陸春梅（湛江市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣東　湛江　524037）

“新型鴨瘟”流行病學(xué)及病原特性的研究

陸春梅
（湛江市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣東湛江524037）

鴨瘟是一種嚴(yán)重危害養(yǎng)鴨產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一種傳染病，對(duì)養(yǎng)鴨產(chǎn)業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。當(dāng)前很多養(yǎng)鴨地區(qū)都出現(xiàn)了與鴨瘟變化類似的疾病，傳染較迅速，一旦發(fā)病，將會(huì)產(chǎn)生很高的致死率。目前生物科學(xué)人員將該病定義為“新型鴨瘟”，還沒有完善的防治措施，造成的經(jīng)濟(jì)損失較大，影響范圍較廣。基于此，對(duì)“新型鴨瘟”的流行病學(xué)及病原特性展開研究。

新型鴨瘟；流行??；病原特性

鴨瘟主要侵害雛鴨，常用鴨瘟疫苗不能預(yù)防該病的發(fā)生，具有傳染率高、致死率高等特點(diǎn)，給我國很多養(yǎng)鴨大戶造成了很大影響，挫傷了養(yǎng)殖專業(yè)戶的養(yǎng)鴨積極性。

1“新型鴨瘟”流行病學(xué)調(diào)查和病理學(xué)研究

1.1材料和器材

選擇濰坊、臨朐、昌樂等地區(qū)的發(fā)病鴨，然后收集癥狀明顯或?yàn)l臨死亡的鴨子的食道、脾臟、胰臟等主要內(nèi)臟部位，選擇發(fā)生明顯病變的部位。

試驗(yàn)試劑主要為甲醛、乙醇、二甲苯、伊紅染色液和蘇木素染色液；試驗(yàn)儀器為組織切片機(jī)、研究顯微鏡和光學(xué)顯微鏡。

1.2試驗(yàn)方法

了解發(fā)病鴨子的種類、發(fā)病情況、發(fā)病日期和死亡率。利用上述儀器對(duì)組織器官病理變化、腦組織和肝臟等進(jìn)行采集，并分離病原。之后使用福爾馬林將收集好的病死鴨的肝臟、胰臟和腦等病變組織進(jìn)行固定，石蠟切色，使用H.E染色，觀察組織學(xué)變化［1，2］。

1.3結(jié)果與分析

第一，從山東飼養(yǎng)鴨子的種類來看，主要為櫻桃谷肉鴨。除了飼養(yǎng)方法操作不當(dāng)造成雛鴨死亡外，其余表現(xiàn)正常。但在某時(shí)期，該區(qū)域鴨子均產(chǎn)生了新疫病，使用鴨疫苗注射急性處理沒有變化，之后采用血清治療均未取得進(jìn)展，產(chǎn)生的經(jīng)濟(jì)損失較嚴(yán)重。第二，臨床特征主要表現(xiàn)為鴨體溫度升高，精神萎靡，食欲減少，飲水量增加；嚴(yán)重鴨靜臥地上，眼瞼水腫，羽毛濕潤；頭頸紅鉆；鼻腔流出灰白色稀糞；肛門處可見換綠色假膜［3］。第三，解剖發(fā)現(xiàn)，食道、直腸等消化道被結(jié)痂塊覆蓋；食道黏膜呈黃白色痂塊，壞死表面出血，局灶性壞死；排泄黏膜充血，肛周羽毛結(jié)塊。

2“新型鴨瘟”病原分離鑒定和特性研究

2.1材料、儀器和設(shè)備

選擇山東省的病死鴨，收集脾臟、肝臟等重要病變組織。試驗(yàn)動(dòng)物為濰坊的櫻桃谷雛鴨、濟(jì)南鴨胚雛番鴨、泰安的家兔和山東的SPF雞胚。試劑為氯化鈉、氯仿和乙醚等國產(chǎn)分析純；使用普通瓊脂培養(yǎng)基、血瓊脂培養(yǎng)基等進(jìn)行培養(yǎng)；從中國獸醫(yī)監(jiān)察所購買鴨瘟毒；自制鴨瘟陽性血清；購買溴脫氧尿核苷；飽和NH4（SO4）2溶液；PBS緩沖劑；油佐劑。試驗(yàn)儀器為數(shù)顯恒溫浴鍋、紫外分光光度儀、高速臺(tái)式離心機(jī)和磁力攪拌器、超凈工作臺(tái)、低速離心機(jī)和電子天平等。

