高靜 吳景芝 郭彥兵 吳紅芝

摘 要 彩色馬蹄蓮對低溫較敏感，當溫度低于6℃就會產(chǎn)生低溫傷害。為摸清彩色馬蹄蓮多倍體是否在抗寒性方面有所改善，以2個彩色馬蹄蓮品種（Ym039、Gold affair）的四倍體及二倍體試管苗為材料，煉苗移栽成活后，進行低溫脅迫和常溫對照處理，并檢測抗寒性相關(guān)生理指標。結(jié)果表明：（2±0.5）℃下10 d后二倍體死亡率超過50%，四倍體死亡率30%左右；（6±0.5）℃低溫脅迫下，多倍體品種游離脯氨酸、MDA含量低于二倍體，而游離脯氨酸含量、可溶性蛋白含量、POD活性、SOD活性均不同程度高于二倍體。上述生理指標均表明，多倍體抗寒性比二倍體增強，通過多倍體途徑培育抗寒性品種具有可行性。

關(guān)鍵詞 彩色馬蹄蓮 ；低溫脅迫 ；抗寒性 ；生理生化指標 ；成活率

中圖分類號 S682.2 文獻標識碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.07.012

彩色馬蹄蓮（Zantedeschia hybrida）屬天南星科（Araceae）馬蹄蓮屬（Zantedeschia）多年生草本球根花卉[1]，原產(chǎn)于非洲南部及埃及的河流、沼澤地。因其佛焰苞喇叭形（部分品種先端長尖）、形似馬蹄狀而得名，佛焰苞色彩豐富艷麗有紅色、黃色，粉紅色、橙色等。葉為基生型，葉柄較長，葉片多為箭形或戟形鮮綠色，部分品種葉片上有銀星斑點分布。由于彩色馬蹄蓮色彩豐富、形態(tài)高雅、用途廣泛，被譽為“21世紀花卉之星”。近幾年彩色馬蹄蓮在國內(nèi)外都越來越受歡迎，其中以鮮切花和盆花發(fā)展較好。

與二倍體相比，多倍體由于基因劑量效應(yīng)會帶來植株器官巨大性的變化，同時多倍體基因劑量的倍增，使植株內(nèi)的基因活性及酶的差異性得以增強，從而加強了植株的生態(tài)適應(yīng)力和逆境抗性，使其在生活力、對環(huán)境的適應(yīng)性、抗旱、抗寒及抗病蟲害等方面都表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢[2-3]。

彩色馬蹄蓮對環(huán)境條件要求比較嚴格，高溫高濕容易誘發(fā)軟腐病，溫度過低會使植株受凍。最適合彩色馬蹄蓮生長的溫度范圍為18～23℃，冬季溫度過低或夏季溫度過高，植株葉會枯萎，進入休眠狀態(tài)[4]。彩色馬蹄蓮喜溫暖濕潤環(huán)境，低溫仍然是影響彩色馬蹄蓮產(chǎn)量和品質(zhì)的主要因子之一。因此，研究提高彩色馬蹄蓮抗寒性，減少低溫造成的損失，在生產(chǎn)上有著重要的現(xiàn)實意義[5]。

國外已有體細胞染色體加倍培育彩色馬蹄蓮多倍體品種的報道，國內(nèi)也有關(guān)于使用秋水仙素[6]及除草劑Oryzalin[7]對彩色馬蹄蓮多倍體誘導的報道。但對馬蹄蓮多倍體的生物學特征、生理生化特性等的研究報道甚少。因此，研究彩色馬蹄蓮多倍體抗逆性具有重要意義，其中多倍體抗寒性特征可為抗寒性品種的篩選及培育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

彩色馬蹄蓮Ym039、Gold affair的無性四倍體及二倍體組培苗，云南農(nóng)業(yè)大學園林園藝學院提供。

1.2 方法

1.2.1 多倍體幼苗離體培養(yǎng)

多倍體幼苗離體培育包括無菌體系建立、增殖、壯苗、生根等階段。增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30g/L，壯苗培養(yǎng)基MS+6-BA1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L，生根培養(yǎng)基：MS+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L。以上過程均在溫度（23±2）℃，光照1 000～2 000 lx的培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.2 煉苗移栽

