趙娟，張可煜，薛飛群，程培培，賴鑫淼，張麗芳

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部動物寄生蟲病學(xué)重點開放實驗室，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸藥安全評價與獸藥殘留研究重點開放實驗室，上海閔行200241）

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飼料中抗球蟲藥物
——沙咪珠利的高效液相色譜內(nèi)標(biāo)檢測法研究

趙娟，張可煜，薛飛群，程培培，賴鑫淼，張麗芳*

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部動物寄生蟲病學(xué)重點開放實驗室，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸藥安全評價與獸藥殘留研究重點開放實驗室，上海閔行200241）

本實驗建立了測定飼料中抗球蟲新藥沙咪珠利含量的高效液相色譜（HPLC）-內(nèi)標(biāo)法。以4-硝基鄰甲酚為內(nèi)標(biāo)物，C18（4.6 nm×250 nm，5 μm）柱為分析柱，乙腈-0.2%磷酸水溶液（V/V，40∶60）為流動相。飼料樣品經(jīng)乙腈提取，正己烷除脂，C18柱分離后，在251 nm波長下進(jìn)行檢測，內(nèi)標(biāo)法定量。結(jié)果表明，在所選擇的色譜條件下，空白飼料對沙咪珠利無干擾，沙咪珠利和內(nèi)標(biāo)也得到良好的分離；沙咪珠利在1～50 mg/kg添加范圍內(nèi)具有很好的線性關(guān)系，定量限為1 mg/kg；此方法日內(nèi)和日間精密度良好，日內(nèi)RSD為0.57%～2.17%，日間RSD為0.32%～1.25%。相對回收率為99.43%～102.6%。本法樣品前處理簡單，方法簡便可靠，可用于飼料中沙咪珠利的檢測。

沙咪珠利；高效液相色譜；內(nèi)標(biāo)法；飼料；檢測

艾美耳屬球蟲寄生于雞的盲腸中會導(dǎo)致雞球蟲病的發(fā)生。雞球蟲病以流行范圍廣、防治困難、死亡率高為特征（Shirley等，2004）。三嗪類化合物沙咪珠利是中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所動物藥學(xué)實驗室自主研發(fā)的新型抗球蟲藥。該藥物具有獨特的化學(xué)結(jié)構(gòu)，在前期實驗中發(fā)現(xiàn)，5 mg/kg劑量添加到飼料或飲用水中就具有良好的抗球蟲效果，9 mg/kg以上劑量添加在飼料或飲用水中能穩(wěn)定地達(dá)到高效抗球蟲的效果，抗球蟲指數(shù)（ACI）達(dá)185～200，可用于預(yù)防或治療球蟲病，是一種高效的候選抗球蟲藥物（張可煜等，2014）。在預(yù)防用藥的給藥途徑中，飼料預(yù)混給藥是一種簡單快捷、普遍使用的給藥方式，同時在藥物的安全性評價的實驗中也是經(jīng)常采用的方法。為了能準(zhǔn)確檢測沙咪珠利在飼料中的含量，本實驗研究建立了高效液相色譜（HPLC）內(nèi)標(biāo)法測定飼料中沙咪珠利。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑Waters 2690高效液相色譜儀（美國沃特世公司生產(chǎn)）；Waters 2487紫外檢測器（美國沃特世公司生產(chǎn)）；Micro CL 17/21離心機(jī)（美國Thermo公司）；超純水系統(tǒng)（上海瑞楓生物科技有限公司）；渦旋混合器（XW-OA，上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）；氮吹儀（美國Organomation Associates公司）；AE240雙量程分析天平［（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）］；離心機(jī)（AnkeLXJ-ⅡB，上海安亭科學(xué)儀器廠）。

沙咪珠利對照品（含量≥99.5%，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所動物藥學(xué)研究室制備）；4-硝基鄰甲酚（含量：99.25%，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所動物藥學(xué)研究室制備）；正己烷（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；乙腈（色譜純，美國Fisher Chemical）；磷酸（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；所用水均為UP水。

