鄭慈真　何文杰　尹　茜　齊躍強(qiáng)

（廣州市名卉景觀科技發(fā)展有限公司，廣東　廣州　510420）

櫻花組培快繁體系的建立及組培苗移栽技術(shù)研究

鄭慈真何文杰尹茜齊躍強(qiáng)

（廣州市名卉景觀科技發(fā)展有限公司，廣東廣州510420）

以4個(gè)櫻花品種為研究對(duì)象，主要采用腋芽（側(cè)芽）誘導(dǎo)方法，建立了腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)系，并建立了試管苗初代培養(yǎng)，優(yōu)化了繼代培養(yǎng)和生根培養(yǎng)基，并提出了腋芽誘導(dǎo)規(guī)?；a(chǎn)櫻花試管苗的可行性程序和試管苗移栽的可行性程序。

櫻花；脫毒；組培培養(yǎng)；試管苗生根；組培苗移栽

櫻花（Prunusserrulata）是世界著名的觀賞花木，隸屬于薔薇科（Rosaceae）櫻屬（Cerasus），分布于北半球溫暖地區(qū)，為北溫帶植物，亞洲、歐洲至北美洲均有記錄。該屬包括百余種成員，主要種類分布在我國(guó)西部和西南部以及日本和朝鮮［1］。

櫻花為早春觀賞花木，其株型優(yōu)美，花色艷麗，花期延續(xù)期長(zhǎng)，在園林上具有極大的應(yīng)用價(jià)值，可廣泛應(yīng)用于公園、學(xué)校、街道、庭院等綠地中。由于櫻花具有極高的觀賞價(jià)值，引種培育工作逐步被人們重視，尤以日本遙遙領(lǐng)先［2］。截至目前，培育品種在花型、花色、株形等各方面觀賞價(jià)值都有了極大的提高，品種數(shù)量也日益增多。

櫻屬植物在我國(guó)栽培歷史悠久，早在2000多年前的秦漢時(shí)期，櫻花就已在宮庭中作為祭祀大典中的貢品栽培，但一直以來對(duì)于櫻花品種的研究相對(duì)較少。國(guó)內(nèi)櫻花栽植雖多，但大都引自日本，不如鄉(xiāng)土樹種適應(yīng)性好，對(duì)于櫻花景觀配置和園林應(yīng)用價(jià)值缺乏系統(tǒng)研究，嚴(yán)重制約了櫻花在園林應(yīng)用中的發(fā)展。而我國(guó)擁有十分豐富的野生櫻花資源，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過日本及相鄰國(guó)家，分布范圍也非常寬廣，從東北到西南都有分布，其中有許多觀賞價(jià)值極高的種類，其世界聲譽(yù)卻遠(yuǎn)遜于日本，如能對(duì)國(guó)產(chǎn)櫻花進(jìn)行進(jìn)一步的研究開發(fā)利用，培育出新品種，必可擺脫依靠進(jìn)口新品種的局面［3，4］。

1　國(guó)內(nèi)外櫻花的研究概況

1.1國(guó)內(nèi)外櫻花組織培養(yǎng)研究進(jìn)展

1992年，沈惠娟先生在《木本植物組織培養(yǎng)技術(shù)》［5］中對(duì)部分食用櫻桃類的組織培養(yǎng)研究作了小結(jié)，并列出了部分研究者摸索出的分化和生根培養(yǎng)基配方及外植體再生方式。1998年，及華［6］對(duì)山櫻花進(jìn)行了離體快速繁殖試驗(yàn)，用不同配方的培養(yǎng)基對(duì)不同階段進(jìn)行了處理，得到了較好的生根組合。

陸貴巧、林青、榮冬青、閆道良等做了一系列提高櫻花嫩枝扦插生根成活率的試驗(yàn)，在提高扦插生根量方面做了一些探討，在此基礎(chǔ)上閆道良提出了開發(fā)利用國(guó)內(nèi)野生櫻資源的建議。張艷芳［7］和朱繼軍分別研究了櫻花的切接繁殖技術(shù)和高位嫁接繁育方法。