選取生長健壯、根系發(fā)達且大小一致的Ym039和Gold affair的二倍體及四倍體試管苗各75瓶（每瓶5株），從培養(yǎng)室搬到準備室放置1 d后，揭開瓶膜使其適應(yīng)與培養(yǎng)室不同的環(huán)境。移栽前準備工作：（1）小心將苗從瓶子取出，去除根部培養(yǎng)基；（2）用洗滌劑小心清洗殘留的培養(yǎng)基，清水清洗3遍；（3）用500～1 000倍液的多菌靈或百菌清浸根30 min；（4）清水清洗2～3遍；（5）配制基質(zhì)及種植。按上述方法分2批種植4種彩色馬蹄蓮試管苗，分別于揭膜后第1天和第3天種植，觀察其成活率。

1.2.3 低溫處理

（2±0.5）℃低溫處理：2013年冬天昆明遭遇雨雪低溫天氣約一周，種植于簡易大棚中（溫度為2～10℃），彩色馬蹄蓮受到嚴重影響。采收后發(fā)現(xiàn)二倍體的死亡率明顯高于四倍體。為了驗證多倍體的抗寒性是否優(yōu)于二倍體，以不同倍性的Ym039及Gold affair的植株為材料，每個品種挑選40株，轉(zhuǎn)入溫度為（2±0.5）℃的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光照時間14 h，10 d后統(tǒng)計死亡率。

6℃低溫處理：將不同倍性彩色馬蹄蓮植株連花盤一同移入光照培養(yǎng)箱中，在平均溫度（6±0.5）℃，光照時間14 h條件下進行低溫脅迫處理。7 d后，分別取對照與低溫處理的植株葉片，測定其生理生化指標并作對比分析。

1.2.4 生理指標及測定

脯氨酸（Pro）用茚三酮顯色法測定[8]；過氧化物酶（POD）用愈創(chuàng)木酚法測定；超氧化物歧化酶（SOD）用NBT顯色法測定；丙二醛（MDA）用硫代巴比妥酸法測定；可溶性蛋白用考馬斯亮藍G-250染色法測定[9]。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

用DPS6.55crack分析數(shù)據(jù)。文中顯著性分析均是在同一品種不同倍性間進行，不同品種間無相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同移栽時間對彩色馬蹄蓮移栽成活率的影響

不同移栽時間對彩色馬蹄蓮成活率的影響見表1。由表1可以看出，試管苗煉苗移栽分揭膜后1 d和3 d兩批進行，其煉苗成活率差異巨大。揭膜1 d后移栽成活率均高于90%，揭膜3 d后移栽的成活率在66%～76%，同一時間移栽的多倍體與二倍體植株間成活率無顯著差異，同一品種不同時間移栽成活率有極顯著差異。

2.2 低溫處理對成活率的影響

低溫對彩色馬蹄蓮的影響見表2。由表2可以看出，（2±0.5）℃低溫處理后，部分植株死亡，多倍體的死亡率在30%左右，二倍體死亡率超過50%。低溫脅迫處理后四倍體死亡率明顯低于二倍體，與二倍體相比，多倍體的抗寒能力有所增強。（6±0.5）℃低溫處理7 d后，并未發(fā)現(xiàn)完全死亡的植株，Gold affair四倍體體和二倍體均正常生長，未出現(xiàn)嚴重凍害的癥狀。Ym039（2X）部分葉片出現(xiàn)葉片水漬狀及失水變軟等受害癥狀，取出放置于室溫，幾天后部分受害葉片恢復(fù)正常生長，Ym039（4X）無明顯受害癥狀。

2.3 游離脯氨酸含量

在植物體內(nèi)，脯氨酸作為滲透物質(zhì)，起著滲透調(diào)節(jié)的作用[10]。植物在正常條件下，游離脯氨酸含量很低，但遇到干旱、低溫、鹽堿等逆境時，游離脯氨酸含量便會大量積累，并且積累量與植物抗逆性有關(guān)[8]。由表3可以看出，低溫脅迫處理后植株體內(nèi)脯氨酸含量有所增加。運用DPS進行顯著性分析可得，各品種經(jīng)過低溫脅迫處理的植株脯氨酸含量都顯著高于對照。經(jīng)過低溫脅迫處理的Ym039（2X）其游離脯氨酸含量顯著高于Ym039（4X），常溫下對照組無顯著性差異；低溫脅迫處理的Gold affair（2X）其游離脯氨酸含量極顯著高于Gold affair（4X），常溫對照組二倍體顯著高于四倍體。脯氨酸含量與植物品種抗寒性呈負相關(guān)。