1.2溶液的配制

1.2.1沙咪珠利標(biāo)準(zhǔn)液配制精密稱取50 mg沙咪珠利標(biāo)準(zhǔn)品于25 mL容量瓶中，用乙腈溶解配成2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，取適量用乙腈分別稀釋成1000、600、400、200、100、20 μg/mL系列濃度溶液，于4℃保存。

1.2.2內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)液配制精密稱取4-硝基鄰甲酚150.0 mg于50 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容，配成3 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。于冰箱4℃下保存。

1.3樣品的前處理將大鼠飼料進(jìn)行研磨后，稱?。?.00±0.02）g飼料于50 mL具塞離心管中，加入濃度為3 mg/mL的4-硝基鄰甲酚100 μL作為內(nèi)標(biāo)，渦旋30 s，混勻。加入10 mL乙腈渦旋1 min，超聲30 min，4000 r/min離心10 min，取上清液乙腈層5 mL置于小試管中，于50℃水浴下氮氣吹干。加1 mL乙腈-0.2%磷酸水混合液（V/V，40∶60）復(fù)溶后，再加入1 mL正己烷，渦旋30 s，棄去上層正己烷層，取下層液體于14000 r/min離心10 min，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，上高效液相色譜儀測定。

1.4色譜條件及方法學(xué)驗證

1.4.1色譜條件色譜柱：Unitary C18（4.6 nm× 250 nm，5 μm）；流動相：乙腈（A%）和0.2%磷酸水溶液（B%）進(jìn)行梯度洗脫（表1）。檢測波長251 nm，柱溫30℃，流速1 mL/min。

表1　梯度洗脫程序

1.4.2方法特異性取空白大鼠飼料以及空白大鼠飼料加標(biāo)樣品分別按1.3的方法處理，在上述HPLC條件下進(jìn)行測定，并同時測定沙咪珠利標(biāo)準(zhǔn)品溶液，記錄色譜圖。

1.4.3定量限和檢測限的確定取沙咪珠利標(biāo)準(zhǔn)儲備液，在室溫下分別稀釋成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，然后各取100 μL添加到空白飼料中。充分混合后按照1.3的樣品處理方法進(jìn)行前處理，隨后進(jìn)行HPLC測定和色譜圖記錄。以HPLC檢測獲得的目標(biāo)峰峰高信噪比不低于10倍（S/N≥10）時所對應(yīng)的溶液濃度為該方法的定量限濃度，以檢測出的目標(biāo)峰峰高信噪比不低于3倍（S/N≥3）時所對應(yīng)的溶液濃度為該方法的檢測限濃度。

1.4.4線性關(guān)系取100 μL濃度為1000、600、400、200、100、20μg/mL沙咪珠利系列濃度溶液分別加入2.00 g空白飼料中，按照1.3的樣品處理方法進(jìn)行前處理后，再進(jìn)行HPLC測定，根據(jù)沙咪珠利的峰面積與內(nèi)標(biāo)物4-硝基鄰甲酚峰面積的比值和標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度進(jìn)行線性回歸處理，確定其回歸方程、相關(guān)系數(shù)以及線性范圍。

1.4.5精密度和回收率測定向2.00 g空白飼料中分別添加高、中、低三個添加濃度（900、400、30μg/mL）沙咪珠利標(biāo)準(zhǔn)溶液各100 μL，使沙咪珠利在飼料中的濃度分別為45、20、1.5 mg/kg，并均添加濃度為3 mg/mL的4-硝基鄰甲酚100 μg/mL作為內(nèi)標(biāo)，按照1.3的樣品處理方法進(jìn)行前處理，隨后進(jìn)行HPLC測定，每個濃度做5個平行，計算沙咪珠利在飼料中的回收率以及日內(nèi)變異系數(shù)。并且采用相同的方法連續(xù)檢測3 d，計算沙咪珠利的日間變異系數(shù)。