觀賞櫻花從1991年開始，中國(guó)科學(xué)院武漢植物研究所做了櫻花組織培養(yǎng)方面的研究并獲得了正常的組培苗；周志堅(jiān)、張忠民等［8］研究了大島櫻的組織培養(yǎng)與快速繁殖技術(shù)，在短時(shí)間提供大量適合于生根的壯苗。郭萬里［9］采用器官培養(yǎng)技術(shù)探索規(guī)?；a(chǎn)櫻花試管苗的途徑，還分析了規(guī)?；a(chǎn)林木試管苗過程中出現(xiàn)的玻璃化和試管苗弱化（GA引起的徒長(zhǎng)）現(xiàn)象以及生產(chǎn)中的對(duì)策。福建農(nóng)林大學(xué)付影［10］對(duì)鐘花櫻離體繁殖技術(shù)體系進(jìn)行了探索，分別對(duì)外植體的表面滅菌、啟動(dòng)培養(yǎng)、繼代增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)及煉苗移栽等方面進(jìn)行了研究，著重探討了組織培養(yǎng)過程中最佳培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)程序。

2007年，笠原俊策、韓東生、新美芳二［11］根據(jù)Murashige在1974年提出的方法，研究建立一個(gè)利用莖尖培養(yǎng)生產(chǎn)日本晚櫻小苗木的系統(tǒng)。在其系統(tǒng)研究中發(fā)現(xiàn)，9月為在WPM培養(yǎng)基上外植體最佳切除時(shí)間，6月是移栽至盆中的最佳時(shí)間，植物將于莖尖培養(yǎng)后4a開花。

1.2櫻花栽培方面的研究

方義昌、王敏、陳先友等研究了葉用、花用櫻花的栽培技術(shù)，包括產(chǎn)地環(huán)境與規(guī)劃、櫻樹園生態(tài)建設(shè)、土壤管理和施肥、病蟲草害防治、櫻樹修剪與適時(shí)采摘等內(nèi)容，為櫻樹栽培提供了參考。王慧娟、孟月娥等［12］對(duì)櫻花的組培苗從基質(zhì)、肥料濃度及激素3個(gè)方面進(jìn)行了移栽技術(shù)方面的研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，草炭是櫻花組培苗移栽的最佳基質(zhì)；連續(xù)噴灑5次，每次間隔7d的0.2%的尿素溶液可有效促進(jìn)組培苗的生長(zhǎng)；在植株長(zhǎng)出新葉后用赤霉素100mg/L的水溶液噴灑，可以促進(jìn)植株快速生長(zhǎng)，縮短緩苗期。

1.3研究意義

櫻花是深受我國(guó)人民喜愛的早春觀賞花木之一。隨著城市園林建設(shè)的飛速發(fā)展和人們對(duì)居住環(huán)境要求的日益提高，櫻花在美化環(huán)境和滿足人們?cè)绱河^賞需求等方面的作用越來越重要。櫻花品種豐富、樹型多樣、葉色變幻、花期整齊，開花盛期持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，是一種不可多得的園林綠化樹種，具有重要的園林應(yīng)用價(jià)值。

據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)現(xiàn)有櫻花品種53個(gè)，花色艷麗，白的、粉的、紫的、黃的色彩繽紛，十分引人注目?；ò暧袉伟辍胫匕?、重瓣、菊瓣等多種形態(tài)，并且整個(gè)花期延續(xù)期長(zhǎng)，葉片的形狀多種多樣，有卵形、披針形等，櫻花大多數(shù)的樹形都非常漂亮，樹枝開展，用作庭園或風(fēng)景區(qū)栽植，無論單株栽植、行植及叢植，或植為片林，觀賞效果美不勝收。但是，目前應(yīng)用中多數(shù)景點(diǎn)僅僅只有普通的幾個(gè)櫻花品種，園林應(yīng)用處于較低水平。

櫻花的原產(chǎn)地主要是我國(guó)和日本，我國(guó)的野生櫻花資源十分豐富，若對(duì)這些野生資源加以充分的利用，不僅可以對(duì)城市的園林綠化起到推動(dòng)作用，也會(huì)帶來相應(yīng)的不可忽略的經(jīng)濟(jì)利益。今后應(yīng)在加強(qiáng)對(duì)野生資源保護(hù)的同時(shí)，加大繁殖生物學(xué)研究，尤其是引種、選育工作，加強(qiáng)對(duì)野生資源的利用。針對(duì)如何以市場(chǎng)為導(dǎo)向，在開發(fā)野生資源的基礎(chǔ)上培育出色艷、抗性強(qiáng)的新品種，使得櫻花的物種資源優(yōu)勢(shì)轉(zhuǎn)變?yōu)樯唐穬?yōu)勢(shì)和經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢(shì)。