2.2試驗(yàn)方法

2.2.1分離NDPV病毒。①分離培養(yǎng)細(xì)菌。在無菌操作下選取發(fā)病鴨的肝、脾等組織，并將其放置在各個(gè)培養(yǎng)基中，觀察細(xì)菌變化，再進(jìn)行細(xì)菌鑒定試驗(yàn)。②處理病料。在無菌環(huán)境下對(duì)發(fā)病鴨的肝臟、腦組織等進(jìn)行研磨，并將其加入到堿性緩沖液中，凍融后放置在37℃環(huán)境下靜置0.5h，并進(jìn)行離心操作，過濾后保存?zhèn)溆?。③取出處理好的濾液并接種于番鴨胚，觀察接種后的死亡狀況；同期將滅菌生理鹽水作為對(duì)照，觀察并計(jì)算鴨死亡率。④進(jìn)行病毒純化操作。將尿囊液靜置離心0.5h，沉淀病毒。⑤病毒電鏡的觀察。按照實(shí)驗(yàn)室觀察方法，進(jìn)行負(fù)染電鏡觀察和超薄切片電鏡觀察。

2.2.2研究NDPV特性。一方面，從生物學(xué)特性進(jìn)行研究，對(duì)不同品種的鴨胚致死率進(jìn)行分析。將病毒直接接種在櫻桃谷鴨胚、北京鴨胚等，記錄死亡率。同期設(shè)有正常鴨胚，將設(shè)生理鹽水為對(duì)照組。另一方面，理化特性研究：①分離病毒ELD50，按照離心-稀釋-接種等操作，觀察鴨胚死亡率，使用Reed-Muench計(jì)算病毒ELD50；②氯仿敏感試驗(yàn)，取一定病毒液，加入氯仿，離心后進(jìn)行10倍稀釋，將稀釋溶液接種給鴨胚，37℃孵育，測(cè)定病毒ELD50；③乙醚敏感試驗(yàn)，取一定病毒液加入乙醚，在4℃冰箱中靜置1d，然后進(jìn)行離心并作10倍稀釋，接種于鴨胚，計(jì)算病毒ELD50；④取病毒液并將其接入無菌抗生素瓶中，將一瓶小品pH調(diào)至3.0，第2個(gè)小瓶加入生理鹽水，室溫下放置2h，使用溶液為5.6%的NaHCO3溶液將一瓶pH調(diào)至7.2，記錄并計(jì)算病毒ELD50［4］。

2.2.3測(cè)定病毒濃縮和病毒含量。NDPV與DPV提純方法操作一致，具體如下：①PEG濃縮法，取一定量的病毒液加入PEG和NaCl中，將其pH調(diào)至7.2，在4℃冰箱中放置，次日進(jìn)行離心，使用TE緩沖懸浮，PBS透析；②飽和硫酸銨法，取PEG病毒懸浮液，加入一定的NH4（SO4）2中，濃度調(diào)制50%，pH為7.2，在4℃冰箱中過夜，次日離心0.5h，使用PBS透析，TE為緩沖懸浮液，檢測(cè)BaCl2中硫酸根離子并去除。

