸膏3.0g,氯化鈉5.0g,瓊脂粉20g,蒸餾水1L,pH7.0~7.2,121 ℃ 滅菌15min。用于空氣采樣和細(xì)菌分離。
圖1 J1菌株在營(yíng)養(yǎng)瓊脂(A)和醬油固體培養(yǎng)基(B)上的形態(tài)及革蘭氏染色形態(tài)(C)Fig.1 Morphology of J1 strain on NA (A) , soy sauce agar (B) meduim and gram staining (C)
圖2 J4菌株在營(yíng)養(yǎng)瓊脂(A)和醬油固體培養(yǎng)基(B)上的形態(tài)及革蘭氏染色形態(tài)(C)Fig.2 Morphology of J4 strain on NA (A) , soy sauce agar meduim(B) and gram staining (C)
圖3 J6菌株在醬油固體培養(yǎng)基上的形態(tài)(A)和革蘭氏染色形態(tài)(B)Fig.3 Morphology of J6 strain on soy sauce agar meduim (A) and gram staining (B)
(2)醬油培養(yǎng)基:大豆蛋白胨5.0g,牛肉浸膏1.5g,氯化鈉5.0g,250mL醬油,蒸餾水750mL,pH:7.0~7.2,121 ℃ 滅菌15min。用于液體空氣采樣。
(3)醬油固體培養(yǎng)基:大豆蛋白胨5.0g,牛肉浸膏1.5g,氯化鈉5.0g,250mL醬油,瓊脂粉20g,蒸餾水750mL,pH:7.0~7.2,121 ℃ 滅菌15min。用于分離醬油中的細(xì)菌。
(4)產(chǎn)氣培養(yǎng)基:醬油原油50mL,蒸餾水50mL,pH5.5,加入杜氏管,115 ℃滅菌20min。
在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的配方中添加0.5、4.0、8.0g的氯化鈉制成含0.5%、4%、8%鹽分的培養(yǎng)基。
1.1.3儀器和設(shè)備
AR-2140型電子分析天平,奧豪斯國(guó)際貿(mào)易有限公司;隔水式恒溫培養(yǎng)箱,精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;NikonE100型生物顯微鏡,上海澤途機(jī)電設(shè)備有限公司;pHS-3C型酸度計(jì),梅特勒-托利多儀器有限公司;SW-CJ-1FD型超凈工作臺(tái),上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;GZX-9070MBE型電熱鼓風(fēng)干燥箱,上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;YXQ-LS-SII型立式壓力蒸汽滅菌器,上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備。
1.2實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1生產(chǎn)車間空氣中細(xì)菌的采樣
本試驗(yàn)選用兩種采樣方式,分別使用加入0.5%、4%、8%的含鹽營(yíng)養(yǎng)瓊脂平皿和液體醬油培養(yǎng)基,固體平皿采樣方法參照GB/T18204.1—2000《公共場(chǎng)所空氣微生物檢驗(yàn)方法-細(xì)菌總數(shù)測(cè)定》中的自然沉降法[6];液體采樣選用錐形瓶裝,采樣時(shí)打開(kāi)錐形瓶塞,其他方法同上。
采樣地點(diǎn):發(fā)酵間,灌裝間,貼標(biāo)間。采樣時(shí)間:營(yíng)養(yǎng)瓊脂平皿在2014年3、4、5、6月份中旬中午12:00~13:00采樣,液體醬油培養(yǎng)基在2014年5、6月份中旬中午12:00~13:00采樣。
結(jié)果分析:(1)營(yíng)養(yǎng)瓊脂平皿采樣結(jié)果的分析方法如下:采用肉眼分辨的方法數(shù)出培養(yǎng)皿上的菌落數(shù),然后根據(jù)奧梅梁斯基公式將菌落數(shù)單位轉(zhuǎn)化為CFU/m3[7]。
(1)
式中:C為空氣中的細(xì)菌數(shù),CFU/m3;N為平均菌落數(shù),CFU/皿;A為所用的平板面積,cm2;t為平板暴露時(shí)間,min。由公式(1)計(jì)算車間空氣中的微生物濃度。
(2)液體錐形瓶采樣結(jié)果的分析方法:采用醬油培養(yǎng)基分離其中的微生物,觀察分離出的微生物形態(tài),并計(jì)數(shù)。
對(duì)采集到的微生物,首先通過(guò)菌落形態(tài)判斷其是否為細(xì)菌,對(duì)疑似細(xì)菌的進(jìn)行革蘭氏染色顯微鏡觀察個(gè)體形態(tài),初步判斷是否和產(chǎn)氣微生物相似。
1.2.2生產(chǎn)環(huán)節(jié)中細(xì)菌的采樣