2　名卉公司櫻花研究情況

2.1研究的方法與意義

基于目前的研究現(xiàn)狀，名卉公司運(yùn)用組織培養(yǎng)的繁育手段，在短時(shí)期快速繁殖獲得大量的不同品種的櫻花種苗，滿足櫻花在園林應(yīng)用中的需求。該研究主要采用植物組織培養(yǎng)技術(shù)中的器官培養(yǎng)，探索規(guī)模化生產(chǎn)櫻花試管苗的途徑。

在探索規(guī)模化生產(chǎn)4個(gè)櫻花品種試管苗的過程中，主要采用了腋芽（側(cè)芽）誘導(dǎo)方法建立了腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)系。建立了試管苗初代培養(yǎng)，優(yōu)化了繼代培養(yǎng)和生根培養(yǎng)基，并提出了腋芽誘導(dǎo)規(guī)?；a(chǎn)櫻花試管苗的可行性程序：4個(gè)櫻花品種的生長(zhǎng)狀態(tài)在繼代培養(yǎng)基中差異不明顯，因此可采用一套培養(yǎng)基。但在生根時(shí)，它們體現(xiàn)出白身的遺傳差異性。經(jīng)過試驗(yàn)，確定了這幾種櫻花品種的生根培養(yǎng)基最佳激素配比范圍，為規(guī)?；a(chǎn)多品種櫻花試管苗提供了生根培養(yǎng)基的激素配比原則。

2.2櫻花組培快繁研究?jī)?nèi)容

2.2.1櫻花組培快繁體系建立情況。用4個(gè)櫻花品種作為名卉公司研究櫻花組培快繁體系的外植體，分別為櫻花1號(hào)、櫻花2號(hào)、櫻花3號(hào)和櫻花4號(hào)，以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基進(jìn)行研發(fā)。

2.2.2組培快繁體系的研究方法。2月中旬—4月中旬，采集新發(fā)的半木質(zhì)化的櫻花枝條和較老（木質(zhì)化程度較高）的櫻花枝條，去除葉片（留部分葉柄3～5mm和枝條頂端幼嫩部分）。櫻花枝條截段長(zhǎng)度為1.5～3.0cm，至少含有1個(gè)腋芽。用濃洗潔精水溶液振蕩洗滌5min，然后用自來水沖凈洗潔精殘液。預(yù)處理后的材料在超凈工作臺(tái)中，在75%的酒精中浸泡10～15s，0.1%HgCl溶液中浸泡5～10min，無菌水沖洗3～5遍（3～5min/次），最后將無菌的外植體接種到初代培養(yǎng)基中，接種時(shí)露出腋芽。把滅菌的櫻花外植體接種到表l所示的培養(yǎng)基中，卡拉膠0.5%，白糖3%，pH值5.8，25d繼代一次。第15～20天，隨機(jī)抽出10～15瓶進(jìn)行觀察。以外植體腋芽的發(fā)生快慢、試管苗生長(zhǎng)狀態(tài)以及莖底部愈傷大小和狀態(tài)來選擇較佳培養(yǎng)基搭配。

繼代培養(yǎng)是把初代培養(yǎng)基C5和C6中新發(fā)的外植體接種到表2所示配方中，35d繼代一次。第25～30天，隨機(jī)抽出10～15瓶進(jìn)行觀察。以苗的生長(zhǎng)狀態(tài)以及莖底部愈傷的大小和狀態(tài)來選擇較佳培養(yǎng)基搭配。

表1　櫻花初代培養(yǎng)基配方

表2　櫻花繼代培養(yǎng)基配方

櫻花試管苗生根的優(yōu)化是把苗接種到生根培養(yǎng)基中（見表3），卡拉膠0.6%，蔗糖2%，pH值5.8，生根苗高度大于1.5cm，截段長(zhǎng)度為1.5～2.0cm。培養(yǎng)第15天統(tǒng)計(jì)生根率（隨機(jī)抽出10～15瓶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和觀察），并觀察苗狀態(tài)。

3　研究結(jié)果與討論

3.1櫻花組織培養(yǎng)探討

3.1.1櫻花外植體的采集時(shí)間。櫻花外植體的采集時(shí)間以春天3—4月最佳，這期間花已經(jīng)開過，新發(fā)枝條長(zhǎng)度為5～15cm，半木質(zhì)化，最易誘導(dǎo)掖芽的發(fā)生。但過于幼嫩的枝條在葉腋處產(chǎn)生愈傷，會(huì)影響腋芽發(fā)生；而完全木質(zhì)化的一年生枝條過于老化，腋芽發(fā)生較慢，并且分泌化學(xué)物質(zhì)，進(jìn)一步影響腋芽的發(fā)生，還引起部分腋芽的黃化死亡。