2.2.4血清學(xué)鑒定。首先，分離病毒株并制備高兔血清溶液，按照常規(guī)方法進(jìn)行粗提取后，如果AGP試驗(yàn)測(cè)定血清抗體在1∶64以上，進(jìn)行心臟采血，分離血清，并標(biāo)記NDPPS和DPPS。其次，進(jìn)行抗NDPV高兔血清保護(hù)試驗(yàn)。病毒懸液10倍稀釋，一列加入等量血清，另一列加入待檢驗(yàn)血清，充分混合，在37℃溫箱中保存；接種鴨胚記錄鴨胚死亡狀況，計(jì)算待檢測(cè)血清的中和指數(shù)。最后進(jìn)行血清定性中和試驗(yàn)。將各種鴨胚等量混合，放置在37℃的室內(nèi)中靜置1h，分別尿囊接種12d，設(shè)陽性血清和生理壓水100ELD50的NDPV為對(duì)照度，觀察7d。

2.3結(jié)果與分析

①細(xì)菌分離試驗(yàn)表明各種培養(yǎng)基上無細(xì)菌生長。②病毒分析培養(yǎng)顯示，接種后鴨胚3～7d死亡，死亡率高達(dá)100%。將死胎放置過夜發(fā)現(xiàn)，死亡胚胎呈現(xiàn)淡黃綠色，出現(xiàn)血點(diǎn)，部分水腫。肝出血嚴(yán)重，其余器官出現(xiàn)不同程度的出血，胚體變化不明顯。③電鏡觀察發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)不同形態(tài)的病毒粒子。絨毛尿囊切片可觀察到帶囊膜的病毒粒子，體內(nèi)含有大量分散病毒。肝臟超薄切片內(nèi)部無明顯變化，肝細(xì)胞分解或消失。④NDPV禽胚致死率試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，病毒液對(duì)櫻桃谷鴨胚致死率可以達(dá)到100%，其他鴨胚致死率不高。致死的禽胚主要表現(xiàn)為水腫、肝、腎出血。病毒對(duì)不同禽胚的致死率如圖1所示。⑤NDPV血凝活性測(cè)定表示，NDPV無血凝活性，不凝集雞、鴨、豬等細(xì)胞。⑥理化性研究發(fā)現(xiàn)，病毒對(duì)乙醚、氯仿等無抵抗力，對(duì)酸和堿處理較敏感，在56℃下可讓病毒滅活。⑦血清學(xué)試驗(yàn)測(cè)試顯示，該病毒可以被鴨瘟陽性血清中和，測(cè)定該病毒ELD50為10～3.46/0.2mL。⑧該病與鴨瘟在臨床和剖檢方面存在很多相似處，可以將其認(rèn)為皰疹病毒成員。

圖1　不同禽胚對(duì)病毒液的致死率比較

3　結(jié)語

通過對(duì)“新型鴨瘟”流行病學(xué)及病原特性進(jìn)行研究，經(jīng)過相關(guān)診斷和剖析檢查發(fā)現(xiàn)，該病常發(fā)于櫻桃谷鴨，而且經(jīng)常發(fā)作于雛鴨。臨床上主要表現(xiàn)為流血、水腫、消瘦等，病理學(xué)檢查肝臟等器官會(huì)出現(xiàn)明顯出血和細(xì)胞死亡。從病死鴨體分離出1株病毒，病毒呈現(xiàn)圓球形態(tài)，不耐酸、不耐熱，對(duì)氯仿和乙醚較敏感。本次在排除其他病原后，判斷出該種病為新型鴨瘟病毒。

［1］何海蓉，季明，朱國強(qiáng).雛番鴨細(xì)小病毒瓊擴(kuò)抗原研制及初步應(yīng)用［J］.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2014（5）：59-60.

［2］汪銘書，程安春，周毅.雛鵝新型病毒性腸炎病毒的提純和核酸鏈型及結(jié)構(gòu)蛋白分析［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2014（2）：276-279.

［3］祁保民.鴨病毒性肝炎的病理形態(tài)學(xué)觀察［J］.福建農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2014（3）：350-352.

［4］謝芝勛.用聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)鴨瘟病毒的研究［J］.中國獸藥雜志，2016（3）：10-12.

S858.32

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1674-7909（2016）08-36-2

陸春梅（1980-），女，大專，助理獸醫(yī)師，研究方向：獸醫(yī)治療。