取樣點(diǎn):發(fā)酵醬醅,沉淀罐,生油儲(chǔ)罐,成品油儲(chǔ)罐。醬油在4個(gè)環(huán)節(jié)的處理流程如下:
使用無(wú)菌錐形瓶對(duì)各環(huán)節(jié)取樣調(diào)查[8-9],采樣時(shí)間均在2014年5、6月份中旬,中午12:00~13:00進(jìn)行。
對(duì)采集到的樣品采用營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和醬油固體培養(yǎng)基分離其中的微生物,并計(jì)數(shù)。根據(jù)分離到的微生物形態(tài)不同,對(duì)疑似細(xì)菌的菌落,進(jìn)行革蘭氏染色,用顯微鏡觀察個(gè)體形態(tài),初步判斷是否和J1、J4、J6菌株相似。
2.1生產(chǎn)車間空氣中細(xì)菌的采樣結(jié)果
2.1.1固體采樣培養(yǎng)基的篩選結(jié)果
空氣采樣選用了含0.5%、4%、8%三種不同鹽分的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,結(jié)果發(fā)現(xiàn),用4% 鹽分的培養(yǎng)基采樣效果最好,平皿上的霉菌和酵母菌數(shù)量比0.5%鹽分上的少,且細(xì)菌的數(shù)量和0.5% 鹽分的相同,含量為8% 鹽分的培養(yǎng)基上只有霉菌長(zhǎng)出,故選用含4% 鹽分的培養(yǎng)基為最佳空氣采樣培養(yǎng)基。
2.1.2車間空氣固體平皿采樣結(jié)果
(1)3、4、5、6月份發(fā)酵間空氣中的微生物情況及類似產(chǎn)氣微生物的芽孢桿菌含量及多重比較結(jié)果如表1所示;用奧姆斯基公式計(jì)算車間空氣每立方米的含菌量,連續(xù)4個(gè)月采樣空氣中微生物濃度的變化如圖4所示。
表1 不同月份發(fā)酵間空氣中含的微生物情況
圖4 不同月份發(fā)酵間空氣中細(xì)菌和芽孢桿菌的含量Fig.4 Bacteria and bacillus amount in the air of fermentation workshop in different month
5、6月份發(fā)酵間的霉菌太多,長(zhǎng)滿了平皿,肉眼計(jì)數(shù)無(wú)法計(jì)算總的菌落數(shù)。由表1和圖4可以看出,發(fā)酵間中細(xì)菌和芽孢桿菌的含量在3~6月份呈遞增趨勢(shì),這是因?yàn)榇蟛糠旨?xì)菌為中溫菌,在25~37 ℃能很好生長(zhǎng),在6月份空氣中細(xì)菌含量顯著高于其他3個(gè)月份,達(dá)到4.4×104CFU/m3,類似J1和J4菌株的芽孢桿菌的含量也最高為1.5×103CFU/m3。參考前人研究,發(fā)酵間的環(huán)境是清潔的,不會(huì)對(duì)產(chǎn)品安全有影響[7-8]。
(2)3、4、5、6月份灌裝間空氣中的微生物情況及類似產(chǎn)氣微生物的芽孢桿菌含量及多重比較結(jié)果如表2;用奧姆斯基公式計(jì)算車間空氣每立方米的含菌量,4個(gè)月份空氣中微生物濃度的變化如圖5所示。
表2 不同月份灌裝間空氣中含的微生物情況
圖5 不同月份灌裝間空氣中總的微生物及細(xì)菌和芽孢桿菌的含量Fig.5 Microbe, bacteria and bacillus amount in the air of filing workshop in different month
由表2和圖5可以看出,在 3、4、5、6四個(gè)月中4月份總的微生物量顯著高于其他3、5、6月,高達(dá)3.5
×104CFU/m3,對(duì)比之前的研究發(fā)現(xiàn),環(huán)境有輕微污染[8]。細(xì)菌和芽孢桿菌的含量在這4個(gè)月中的變化不顯著,只是霉菌的含量變動(dòng)較大。經(jīng)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)灌裝間中含有的芽孢桿菌類似J1菌株,濃度在100CFU/m3左右,含量雖然很低,但若是灌裝間總體環(huán)境不好的話,也會(huì)存在污染食品的可能,所以在4月份時(shí)對(duì)灌裝間的空氣環(huán)境應(yīng)加以注意。
(3)3、4、5、6月份貼標(biāo)間空氣中采樣平皿采集到的微生物情況及類似產(chǎn)氣微生物的芽孢桿菌含量及多重比較結(jié)果如表3所示;通過(guò)奧姆斯基公式計(jì)算車間每立方米的含菌量,4個(gè)月采樣空氣中微生物濃度的變化如圖6所示。
表3 不同月份貼標(biāo)間空氣中含的微生物情況
圖6 不同月份貼標(biāo)間空氣中總的微生物及細(xì)菌和芽孢桿菌的含量Fig.6 Microbe, bacteria and bacillus amount in the air of filing workshop in different month