3.1.2基本培養(yǎng)基的選擇。MS、3/4MS和1/2MS基本培養(yǎng)基中，MS不僅延遲了櫻花腋芽的發(fā)生時(shí)間，約12d腋芽才開始萌動(dòng)，還抑制了櫻花的生長(zhǎng)，莖伸長(zhǎng)較慢，葉片較小，處于半卷曲狀態(tài)，且葉色黃綠。3/4MS中的櫻花萌動(dòng)較早，4～6d腋芽就開始膨大萌動(dòng)。10d就發(fā)出一兩片新葉，新葉葉片較大，色澤鮮綠，伸展。1/2MS中的外植體腋芽的萌動(dòng)時(shí)間與3/4MS相似，但葉片淡黃綠色，培養(yǎng)時(shí)間稍長(zhǎng)（約20d），部分葉片脫落，可能是缺乏某種無機(jī)元素或無機(jī)元素不足造成的。同時(shí)，莖底部愈傷過大，呈白色疏松狀，可能是植物激素用量或配比不當(dāng)造成的，也可能是有機(jī)成分含量過高。因此，櫻花外植體初代培養(yǎng)的建立需要無機(jī)離子濃度稍高的基本培養(yǎng)基，但又不能過高，如MS，并且需要多種微量元素。根據(jù)結(jié)果分析可知，采用3/4MS作為櫻花外植體初代培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基是比較合適的。

表3　櫻花生根培養(yǎng)基配方

3.1.3櫻花外植體初代培養(yǎng)基的選擇。無論在MS還是在3/4MS培養(yǎng)基中，當(dāng)NAA濃度不變時(shí)，外植體底部愈傷隨6-BA濃度的降低而減小，顏色由淺黃疏松到黃綠堅(jiān)實(shí)。而且新發(fā)的幼枝長(zhǎng)勢(shì)差異隨6-BA濃度（0.5～1.5mg/L）的變化并不顯著。這說明6-BA濃度過高時(shí)促進(jìn)了無效愈傷的形成，而對(duì)幼苗長(zhǎng)勢(shì)并無較大的影響。因此，在櫻花外植體初代培養(yǎng)系建立時(shí)，以不影響新芽生長(zhǎng)為原則，選擇較低的6-BA濃度。由以上試驗(yàn)和分析，C6較適合幼嫩櫻花外植體的初代培養(yǎng)。

3.1.4櫻花繼代培養(yǎng)基的選擇。根據(jù)櫻花初代培養(yǎng)基初選試驗(yàn)的結(jié)果，選擇了3/4MS做基本培養(yǎng)基，并對(duì)6-BA和NAA作了調(diào)整。從6-BA和NAA的配比中可看到，除愈傷有差異外，Jl～J4中的櫻花繼代苗狀態(tài)差別不大。但從總體試管苗的整齊性來看，J2最好（很可能6-BA和NAA的配比最適合櫻花試管苗的繼代）。因此，為了櫻花生產(chǎn)中繼代周期的一致性并便于操作，櫻花試管苗生產(chǎn)中的繼代前期培養(yǎng)基選擇J2較合適。但隨著繼代代數(shù)的增加繼代苗弱化，要把NAA和6-BA濃度兩者進(jìn)行調(diào)配，根據(jù)試驗(yàn)和實(shí)際生產(chǎn)情況，櫻花試管苗生產(chǎn)中的繼代培養(yǎng)基選擇J5較合適。

3.1.5櫻花試管苗生根培養(yǎng)基的優(yōu)化。從表4來看，S1～S7為單加NAA試驗(yàn)，其濃度范圍是0.05～0.60mg/L。很明顯，隨著NAA濃度的升高，櫻花生根率明顯上升，為29.5%～95.5%；但不能太高，當(dāng)濃度NAA大于0.50mg/L時(shí)生根率下降，櫻花莖底部愈傷顯著增大呈松散白色。這很可能是高濃度NAA促進(jìn)了愈傷的發(fā)生而抑制根的發(fā)生。因此，高濃度NAA不適合櫻花生根。從試驗(yàn)結(jié)果來看，NAA對(duì)櫻花試管苗生根有較好的促進(jìn)作用，但最佳使用范圍應(yīng)不高于0.50mg/L，且根較粗壯，有少量愈傷。