1.4.6儲備液穩(wěn)定性測定本研究對沙咪珠利和內(nèi)標(biāo)物4-硝基鄰甲酚的儲備液進(jìn)行了穩(wěn)定性考察。將沙咪珠利和內(nèi)標(biāo)物的儲備液用乙腈稀釋制備成濃度分別為33.2 μg/mL和249 μg/mL工作溶液，經(jīng)高效液相色譜測定，平行測定兩次，分別記錄沙咪珠利和內(nèi)標(biāo)物4-硝基鄰甲酚的峰面積。儲備液分別放置7 d和14 d后，再稀釋成同一濃度的工作溶液進(jìn)行測定。

1.4.7樣品檢測將大鼠飼料樣品進(jìn)行抽測。每份樣品抽取三份飼料，稱取2.00 g飼料，按照1.3的方法處理后進(jìn)行測定。

2　結(jié)果與分析

2.1內(nèi)標(biāo)物選擇為保證試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，消除樣品提取過程中產(chǎn)生及機(jī)器運(yùn)行狀態(tài)不同所造成的誤差，因此采用內(nèi)標(biāo)法。內(nèi)標(biāo)法要選擇合適的內(nèi)標(biāo)物，內(nèi)標(biāo)物出峰時間與被測組分出峰時間應(yīng)接近且能完全分離。本研究嘗試采用妥曲珠利亞砜為內(nèi)標(biāo)（林析，2015），結(jié)果顯示，沙咪珠利與妥曲珠利亞砜的出峰時間相差較遠(yuǎn)，所以棄用。之后選擇4-硝基鄰甲酚進(jìn)行嘗試，在所選色譜條件下，兩者出峰時間接近，且無干擾，峰型良好且穩(wěn)定。所以選擇4-硝基鄰甲酚作為內(nèi)標(biāo)。

2.2色譜條件的選擇沙咪珠利是三嗪類化合物，從沙咪珠利的化學(xué)結(jié)構(gòu)上分析，采用C18反相柱進(jìn)行分離，在紫外波長251 nm下進(jìn)行檢測（王昊欣，2014）。使用乙腈、純水、磷酸作流動相，考察不同比例對沙咪珠利內(nèi)標(biāo)和飼料中雜質(zhì)的分離效果。實驗結(jié)果表明采用乙腈-純水系統(tǒng)出現(xiàn)主峰拖尾的現(xiàn)象，采用乙腈-水-磷酸體系能實現(xiàn)主成分和各雜質(zhì)的良好分離

2.3樣品的前處理飼料中油脂成分較多，本研究嘗試過用PSA固體萃取法萃?。ń琢幔?014），發(fā)現(xiàn)PSA對沙咪珠利具有吸附性，故棄用；后采用液液萃取的方法，用正己烷萃取油脂，進(jìn)行凈化。

在樣品的復(fù)溶中，發(fā)現(xiàn)用甲醇復(fù)溶有乳化現(xiàn)象出現(xiàn)，所以用乙腈復(fù)溶（肖文龍，2014），且未出現(xiàn)乳化現(xiàn)象。

2.4方法特異性空白大鼠飼料，沙咪珠利和內(nèi)標(biāo)物4-硝基鄰甲酚標(biāo)準(zhǔn)品溶液及空白飼料加標(biāo)樣品色譜圖，如圖1所示。數(shù)據(jù)結(jié)果表明本方法對飼料中的沙咪珠利和內(nèi)標(biāo)4-硝基鄰甲酚分離效果良好，沙咪珠利出峰時間為6.35 min，內(nèi)標(biāo)物4-硝基鄰甲酚出峰時間為8.21 min，無雜質(zhì)干擾，特異性良好。

圖1　沙咪珠利在的HPLC檢測條件下色譜圖

2.5靈敏度與線性關(guān)系由實驗結(jié)果可知，沙咪珠利在飼料中的峰高為10倍和3倍基線噪音的最小濃度分別為1 mg/kg和0.5 mg/kg飼料。沙咪珠利在飼料中的檢測限為1 mg/kg，定量限為0.5 mg/kg。

以沙咪珠利工作液的濃度為橫坐標(biāo)，沙咪珠利和4-硝基鄰甲酚的峰面積比值為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸處理。結(jié)果見圖2。由圖2可知，沙咪珠利在20～1000 μg/kg的添加濃度范圍內(nèi)，具有良好的線性關(guān)系，線性方程為Y=0.0025X-0.0125，R2＞0.999。