由表3和圖6可以看出,貼標(biāo)間總的含菌量3月和5月份無(wú)顯著性差異,但與4、6月份相比存在顯著性差異。圖中可以看出4月份總的含菌量最高為3.0×104CFU/m3,這和灌裝間是相似的。3月份總的含菌量最低為9.1×103CFU/m3;5月份的細(xì)菌含量最高為1.6×103CFU/m3,在3~6月份期間,芽孢桿菌的含量依次降低。貼標(biāo)間類似J1和J4菌株的芽孢桿菌在3月份含量最高為3.3×102CFU/m3。
以上結(jié)果可以看出,貼標(biāo)間的環(huán)境較差,芽孢桿菌含量較高,貼標(biāo)間和灌裝間同屬于灌裝車間,若是貼標(biāo)間的環(huán)境控制不好,微生物隨空氣的流通很可能會(huì)把這些芽孢桿菌帶入灌裝車間,會(huì)對(duì)灌裝環(huán)境潔凈度的控制造成不利影響[12]。
2.1.3車間空氣液體培養(yǎng)基采樣結(jié)果
用液體醬油培養(yǎng)基采集空氣中的兼性厭氧菌,并用醬油固體培養(yǎng)基對(duì)其中的微生物進(jìn)行分離,發(fā)現(xiàn)發(fā)酵間、灌裝間都含有長(zhǎng)在培養(yǎng)基底部的微生物。對(duì)培養(yǎng)基底部的微生物進(jìn)行革蘭氏染色,發(fā)現(xiàn)有兩種形態(tài)不同菌,結(jié)果如圖7所示。
圖7 培養(yǎng)基底部細(xì)菌的革蘭氏染色40倍顯微鏡觀察結(jié)果Fig.7 Gram staining of bacterial which grown at the bottom of medium 40×observation
由圖7可以看出,編號(hào)為A的菌株個(gè)體形態(tài)呈桿狀,革蘭氏染色呈陽(yáng)性,和J6菌株的形態(tài)相似,編號(hào)為B的個(gè)體形態(tài)呈短桿狀,橢圓,菌體很小,近似球狀,類似J1、J4菌株的形態(tài)。5月份的灌裝間含有類似J6菌株的微生物,細(xì)菌繁殖速度快,很快就能增加到幾個(gè)數(shù)量級(jí),存在污染醬油的隱患。
2.2生產(chǎn)環(huán)節(jié)中細(xì)菌的采樣結(jié)果
5、6月份不同環(huán)節(jié)中含有的類似J1和J4菌株的芽孢桿菌的數(shù)量和類似J6菌株的乳酸菌的數(shù)量如圖8、9所示。
圖8 5月份各環(huán)節(jié)芽孢桿菌和乳酸菌的含量Fig.8 Amount of bacillus and lactic acid bacteria of each processes in May
圖9 6月份各環(huán)節(jié)芽孢桿菌和乳酸菌的含量Fig.9 Amount of bacillus and lactic acid bacteria of each processes in June
從醬油生產(chǎn)環(huán)節(jié)中分離到了多種芽孢桿菌,此結(jié)論與之前的研究相似[11-12],由圖8和圖9可以看出,類似J1、J4菌株的芽孢桿菌與類似J6菌株的乳酸菌在發(fā)酵醬醅中含量最高,發(fā)酵醬醅中芽孢桿菌和乳酸菌的含量以6月份最高分別為1.2×105CFU/mL和5.0×105CFU/mL;發(fā)酵醬醅經(jīng)過(guò)淋油工序和一次滅菌后管道輸送到沉淀罐,乳酸菌的含量降為0,芽孢桿菌的濃度降到了103CFU/mL;沉淀后的醬油,取上清液輸送到熟油儲(chǔ)罐后,芽孢桿菌和乳酸菌的含量都大幅度增加,分別達(dá)到3.9×104CFU/mL和8.9×104CFU/mL;再經(jīng)二次滅菌后于成品罐儲(chǔ)存,成品罐中的芽孢桿菌和乳酸菌的總含量仍在300CFU/mL以上,5月份的成品罐被類似J6菌株的乳酸菌嚴(yán)重污染,平均含量達(dá)1.9×104CFU/mL;成品罐是用來(lái)存放已經(jīng)滅菌的醬油,產(chǎn)氣微生物含量過(guò)多,在灌裝后很容易二次生產(chǎn),導(dǎo)致醬油脹袋[13]。
通過(guò)以上分析可知,若是醬油由沉淀罐到原油儲(chǔ)罐的環(huán)節(jié)控制不好的話,熟醬油經(jīng)調(diào)配滅菌后,芽孢桿菌和乳酸菌的總含量是不能降到300CFU/mL以下的,達(dá)不到國(guó)家規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn),此階段應(yīng)為關(guān)鍵控制環(huán)節(jié)。成品罐中類似J6菌株的乳酸菌的含量在300CFU/mL,而J6菌株處于厭氧環(huán)境中時(shí)繁殖速度較快。由此可見(jiàn),從熟油儲(chǔ)罐到成品罐環(huán)節(jié)有乳酸菌的污染,此階段也為關(guān)鍵控制點(diǎn)。找出關(guān)鍵控制點(diǎn)后,工廠應(yīng)依據(jù)關(guān)鍵控制點(diǎn)制定各項(xiàng)控制指標(biāo),對(duì)醬油企業(yè)設(shè)備、技術(shù)、管理等方面進(jìn)行改造,并堅(jiān)持不懈地持續(xù)改進(jìn),這是企業(yè)實(shí)施清潔生產(chǎn)最有效的方式與途徑[15]。