S8～S14為單加ΙAA的試驗(yàn)，其濃度范圍是0.05～0.60mg/L。隨著ΙAA濃度的升高，櫻花莖底部的愈傷有增大的趨勢(shì)，但明顯沒有NAA愈傷大，只有ΙAA （0.60mg/L）的愈傷明顯過大，并且生根率也最低（31.0%）。在此范圍內(nèi)，生根率先緩慢升高后又降低。說明ΙAA濃度在一定范圍內(nèi)（0.00～0.40mg/L）可能具有促進(jìn)生根的能力。大于0.40mg/L，則促進(jìn)了愈傷的生長(zhǎng)，抑制了根的發(fā)生。因此，可把ΙAA濃度控制在0.00～0.40mg/L范圍內(nèi)。

S15～S21為單加ΙBA的試驗(yàn)，其濃度范圍是0.05～0.60mg/L。從表4中可以看到，同濃度的NAA、ΙAA和ΙBA對(duì)櫻花試管苗生根的影響中，ΙBA中苗的愈傷塊大小處于NAA和ΙAA之間，愈傷塊的大小隨ΙBA濃度的升高而略有升高，而愈傷塊的增大并沒有影響生根率上升的趨勢(shì)。所以，在此范圍內(nèi)單獨(dú)使用ΙBA對(duì)櫻花試管苗生根有促進(jìn)作用，但根較細(xì)長(zhǎng)而易折斷。

綜合上述分析，3種生長(zhǎng)素對(duì)櫻花試管苗根發(fā)生的影響效果為NAA＞ΙBA＞ΙAA。單獨(dú)使用NAA、ΙAA 和ΙBA時(shí)，各培養(yǎng)基間生根率差異較大。ΙAA的促進(jìn)效果較差，愈傷大，生根率低；ΙBA的促進(jìn)生根效果較好，愈傷較小，但根細(xì)長(zhǎng)易折斷，在實(shí)際生產(chǎn)中出瓶時(shí)移栽的損耗較大，從而降低了成活率。NAA雖有刺激愈傷發(fā)生的作用，但是只要把握好使用濃度，生根效果顯著且根系較粗壯、韌性好，更有利于克服出瓶損耗。綜合表4中各培養(yǎng)基生根率和愈傷塊大小以及生產(chǎn)實(shí)際來看，S6更適合于櫻花生根和生產(chǎn)。

表4 　櫻花生根統(tǒng)計(jì)表

表5　櫻花移栽成活率

3.2櫻花組培苗移栽技術(shù)探討

櫻花試管苗移栽以德國(guó)進(jìn)口KLASMAN泥炭土作為基本基質(zhì)。櫻花試管苗在生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)30d，移至溫室中煉苗3～5d，移栽到泥炭土基質(zhì)中，并在苗上方搭遮蔭網(wǎng)，以免陽(yáng)光灼傷幼苗。栽培溫度18～26℃，保持基質(zhì)濕潤(rùn)。15d后去除遮蔭網(wǎng)，30d統(tǒng)計(jì)成活率。櫻花1號(hào)、櫻花2號(hào)、櫻花3號(hào)和櫻花4號(hào)的移栽情況如表5所示。

從表5可看出，櫻花在泥炭土基質(zhì)中的成活率相當(dāng)高，都在90%以上，說明這種基質(zhì)適合櫻花大規(guī)模栽培。

4　結(jié)論

從以上試驗(yàn)可得出，規(guī)模化生產(chǎn)4個(gè)品種櫻花試管苗過程中所用到的培養(yǎng)基，C6［3/4MS+6-BA（0.50mg/L）+ NAA（0.02mg/L）］培養(yǎng)基可用于外植體的初代培養(yǎng)和前期繼代，正常的繼代以J5［3/4MS+6-BA（0.30mg/L）+ NAA（0.01mg/L）］培養(yǎng)基為佳（繼代周期為30～35d）。

S6［1/2MS+NAA（0.50mg/L）+AC］可用于生根培養(yǎng)。在組織培養(yǎng)過程中，櫻花的遺傳差異主要表現(xiàn)在生根方面。根據(jù)試驗(yàn)，縮小了激素的選擇范圍，即生長(zhǎng)素濃度應(yīng)不超過0.50mg/L，盡量不用ΙAA，而用ΙBA或者NAA或者是混合使用。這樣對(duì)每個(gè)品種都能較快地確定其最佳生根培養(yǎng)基。相對(duì)來說，櫻花試管苗的栽培還是比較容易的，4個(gè)櫻花品種試管苗在泥炭土的基質(zhì)上成活率都能達(dá)到90%以上。以上這一系列的培養(yǎng)基可根據(jù)櫻花試管苗在規(guī)?；a(chǎn)中所處的不同狀態(tài)來進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整。

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