董春忠， 孫 霞， 鄭媛媛， 朱元祺

·論著·

多重耐藥鮑曼不動桿菌中16S rRNA甲基化酶基因的檢測及耐藥分析

董春忠1， 孫 霞2， 鄭媛媛1， 朱元祺3

目的 了解醫(yī)院分離的多重耐藥鮑曼不動桿菌16S rRNA甲基化酶基因分布情況，為臨床合理應(yīng)用抗菌藥物提供依據(jù)。方法 采用Phoenix100微生物全自動鑒定系統(tǒng)進行菌株鑒定及藥敏試驗；采用PCR方法檢測armA、rmtA、rmtB、rmtC、rmtD基因。結(jié)果 46株鮑曼不動桿菌中armA基因陽性36株，陽性率78.3 %，未檢出rmtA、rmtB、rmtC、rmtD基因。藥敏試驗結(jié)果顯示醫(yī)院分離的多重耐藥鮑曼不動桿菌對多黏菌素全部敏感，對四環(huán)素、阿米卡星、慶大霉素、妥布霉素、甲氧芐啶-磺胺甲唑耐藥率分別為13.0 %、80.4 %、91.3 %、95.7 %、95.7 %，對其他測試藥物耐藥率100 %。結(jié)論 醫(yī)院分離鮑曼不動桿菌對氨基糖苷類抗菌藥物耐藥性已非常嚴(yán)重，攜帶armA基因是導(dǎo)致氨基糖苷類耐藥的原因之一，延緩鮑曼不動桿菌多重耐藥性已刻不容緩。

多重耐藥鮑曼不動桿菌； 16S rRNA甲基化酶； armA基因

多重耐藥鮑曼不動桿菌（multidrug resistant A.baumannii，MDRAB）是指對頭孢菌素、碳青霉烯類、β內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)合制劑、氟喹諾酮類、氨基糖苷類抗菌藥物中至少3類抗菌藥物耐藥的菌株［1］。根據(jù)2013年CHINET細菌耐藥性監(jiān)測數(shù)據(jù)，鮑曼不動桿菌臨床分離株數(shù)居第3位，檢出率占11.97 %。對氨基糖苷類阿米卡星、慶大霉素耐藥率分別為46 %、63.3 %［2］。armA甲基化酶基因幾乎可導(dǎo)致細菌對所有氨基糖苷類耐藥，了解醫(yī)院分離的MDRAB中16S rRNA甲基化酶armA、rmtA、rmtB、rmtC、rmtD基因分布情況，為臨床合理應(yīng)用抗菌藥物提供依據(jù)。現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 收集醫(yī)院2013年8－11月分離的非重復(fù)碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌46株。分離自住院患者送檢的痰液34株、創(chuàng)面分泌物4株、膿液6株和胸水2株。其中科室分布為內(nèi)科ICU 25株、神經(jīng)外科10株、呼吸科8株、燒傷科2株和干部保健科1株。

1.1.2 儀器與試劑 采用PhoenixSpec比濁儀制備特定濃度菌懸液；采用Phoenix100微生物全自動鑒定系統(tǒng)進行菌株鑒定；革蘭陰性菌鑒定藥敏復(fù)合板、鑒定培養(yǎng)液、藥敏培養(yǎng)液、藥敏指示劑均由美國BD公司生產(chǎn)；妥布霉素E試驗條由法國梅里埃公司生產(chǎn)；PCR反應(yīng)試劑由TaKaRa大連公司生產(chǎn)；PCR純化試劑由美國Axygen公司生產(chǎn)；ABI-Veriti梯度PCR儀、3700x1DNA基因測序儀為美國ABI公司生產(chǎn)；PCR擴增委托上海生工生物工程公司完成。

1.2 方法

1.2.1 藥敏試驗 挑取培養(yǎng)18～24 h純菌落4～5個，使用鑒定培養(yǎng)液制備成0.5麥?zhǔn)蠁挝粷舛鹊木鷳乙夯靹?，吸?5 μL加入藥敏培養(yǎng)液中，加入藥敏指示劑1滴（約50 μL）混勻，以重力加樣方式將菌液加到板條中，在電腦中輸入板條信息，將板條置入主機中，儀器自動檢測并報告結(jié)果；藥物敏感試驗解釋標(biāo)準(zhǔn)按CLSI 2012，M100-S22執(zhí)行，藥敏數(shù)據(jù)采用WHONET5.6軟件統(tǒng)計分析。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922、銅綠假單胞菌ATCC 27853（購自衛(wèi)生部臨檢中心）。

1.2.2 耐藥基因檢測 采用PCR方法檢測armA、rmtA、rmtB、rmtC、rmtD基因。PCR擴增條件為：95℃預(yù)變性7 min，95℃變性30 s，50℃退火1 min，65℃延伸8 min，30個循環(huán)，65℃延伸16 min。引物設(shè)計參照文獻［3-4］。 耐藥基因引物序列見表1。