2.4 超氧化物歧化酶（SOD）活性

超氧化物歧化酶（SOD）是需氧生物體內(nèi)普遍存在的一種含金屬的保護性酶。SOD活性和超氧陰離子自由基產(chǎn)生速率都可以表示植物抗寒過程中的生理狀況[11]，所以測定SOD活性的變化可以作為植物抗逆性分析的參考指標。由表4可以看出，經(jīng)過低溫脅迫處理的植株SOD活性都不同程度高于常溫對照。使用DPS進行顯著性分析后，Ym039四倍體SOD活性在低溫脅迫后顯著高于二倍體，常溫下對照組無顯著性差異。Gold affair在低溫處理后，多倍體極顯著高于二倍體，常溫對照組四倍體與二倍體之間都沒有顯著性差異。根據(jù)SOD活性分析，抗寒性強弱順序為：Ym039（4X）>Ym039（2X），Gold affair（4X）>Gold affair（2X）。

2.5 過氧化物酶（POD）活性

POD是膜保護系統(tǒng)的組成部分，它是植物內(nèi)的自由基的有效清除劑[14]。從表5可以看出，低溫脅迫處理后，所有植株的POD活性都有不同程度上升。Ym039四倍體POD活性增加幅度大于二倍體，Ym039（2X）比Ym039（4X）對低溫更敏感；Gold affair四倍體POD活性增加幅度大于二倍體，Gold affair （2X）比Gold affair （4X）對低溫更敏感。運用DPS軟件分析得到經(jīng)過低溫脅迫處理的Ym039（4X）的POD活性極顯著高于Ym039（2X），對照組無顯著性差異。經(jīng)過低溫脅迫處理的Gold affair（4X） SOD活性極顯著高于Gold affair（2X），對照組多倍體顯著高于二倍體。根據(jù)POD活性比較，抗寒性強弱順序為：Gold affair（4X）>Gold affair（2X），Ymo39（4X）>Ym039（2X）。

2.6 丙二醛（MDA）含量

當植株受到低溫、高溫、干旱等逆境后，細胞膜透性會發(fā)生變化，細胞內(nèi)相應(yīng)的酶系統(tǒng)和代謝過程遭到破壞，引發(fā)和加劇了膜脂過氧化作用，膜脂過氧化產(chǎn)物 MDA 增多，并且擴散到其他部位，影響了組織內(nèi)生理活動的正常進行[12-13]。MDA含量增加越多說明膜脂過氧化程度越嚴重。由表6可以看出，低溫脅迫后，二倍體MDA上升均明顯。通過DPS顯著性分析可知，Gold affair低溫脅迫處理二倍體MDA含量顯著高于多倍體，常溫對照組無顯著性差異。Ym039低溫脅迫處理二倍體MDA含量顯著高于多倍體，常溫對照組無顯著性差異。

2.7 可溶性蛋白質(zhì)含量

在植物體內(nèi)，可溶性蛋白可以作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、能量物質(zhì)和信息傳遞物質(zhì)，在植物抵御逆境過程中起到較大的作用[15]。植物生長過程中遇到低溫脅迫時，植物會通過改變體內(nèi)可溶性蛋白含量來增加保水能力以防止組織結(jié)冰而造成傷害。從圖1可以看出，低溫脅迫后Ym039（4X）的可溶性蛋白含量比Ym039（2X）增加了6.4%，Gold affair（4X）可溶性蛋白含量比Gold affair（2X）增加了23%。2個品種的四倍體可溶性蛋白含量均大于二倍體。

3 結(jié)論與討論

3.1 影響彩色馬蹄蓮無菌苗移栽成活的關(guān)鍵因子

張馨月等報道，揭膜3 d后進行移栽，那時彩色馬蹄蓮的葉片由嫩綠色轉(zhuǎn)變?yōu)樯罹G色，成活率達到95%以上[16]。本試驗結(jié)果表明：揭膜1 d后移栽的成活率高于90%，揭膜3 d后移栽的成活率只有66%～76%。試管苗煉苗移栽的成活率受許多因素的影響，如苗本身質(zhì)量、光照、溫度、基質(zhì)、移栽時間等。試管苗揭膜后無菌的環(huán)境被破壞，培養(yǎng)基上可能滋生不同種類的菌類使幼苗被感染，實際感染情況因幼苗本身的健壯程度及環(huán)境因子的不同而不同，高溫尤其促進病菌的滋長。因此，用于煉苗的試管苗要生長健壯，根系發(fā)達，并在揭膜1 d后盡快移栽，尤其是高溫季節(jié)，以此來提高移栽成活率。

