尹淑杰　柳朝陽(yáng)　任永波　宋慶嬌　張　濤

(佳木斯大學(xué)，黑龍江　佳木斯　154007)

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川芎嗪抗β淀粉樣蛋白25～35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡作用的機(jī)制

尹淑杰1柳朝陽(yáng)2任永波宋慶嬌張濤

(佳木斯大學(xué)，黑龍江佳木斯154007)

目的探討川芎嗪是否作用PI3K/Akt通路抗β淀粉樣蛋白(Aβ)25～35誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。方法Aβ25～35作用SH-SY5Y細(xì)胞建立AD細(xì)胞模型，MTT法檢測(cè)細(xì)胞的生存率，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；Western印跡檢測(cè)p-Akt、Akt、Bax、Bcl-2、caspase-3 蛋白表達(dá)。結(jié)果川芎嗪能夠抑制Aβ25～35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡和促進(jìn)其存活；川芎嗪可抑制Aβ25～35引起的p-Akt/Akt、Bcl-2表達(dá)降低和Bax、caspase-3的表達(dá)增加。PI3K/Akt通路抑制劑LY294002能夠抑制川芎嗪對(duì)Aβ25～35誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用，抑制川芎嗪誘導(dǎo)的p-Akt/Akt、Bcl-2表達(dá)上調(diào)及Bax、caspase-3表達(dá)下調(diào)。結(jié)論川芎嗪拮抗Aβ25～35誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與作用PI3K/Akt通路，調(diào)節(jié)Bcl-2、Bax、caspase-3的表達(dá)有關(guān)。

川芎嗪；細(xì)胞凋亡；阿爾茨海默病；PI3K/Akt信號(hào)通路

川芎嗪(TMP)是中藥川芎根莖中的生物堿單體，具有抗凝、抑制血小板聚集、擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)等廣泛的生物作用。臨床上主要用于治療多種心血管疾病〔1，2〕。本實(shí)驗(yàn)探討TMP抗β淀粉樣蛋白(Aβ)25～35誘導(dǎo)的神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞凋亡是否與作用于PI3K/Akt通路有關(guān)。

1　材料與方法

1.1材料SH-SY5Y細(xì)胞株購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所細(xì)胞庫(kù)。 TMP純品、磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)抑制劑LY294002、Aβ25～35購(gòu)于Sigma公司；膜聯(lián)蛋白A5-綠色熒光素(Annexin V-FITC)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、Akt、p-Akt、Bax、Bcl-2、caspase-3抗體、β-actin等抗體購(gòu)于北京中杉金橋生物公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞置于培養(yǎng)箱(37℃、5% CO2)，每2～3 d傳代1 次。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行藥物作用和檢測(cè)指標(biāo)。

1.2.2阿爾茨海默病(AD)細(xì)胞模型的制備取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期濃度為1×105/ml SH-SY5Y細(xì)胞2 ml接種于6孔板，培養(yǎng)24 h。24 h后加入Aβ25～35繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞。

實(shí)驗(yàn)分對(duì)照組、Aβ25～35組、TMP組(1 mmol/L)、LY組(LY294002濃度為50 μmol/L)、TMP+LY組。除對(duì)照組外，其余下四組Aβ25～35的濃度均為20 μmol/L。

1.2.3MTT法檢測(cè)細(xì)胞生存率胰酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/ml，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μl，培養(yǎng)24 h，加入Aβ25～35及TMP，對(duì)照組加入等量的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照(單純培養(yǎng)基、無(wú)細(xì)胞)組。加入MTT溶液(5 mg/ml)20 μl；培養(yǎng)4 h，每孔加入200 μl二甲基亞砜(DMSO)，于490 nm處檢測(cè)吸光度(OD)值。計(jì)算細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白對(duì)照組OD值)/(對(duì)照組OD值-空白對(duì)照組OD值)。

1.2.4Annexin V-Fluos染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡各組細(xì)胞胰酶消化，成懸液吹打，離心調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至1×105/ml，加入AimexinV-Fluos約100 μl/管，15℃避光15 min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)調(diào)亡(Ex=488 nm；Em=515 mn)，利用FCSExpress 3.0軟件分析細(xì)胞凋亡。