表1 耐藥基因引物序列Table1 Primer sequences used in PCR

2 結(jié)果

2.1 鮑曼不動桿菌對16種抗菌藥物的耐藥率

46株鮑曼不動桿菌對多黏菌素全部敏感，對四環(huán)素、阿米卡星、慶大霉素、妥布霉素、甲氧芐啶-磺胺甲唑耐藥率分別為13.0 %、80.4 %、91.3 %、95.7 %、95.7 %，對其他測試藥物耐藥率100 %。見表2。

表2 46株鮑曼不動桿菌對抗菌藥物的耐藥率和敏感率Table2 Susceptibility of 46 Acinetobacter baumannii isolates to antimicrobial agents

2.2 PCR檢測結(jié)果

46株鮑曼不動桿菌中armA基因陽性36株，陽性率78.3 %， armA基因PCR結(jié)果見圖1。未檢出rmtA、rmtB、rmtC、rmtD基因。36株armA基因型鮑曼不動桿菌的標(biāo)本分布是痰液28株、膿液6株、創(chuàng)面分泌物2株?？剖曳植紴镮CU 23株、神經(jīng)外科6株、呼吸科3株、燒傷科1株、心胸外科1株、肝膽外科1株、腎內(nèi)科1株。

圖1 鮑曼不動桿菌armA基因PCR結(jié)果Figure 1 PCR amplification of armA gene for Acinetobacter baumannii

3 討論

鮑曼不動桿菌為革蘭陰性球桿菌，單個或成對排列，有時呈絲狀或鏈狀。氧化酶陰性、動力陰性、硝酸鹽陰性，生化反應(yīng)典型“三陰”區(qū)別于其他不發(fā)酵糖革蘭陰性桿菌。鮑曼不動桿菌具有長期在體外生存的能力，隨著抗菌藥物廣泛使用、侵襲性操作的增多、接受機械通氣、長期入住ICU、免疫抑制劑的使用等均可導(dǎo)致鮑曼不動桿菌的感染。鮑曼不動桿菌具有獲得性耐藥和克隆播散的能力，多重耐藥、廣泛耐藥、全耐藥鮑曼不動桿菌呈世界性流行［5］，由多重耐藥到廣泛耐藥再到全耐藥僅用了10年時間［6］。

16S rRNA甲基化酶作為介導(dǎo)高水平氨基糖苷類抗菌藥物耐藥的一類酶［7］， 引起常用氨基糖苷類高水平耐藥［8］。文獻證實armA基因分離于鮑曼不動桿菌中，rmtB 基因分離于腸桿菌科細菌中［9］。梁彩倩等［10］在肺炎克雷伯菌中armA、rmtB基因檢出率為11.1 %、6.2 %。在鮑曼不動桿菌中僅檢測到armA基因，該類耐藥決定因子常與其他耐藥基因共同存在于質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子等移動元件上，在不同菌株間廣泛播散，導(dǎo)致細菌出現(xiàn)多重耐藥［11］。本研究發(fā)現(xiàn)醫(yī)院分離的MDRAB armA陽性率78.3 %。高于奚俊等［12］55.5 %、王英田等［13］60 %的報道；與李玉珍等［4］74.1 %的報道接近；與馮旰珠等［14］報道未檢出16S rRNA甲基化酶armA基因不一致?？赡芘c菌株研究時間、地域有關(guān)。我們未檢出rmtA、rmtB、rmtC、rmtD基因與諸多文獻一致［4，12-13］。藥敏試驗結(jié)果顯示醫(yī)院分離的MDRAB對阿米卡星、慶大霉素、妥布霉素耐藥率分別為80.4 %、91.3 %、95.7 %?？梢娽t(yī)院鮑曼不動桿菌對氨基糖苷類抗生素耐藥性已非常嚴(yán)重，攜帶armA基因是導(dǎo)致氨基糖苷類耐藥的原因之一。采取相應(yīng)措施延緩鮑曼不動桿菌多重耐藥性已刻不容緩。

為此醫(yī)院制訂了鮑曼不動桿菌治療方案、合理處方方案、監(jiān)測抗菌藥物使用率等，同時聯(lián)合感染科、院感管理部門、微生物室、臨床藥學(xué)部門對細菌耐藥性增加的趨勢進行干預(yù)。希望能延緩鮑曼不動桿菌多重耐藥性的迅速發(fā)展。

［1］陳佰義，何禮賢，胡必杰，等.中國鮑曼不動桿菌感染診治與防控專家共識［J］.中國醫(yī)藥科學(xué)雜志， 2012，2（8）：3-9.

［2］胡付品，朱德妹，汪復(fù)，等. 2013年中國CHINET細菌耐藥性監(jiān)測［J］.中國感染與化療雜志，2014，14（5）：369-378.