3.2 彩色馬蹄蓮多倍體抗低溫生理反應(yīng)特征

20世紀90年代起，很多學者以辣椒[17]、黃瓜[18]，茄子[19]為實驗材料，對POD酶、SOD酶等保護酶活性變化與抗寒性的關(guān)系進行研究，抗寒性強的品種相應(yīng)的酶活性也高。本研究結(jié)果表明，低溫脅迫處理后彩色馬蹄蓮體內(nèi)SOD及POD活性都增強，其中多倍體的增加顯著高于二倍體。說明在受到低溫脅迫的時候，彩色馬蹄蓮多倍體通過增加細胞氧化相關(guān)酶SOD、POD的活性抵御低溫傷害的能力提高。

國內(nèi)學者對杏[20-21]、紫椴[22]、珊瑚樹[23]等的研究結(jié)果表明，可溶性蛋白質(zhì)含量高的品種抗寒性亦強，在抗寒鍛煉過程中可溶性蛋白含量有增加的趨勢，其中抗寒性差的品種增加幅度較小，反之則大[24]。本研究結(jié)果表明，彩色馬蹄蓮多倍體可溶性蛋白含量高于二倍體，且在低溫脅迫時可溶性蛋白含量增加幅度比二倍體大。可溶性蛋白的含量高可提高細胞的保水能力，降低冰點從而提高植物的抗寒能力。因此，彩色馬蹄蓮四倍體對低溫脅迫的抵抗能力比二倍體強。低溫脅迫處理時，4種彩色馬蹄蓮體內(nèi)的MDA含量都有所增加，但多倍體增加幅度小于二倍體。膜脂過氧化產(chǎn)物MDA含量增加越多，說明膜脂過氧化程度越嚴重[13]，彩色馬蹄蓮多倍體MDA含量增加低于二倍體，彩色馬蹄蓮多倍體抗寒性強于二倍體。

3.3 彩色馬蹄蓮多倍體抗低溫脯氨酸調(diào)節(jié)

近年來，不少學者在抗寒育種中運用脯氨酸含量變化作為判斷其抗寒性強弱的指標之一，但是觀點尚未統(tǒng)一。包括以下幾種觀點：①在低溫脅迫下脯氨酸的積累能力與品種抗寒性成正相關(guān)性[25-26]。②在低溫脅迫下脯氨酸的積累能力與品種的抗凍寒力成負相關(guān)[27-28]。③低溫脅迫下脯氨酸的積累不穩(wěn)定[29]。試驗結(jié)果表明，彩色馬蹄蓮多倍體在低溫脅迫時游離脯氨酸增加顯著低于二倍體，屬于第二種類型，脯氨酸的積累能力與品種的抗凍寒力成負相關(guān)。持這一觀點的研究者認為，抗寒性弱的品種在受到低溫脅迫后，為適應(yīng)寒冷、保護體內(nèi)組織免受凍害過早地積累了大量的游離脯氨酸，而游離脯氨酸積累高峰出現(xiàn)晚的品種，抗寒性強；或者認為，游離脯氨酸積累是植物的被動反應(yīng)，作為植物低溫下的傷害程度指標。

生理指標測定與分析結(jié)果表明：低溫脅迫下不同品種多倍體的可溶性蛋白含量、POD活性、SOD活性均高于二倍體，MDA含量、游離脯氨酸含量低于二倍體，彩色馬蹄蓮多倍體抗寒性比二倍體增強。研究結(jié)果僅限于2個品種的數(shù)據(jù)，對于其他彩色馬蹄蓮品種多倍體的抗寒性是否都優(yōu)于二倍體，還有待進一步試驗探索。除抗寒性外，需要對馬蹄蓮多倍體抗旱性、抗病性、耐鹽脅迫性等逆境的能力進行試驗，以便更好地為馬蹄蓮多倍體優(yōu)良品種的培育提供支持。

參考文獻

[1] 余樹勛，吳應(yīng)祥. 花卉寶典[M]. 北京：農(nóng)業(yè)出版社，1993：312

[2] 楊 輝，緱 輝，周 滌，等.彩色馬蹄蓮不同品種多倍體誘導研究初探[J]. 云南農(nóng)業(yè)大學學報，2014，29（2）：229-234.

[3] Bre T F，Thompson J D. Gametes with the somatic chromosome number： mechanisms of their formation and role in the evolution of autopoly ploid plants[J]. New Phytologist， 1995， （129）： 1-22.

[4] 趙志昆，趙曉光，宋儀農(nóng). 盆栽馬蹄蓮栽培管理技術(shù)[J]. 江西園藝，2003，（2）：33-34

[5] 闕生全，胡 丹，張 燕. 低溫脅迫對彩色馬蹄蓮生理生化特性的影響[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學，2009，37（2）：486-487.