1.2.5Western印跡法檢測(cè)Akt、p-Akt、Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白表達(dá)收集各組細(xì)胞提取總蛋白，測(cè)定各組蛋白質(zhì)含量。各組取等量蛋白上樣，用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)進(jìn)行凝膠電泳，并轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF) 膜上。5%脫脂牛奶在4℃封閉 1 h，分別加入用封閉液稀釋的一抗Akt (1∶500)、p-Akt(1∶500)、Bcl-2(1∶500)、Bax (1∶500)、caspase-3 (1∶500)，β-actin(1∶2 000)，4℃孵育過(guò)夜，加入羊抗兔或抗鼠的第二抗體(1∶2 000)，室溫雜交1 h，采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)檢測(cè)分析結(jié)果。對(duì)蛋白條帶灰度進(jìn)行分析，以β-actin的灰度值為對(duì)照，計(jì)算各組蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS11.0軟件行LSD檢驗(yàn)或單因素方差分析。

2　結(jié)　果

2.1TMP作用PI3K/Akt通路促進(jìn)SH-SY5Y細(xì)胞存活SH-SY5Y細(xì)胞存活率：對(duì)照組〔(100.0±3.91)%〕高于Aβ25～35組〔(69.5±4.34)%〕(P<0.05 )；TMP組〔(92.8±2.32)%〕高于Aβ25～35組(P<0.05)；TMP+LY 組細(xì)胞存活率〔(81.5±2.09)%〕高于Aβ25～35組(P<0.05)低于TMP 組(P<0.05)，LY組〔(54.7±3.31)%〕低于Aβ25～35組和TMP+LY 組(P<0.05)。表明LY294002可以抑制TMP 促進(jìn)Aβ25～35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞存活的作用。

2.2TMP作用PI3K/Akt通路拮抗Aβ25～35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡SH-SY5Y細(xì)胞凋亡率檢測(cè)結(jié)果，LY組〔(52.1±3.76)%〕最高，對(duì)照組〔(4.1±0.03)%〕最低；TMP+LY組〔(31.5±3.11)%〕高于TMP組〔(7.3±0.17)%〕和Aβ25～35組〔(16.3±1.39)%〕(P<0.05)；TMP 組低于Aβ25～35組和TMP+LY組(P<0.05)。說(shuō)明TMP能夠拮抗Aβ25～35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡，抑制PI3K/Akt通路可以抑制TMP拮抗Aβ25～35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡作用。

2.3TMP對(duì)Akt、p-Akt、Bcl-2、Bax、caspase-3表達(dá)的影響p-Akt/Akt 比值和Bcl-2表達(dá)：與Aβ25～35組相比，對(duì)照組最高(P<0.05)，LY組最低(P<0.05)，TMP組較高(P<0.05)；與TMP組相比，TMP+LY 組較低(P<0.05)；而TMP+LY組高于LY組(P<0.05)，表明TMP能夠促進(jìn)p-Akt和Bcl-2的表達(dá)，PI3K/Akt抑制劑-LY294002能部分抑制TMP對(duì)p-Akt和Bcl-2表達(dá)的影響。Bax和caspase-3表達(dá)：與Aβ25～35組相比，TMP 組表達(dá)較低(P<0.05)；與TMP組相比，TMP+LY組表達(dá)較高(P<0.05)：而TMP+LY組的表達(dá)低于LY組和Aβ25～35組(P<0.05)。 說(shuō)明TMP 能夠抑制Bax和caspase-3表達(dá)，P13K/Akt 抑制劑-LY294002 能夠部分抑制TMP對(duì)Bax和caspase-3表達(dá)的影響。見(jiàn)表1。

表1　Western印跡檢測(cè) p-Akt/Akt、 Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白表達(dá)

與Aβ25～35組相比：1)P<0.05；與TMP組相比：2)P<0.05；與LY組相比：3)P<0.05

3　討　論

AD是一種神經(jīng)退行性疾病，以進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙為主要臨床表現(xiàn)。Aβ形成的老年斑和神經(jīng)元纖維纏結(jié)〔3〕及因細(xì)胞凋亡而導(dǎo)致廣泛的神經(jīng)元和突觸的丟失是AD病理特征。研究發(fā)現(xiàn)，AD患者腦中存在大量的神經(jīng)元凋亡和異常表達(dá)的凋亡相關(guān)蛋白酶〔4〕。