圖2　沙咪珠利在飼料中的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.6精密度和回收率在大鼠飼料中添加高、中、低（900、400、30 μg/kg）三個濃度的沙咪珠利工作液，每個濃度平行測定5個樣品，連續(xù)測定3批的回收率及精密度結(jié)果見表2。從結(jié)果可以看出，沙咪珠利的平均加標(biāo)回收率為99.43%～102.6%，日內(nèi)變異系數(shù)為0.57%～2.17%，日間變異系數(shù)為0.32%～1.25%。

2.7穩(wěn)定性本研究考察了兩個星期的穩(wěn)定性，結(jié)果見表3。沙咪珠利和內(nèi)標(biāo)物4-硝基鄰甲酚在兩個星期內(nèi)的穩(wěn)定性RSD＜5.0%，穩(wěn)定性良好。

2.8樣品檢測取添加沙咪珠利的濃度為8 mg/kg的高壓鼠料，進(jìn)行研磨后，稱取三份平行樣品，按1.3的方法進(jìn)行處理，測定。檢測結(jié)果顯示，添加8 mg/kg沙咪珠利的藥物回收率分別為82.99%、79.00%、83.63%，平均回收率為81.87%，相對標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.5%。

表2　飼料中沙咪珠利的添加回收率和精密度的檢測結(jié)果（n=4）

表3　沙咪珠利儲備液和內(nèi)標(biāo)儲備液穩(wěn)定性

3　結(jié)論

本研究采用高效液相色譜內(nèi)標(biāo)法對飼料中沙咪珠利進(jìn)行測定，方法采用4-硝基鄰甲酚作內(nèi)標(biāo)，峰型好，出峰情況穩(wěn)定。沙咪珠利在1～50 mg/kg添加范圍內(nèi)檢測具有很好的線性關(guān)系，定量限為1 mg/kg；此方法日內(nèi)和日間精密度良好，日內(nèi)RSD為0.57%～2.17%，日間RSD為0.32%～1.25%。相對回收率為99.43%～102.6%。該方法準(zhǔn)確度高，穩(wěn)定性好，樣品前處理簡單，為沙咪珠利在飼料中的質(zhì)量控制提供了可靠的方法。

［1］江兆玲.動物性食品中妥曲珠利及其主要代謝物妥曲珠利砜和妥曲珠利砜殘留量的測定：［碩士學(xué)位論文］［D］.北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2014.

［2］林析.新型三嗪類抗球蟲藥AC4的藥代動力學(xué)研究：［碩士學(xué)位文論文］［D］.北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2015.

［3］王昊欣.AC4原料藥質(zhì)量研究及溶液劑處方篩選：［碩士學(xué)位文論文］［D］.北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2014.

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A High Performance Liquid Chromatography（HPLC）with an internal standard was developed for determination of Acetamizuril content in feed.2-methyl-4-nitroanisole，C18 column（4.6 nm×250 nm，5 μm）and acetonitrile-0.2% phosphoric acid water solution（V/V，60∶40）were used as internal standard，analytical column and mobile phase，respectively.Feed samples were firstly extracted by acetonitrile，then undergone n-hexane grease removal，after being isolated by C18column，eventually detected by UV detector at 251 nm，and was quantified by internal standard method.The results showed that under the chosen chromatographic conditions，Acetamizuril and 2-methyl-4-nitroanisole were separated successfully；In feed，the detection of Acetamizuril content was linear in the range of 1 to 50 mg/kg and the lowest limit was 1mg/kg；the intraday and interday precision were quite excellent with intra RSD of 0.57%～2.17%and inter RSD of 0.32%～1.25%.The relative recovery was between 99.43%and 102.6%.The method was proved to be simple，rapid，precise and reproducible for quantification of Acetamizuril in feed．

Acetamizuril；HPLC；internal standard method；feed；detection

S816.17

A

1004-3314（2016）03-0032-04

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20160308

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201303038-1）；國家科技支撐計劃（2015BAD11B01-06）