［3］蒯守剛，黃利華，裴豪，等.鮑曼不動桿菌對氨基糖苷類藥物耐藥機制研究［J］.檢驗醫(yī)學(xué)，2012，27（8）： 619-622.

［4］李玉珍，李紅玉，楊銀梅，等. 阿米卡星耐藥鮑曼不動桿菌16SrRNA甲基化酶基因的研究［J］. 中國感染與化療雜志，2013，13（1）：72-75.

［5］PELEG AY， SEIFERT H， PATERSON DL.Acinetobacter baumannii：emergence of a successful pathogen［J］. Clin Microbiol Rev，2008，21（3）：538-582.

［6］章清，魏麗，王金鐸.耐藥鮑氏不動桿菌的耐藥相關(guān)基因檢測與聚類分析［J］.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2014，24（1）：1-4.

［7］潘韻峰，俞云松，周華，等.亞胺培南耐藥鮑曼不動桿菌16SrRNA甲基化酶基因檢測及流行菌株分析［J］.中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2008，28（1）：34-39.

［8］WACHINO J， SHIBAYAMA K， KUROKAWA H， et al. Novel plasmid-media-ted 16S rRNA m1A1408 methyltransferase，NpmA，found in a clinically isolated Escherichia coli strain resistant to structurally diverseam aminoglycoside［J］. Antimicrob Agents Chemother， 2007， 51（12）：4401-4409.

［9］ZHOU Y， YU H， GUO Q， et al. Distribution of 16S rRNA methylases among different species of Gram-negative bacilli with high-level resistance to aminoglycosides［J］. Eur J Clin Microbiol Infect Dis， 2010， 29（11）：1349-1353.

［10］梁彩倩，張永標(biāo)，楊曉燕，等. 肺炎克雷伯氏菌16S rRNA甲基化酶基因型及耐藥表型的研究［J］. 中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2013，23（19）：4601-4604.

［11］張利娟，郝邯生.鮑曼不動桿菌16S rRNA甲基化酶的研究進展［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2011，17（5）：676-678.

［12］奚俊，應(yīng)春妹. 耐氨基糖苷類抗生素鮑曼不動桿菌中armA和rmtB甲基化酶基因的檢測［J］.中國感染與化療雜志，2010，10（3）：209-212.

［13］王英田，傅愛玲，于翠香，等. 多藥耐藥鮑氏不動桿菌氨基糖苷類耐藥相關(guān)基因研究［J］.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2011，21（24）：5111-5113.

［14］馮旰珠，張揚，姚堃， 等. 多重耐藥鮑曼不動桿菌16S r RNA甲基化酶、氨基糖苷類修飾酶基因研究［J］.中國感染與化療雜志，2008，8（4）：303-306.

Detection of 16S rRNA methylase gene in multiple drug resistant Acinetobacter baumannii and associated antibiotic resistance

DONG Chunzhong， SUN Xia， ZHENG Yuanyuan， ZHU Yuanqi.
（Department of Laboratory Medicine， People's Hospital of Binzhou City， Binzhou Shandong 256610， China）

Objective To investigate the prevalence of 16S rRNA methylase gene in the strains of multidrug-resistant Acinetobacter baumannii isolated from patients to provide basis for rational use of antimicrobial agents. Methods Phoenix100 automated microbial identifcation system was used for strain identifcation and antimicrobial susceptibility testing. PCR was used for detection of armA， rmtA， rmtB， rmtC， and rmtD genes. Results The armA gene was positive in 36 （78.3 %） of the 46 strains. All the strains were negative for rmtB， rmtA， rmtC， and rmtD genes. Susceptibility testing showed that the multi-drug resistant A. baumannii strains were susceptible to polymyxin， but various resistance rates to tetracycline （13.0 %）， amikacin （80.4 %）， gentamicin （91.3 %），tobramycin （95.7 %）， and trimethoprim-sulfamethoxazole （95.7 %）， and 100 % resistant to the other antimicrobial agents tested. Conclusions The antibiotic resistance is very serious in Acinetobacter baumannii， especially those carrying armA gene， which confers aminoglycoside resistance. We have no time to waste in containing the multidrug-resistance of Acinetobacter baumannii.

multidrug-resistant Acinetobacter baumannii； 16S rRNA methylase； armA gene

R378

A

1009-7708 （ 2016） 05-0618-04

10.16718/j.1009-7708.2016.05.016

2015-09-30

2015-12-04

山東省科技發(fā)展計劃項目（2009GG10002057）；青島經(jīng)濟技術(shù)開發(fā)區(qū)重點科技發(fā)展項目（2013-1-82）。

1. 山東省濱州市人民醫(yī)院檢驗科，山東濱州 256610；2. 濱州市婦幼保健院新生兒疾病篩查中心；3.青島大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗科。

董春忠（1975—），男，學(xué)士，主管技師，主要從事臨床微生物檢驗工作。

朱元祺，E-mail： zyudot@aliyun.com。