PI3K/Akt是在細(xì)胞生長(zhǎng)增殖和代謝等方面發(fā)揮重要作用的信號(hào)通路〔5〕，與腫瘤、代謝疾病和神經(jīng)退行性疾病等均有關(guān)〔6〕。PI3K/Akt抑制細(xì)胞凋亡，一方面通過(guò)抑制Bcl-2家族蛋白和caspase蛋白實(shí)現(xiàn)，另一方面通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞存活的基因表達(dá)實(shí)現(xiàn)〔7〕。PI3K/Akt與AD密切相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，AD患者腦中Akt的活性和含量明顯降低；Aβ25～35下調(diào)Akt的表達(dá)抑制激活PI3K/Akt信號(hào)通路〔8〕。Aβ25～35能通過(guò)抑制激活PI3K/Akt通路而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔9〕。因此，通過(guò)激活PI3K/Akt信號(hào)通路可以抑制神經(jīng)元凋亡。由此可見(jiàn)，在AD的發(fā)病機(jī)制中，信號(hào)通路PI3K/Akt具有重要作用，也是治療AD的有效靶點(diǎn)。

如果TMP可以激活信號(hào)通路PI3K/Akt來(lái)抑制 由Aβ25～35誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，那么PI3K/Akt通路抑制劑就可以抑制TMP的抗 Aβ25～35誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明TMP可以誘導(dǎo)Akt磷酸化，這個(gè)作用可被LY294002抑制，TMP具有激活PI3K/Akt信號(hào)通路作用?？辜?xì)胞凋亡通路PI3K/Akt具有調(diào)節(jié)Bcl-2、Bax、 caspase-3等表達(dá)的作用。我們推斷TMP主要作用PI3K/Akt通路上調(diào)Bcl-2的表達(dá)、下調(diào)caspase-3、Bax促凋亡蛋白的表達(dá)，抗Aβ25～35引起的細(xì)胞凋亡。因此抑制TMP抗Aβ25～35誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡可以通過(guò)抑制PI3K/Akt通路的激活實(shí)現(xiàn)。抑制信號(hào)通路PI3K/Akt可抑制TMP拮抗Aβ25～35誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

1李金柱，李偉.川芎嗪的結(jié)構(gòu)改造及其生物活性研究進(jìn)展〔J〕.中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥，2008；3(1)：137-8.

2姜宏，施廣飛，朱珠.川芎嗪對(duì)心血管作用研究進(jìn)展〔J〕.中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2007；12(5)：484-6.

3Ballard C，Gauthier S，Corbett A，etal.Alzheimer's disease〔J〕.Lancet，2011；377(9770)：1019-31.

4Serrano-Pozo A，F(xiàn)rosch MP，Masliah E，etal.Neuropathological alterations in Alzheimer disease〔J〕.Cold Spring Harb Perspect Med，2011；1(1)：a006189.

5Vadas O，Burke JE，Zhang X，etal.Structural basis for activation and inhibition of class I phosphoinositide 3-kinases〔J〕.Sci Signal，2011；4(195)：e2.

6Hemmings BA，Restuccia DF.PI3K-PKB/Akt pathway〔J〕.Cold Spring Harb Perspect Biol，2012；4(9)：11189.

7Duronio V.The life of a cell；apoptosis regulation by the PI3K/PK Bpathway〔J〕.Biochem J，2008；415(3)：333-44.

8Lee HK，Kumar P，F(xiàn)u Q，etal.The insulin/Akt signaling pathway is targeted by intracellular beta-amyloid〔J〕.Mol Biol Cell，2009；20(5)：1533-44.

9Martin D，Salinas M，Lopez-Valdaliso R，etal.Effect of the Alzheimer amyloid fragment Abeta(25-35) on Akt/PKB kinase and survival of PC 12 cells〔J〕.J Neurochem，2001；78(5)：1000-8.

〔2015-12-09修回〕

(編輯袁左鳴)

黑龍江省普通高等學(xué)校青年學(xué)術(shù)骨干支持計(jì)劃項(xiàng)目(1252G059);黑龍江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(H2015074);佳木斯大學(xué)科技重點(diǎn)項(xiàng)目(Sz2011-009);黑龍江省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項(xiàng)目(20050222026)

張濤(1971-)，女，博士，教授，碩士導(dǎo)師，主要從事中草藥抗腫瘤及腫瘤免疫機(jī)制方面的研究。

尹淑杰(1969-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事腦血管病、癲癇，頭痛眩暈及老年癡呆的診斷和治療。

R2-031

A

1005-9202(2016)17-4151-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.17.006

1濟(jì)寧市第二人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

2佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)四科