[6] 劉曉靜，華小平，陸 波，等.彩色馬蹄蓮品種‘Parfait多倍體誘導及其生物學特征變化[J]. 植物資源與環(huán)境學報，2014，23（3）：81-85，101

[7] 張錫慶，吳紅芝，周 滌，等. 新型除草劑 Oryzalin的濃度和處理時間對誘導彩色馬蹄蓮多倍體的影響[J]. 云南農(nóng)業(yè)大學學報，2008，23（6）：806-810

[8] 蒼 晶，趙會杰. 植物生理學實驗教程[M]. 北京：高等教育出版社，2013.

[9] 史樹德，孫亞卿，魏 磊，等. 植物生理學實驗指導[M]. 北京：中國林業(yè)出版社，2011.

[10] 李 志，王 剛，吳忠義，等.脯氨酸與植物抗?jié)B透脅迫基因工程改良研究進展[J]. 河北師范大學學報（自然科學版），2005，29（4）：405-408

[11] 高俊鳳. 植物生理實驗技術(shù)[M]. 西安：世界圖書出版公司，2000.

[12] Wang C Y， Adams D O. Chilling-induced ethylene production in cucumbers （Cucumis sativus L.）[J].Plant Physiol， 1982， 69（2）： 424-427.

[13] 石雪暉，劉昆玉，楊國順，等. 低溫脅迫對柑桔離體葉片膜脂透性和MDA及Vc量的影響[J]. 湖南農(nóng)業(yè)大學學報，1997，23（1）：36-40.

[14] 陳少裕. 膜脂過氧化對植物細胞的傷害[J]. 植物生理學通訊，1991，27（2）：84-90.

[15] 張繼澍. 植物生理學[M]. 西安：世界圖書出版公司，1999：370-376.

[16] 張馨月，冉婷婷，劉小菊. 彩色馬蹄蓮組培快繁工廠化育苗途徑研究[J]. 吉林蔬菜，2010（2）：98-100.

[17] 鄒志榮，陸幗一. 低溫對辣椒幼苗膜脂過氧化和保護酶系統(tǒng)變化的影響[J]. 西北農(nóng)業(yè)大學學報，1994，3（3）：51-56.

[18] 馬德華，孫其信. 溫度逆境對不同品種黃瓜幼苗膜保護酶系統(tǒng)的影響[J]. 西北植物學報，2001，21（4）：656-661.

[19] 李建設(shè)，耿廣東，程智慧.低溫脅迫對茄子幼苗抗寒性生理生化指標的影響[J]. 西北農(nóng)林科技大學學報（自然科學版），2003，31（3）：90-92，96.

[20] 張成軍，李 捷，范惠萍，等.不同杏品種幼果抗寒性研究[J].西北林學院學報，2008，23（3）：29-32.

[21] 黃永紅，沈洪波，陳學森.杏樹抗寒生理研究初報[J]. 山東農(nóng)業(yè)大學學報：自然科學版，2005，36（2）：191-195.

[22] 唐鳳德，蔡天革. 化控物質(zhì)對紫椴苗木抗寒生理特性的影響[J]. 遼寧大學學報：自然科學版，2004，31（4）：355-357.

[23] 楊志剛. 春季珊瑚樹芽抗寒物質(zhì)及抗氧化酶系的變化[J]. 常熟高專學報，2002，16（2）：47-49.

[24] 姚立新，朱 銳，馬雯彥，等. 植物抗旱、抗寒性鑒定與生理生化機理研究進展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學，2009，37（25）：11 864-11 866.

[25] 王小華，莊南生.脯氨酸與植物抗寒性的研究進展[J]. 中國農(nóng)學通報，2008，24（11）：398-402.

[26] 陳杰中，徐春香，梁立峰. 低溫對香蕉葉片中蛋自質(zhì)及脯氨酸的影響[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學學報，1999，20（3）：54-58.

[27] 劉國華，陳立云，李國泰. 雜交晚稻新組合及其恢復(fù)系耐冷性生理生化指標分析[J]. 雜交水稻，1993（4）：32-35.401.

[28] 魏 娜，歐小平，董 麗. 10 種宿根花卉抗寒性研究初報[J]. 中國農(nóng)學通報，2008，7（24）：314-317.

[29] 李 莉，任金平，曲柏宏，等. 水分脅迫對蘋果梨葉片可溶性糖、脯氨酸含量的影響[J]. 吉林農(nóng)業(yè)科學，2007，32（1）：51-54.