(1) 采用4%鹽分的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和液體醬油培養(yǎng)基對(duì)發(fā)酵間、灌裝間和貼標(biāo)間3個(gè)采樣點(diǎn)空氣中的微生物進(jìn)行調(diào)查,結(jié)果表明:發(fā)酵間以霉菌為主,類似J1、J4菌株的芽孢桿菌所占比例較小,環(huán)境較清潔。灌裝間有類似J1和J4菌株的芽孢桿菌含量在102CFU/m3左右,且含有類似J6菌株的乳酸菌。貼標(biāo)間中類似J1和J4菌株的芽孢桿菌最高含量為3.3×102CFU/m3不含有類似J6菌株的乳酸菌。灌裝車間中含有導(dǎo)致醬油脹袋的微生物,雖然含量很低,若是控制不好,仍有污染食品的可能,對(duì)灌裝車間應(yīng)適時(shí)監(jiān)控,避免污染食品。
(2) 對(duì)發(fā)酵醬醅、沉淀罐、熟油儲(chǔ)罐、成品罐4個(gè)環(huán)節(jié)點(diǎn)取樣調(diào)查,結(jié)果表明:沉淀罐中類似J1、J4菌株的芽孢桿菌含量在103CFU/mL以上,不含有類似J6菌株的乳酸菌。熟油罐中類似J1、J4菌株的芽孢桿菌與類似J6菌株的乳酸菌含量都在104CFU/mL以上,相對(duì)于沉淀罐有所升高。成品罐中類似J6菌株的乳酸菌含量在300CFU/mL以上,類似J1、J4菌株的芽孢桿菌含量低于102CFU/mL。由此可見(jiàn),從沉淀罐到成品罐的輸送管道和罐的厭氧環(huán)境中都有污染產(chǎn)氣微生物的可能。
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Microbialsourcesofaerogenfromexplosionbagsofsoysauce
LITing,ZHANGXiao-li,JIANGYu-jian*
(CollegeofFoodScienceandBiotechnologyEngineering,ZhejiangGongshangUniversity,Hangzhou310018,China)
Microorganismswhichresultinswollenbagsofsoysaucearegenerallyfromsoysauceproductionandpackagingoftheenvironment.Inthispaper,theconditionofairmicroorganismsduringsoysauceproductioninfermenting,bottlingandlabelingroom,andgas-producingmicroorganismsduringtheproductionoffermentedsauceinsedimentationtankandoiltank,wasinvestigated.Accordingtothesurvey,themicroorganismsintheairoffermentationworkshopmainlywasmold,andmicroorganismsintheairofbottlingworkplaceweretwokindsofsimilargasmicroorganisms, Bacillus subtilis (J1andJ4contentarearound102CFU/L),andLactobacillus pobuzihii (J6).ThecontentofmicroorganismssimilartoBacillus subtilisinfermentationtank,sedimentationtank,cookedinsoysaucesampletankandfinishedproductswere105, 104, 103102CFU/mL.ThecontentofmicroorganismssimilartoLactobacillus pobuzihiiincookedoiltankandfinishedproducttankwere104and102CFU/mL.Soimprovementofaircleanlinessinthefillingworkshopandpreventionofsecondarypollutionincookedoiltankandfinishedproducttankwouldreducetheamountofbulgebagduringsoysauceproduction.
Sauceexplosionandleakagebags;workplaceair;productionprocesses;microbialsources
10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201608018
碩士研究生(蔣予箭教授為通訊作者,E-mail:13357180599@189.cn)。
食品科學(xué)與工程浙江省重中之重一級(jí)學(xué)科
(JYTsp20142082)
2016-02-28,改回日期:2016-03-30