PearceSC，ManiV，WeberTE，RhoadsRP，PatienceJF，BaumgardLH，GablerNK

（1.愛荷華州立大學(xué)動物科技學(xué)院，美國埃姆斯50011；2.弗吉尼亞理工大學(xué)動物和家禽科學(xué)系，美國布萊克斯堡24061）

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熱應(yīng)激和低營養(yǎng)攝入對豬腸道完整性和功能的影響

PearceSC1，ManiV1，WeberTE1，RhoadsRP2，PatienceJF1，BaumgardLH1，GablerNK1

（1.愛荷華州立大學(xué)動物科技學(xué)院，美國埃姆斯50011；2.弗吉尼亞理工大學(xué)動物和家禽科學(xué)系，美國布萊克斯堡24061）

熱應(yīng)激會損害腸道完整性，并誘發(fā)腸滲漏。因此，本試驗研究了直接或間接熱應(yīng)激（通過減少采食量）對生長豬腸道通透性的影響。選用體重（43±4）kg的雜交后備母豬（n=48），分別安置在以下控制環(huán)境中：熱中性（TN）環(huán)境（20℃，濕度35%～50%，自由采食）、熱應(yīng)激（HS）環(huán)境（35℃，濕度20%～35%，自由采食）、熱中性環(huán)境配對飼喂（PFTN，以消除不同采食量的交互影響）。第1、3、7天使豬只安樂死，采集的空腸樣品被安裝到尤式灌流室，測定跨膜電阻抗值（TER）和異硫氰基熒光標(biāo)記的脂多糖（LPS）滲透性（APP，表示為表觀滲透系數(shù)）。此外，評估腸道完整性以及應(yīng)激基因和蛋白標(biāo)志物。結(jié)果表明，不考慮熱應(yīng)激天數(shù)，HS組與TN組豬相比，血漿內(nèi)毒素水平增加45%（P＜0.05），空腸TER降低30%（P＜0.05），LPS滲透率增加2倍（P＜0.01）。此外，與PFTN組相比，HS組第7天的豬LPS滲透性有增加的趨勢（P=0.06）。整個試驗階段HS組溶菌酶和堿性磷酸酶活性下降，分別下降46%和59%（P＜0.05）；然而，3 d和7 d空腸免疫細(xì)胞標(biāo)記物——髓過氧化物酶活性增加（P＜0.05）。由此可見，熱應(yīng)激和減少采食量都會降低腸道完整性，并增加內(nèi)毒素滲透性。推測這可能會導(dǎo)致炎癥加重，在炎熱的夏季可能是導(dǎo)致豬生長性能降低的原因。

內(nèi)毒素；熱應(yīng)激；腸道完整性；豬

中國豬營養(yǎng)國際論壇是由美國動物科學(xué)學(xué)會、上海亙泰實業(yè)集團(tuán)和上海優(yōu)久生物科技有限公司聯(lián)合主辦，以“凝聚全球科研力量，驅(qū)動豬業(yè)創(chuàng)新思維”為宗旨，力邀全球一流的機構(gòu)、專家和學(xué)者，傾力打造一個動物營養(yǎng)領(lǐng)域具有國際性、前沿性和權(quán)威性的論壇。該論壇每兩年舉辦一屆，聚焦行業(yè)發(fā)展中的熱點、難點，通過專家學(xué)者和企業(yè)領(lǐng)導(dǎo)者之間進(jìn)行開放建設(shè)性的學(xué)術(shù)探討、理論研究和實踐經(jīng)驗交流，整合全球動物營養(yǎng)領(lǐng)域最新的技術(shù)和研究成果，推動行業(yè)發(fā)展，創(chuàng)造和提升產(chǎn)業(yè)價值。

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熱應(yīng)激會對動物產(chǎn)生不良影響。生長豬處在熱應(yīng)激環(huán)境中，呼吸速率和體溫明顯增加，增重緩慢，采食量明顯降低（Pearce等，2013）。然而，與熱中性（TN）配對飼喂豬（PFTN）相比，熱應(yīng)激豬增加更多的體重有明顯不同的吸收后生物能變量，如胰島素（Pearce等，2013、2012）。研究表明吸收后代謝的獨特變化與高熱負(fù)荷的直接作用和熱量攝入的減少以及腸道完整性功能改變有關(guān)。

熱應(yīng)激時哺乳動物將重新分配血流量，血液更多分配至周圍血管，以最大限度發(fā)揮輻射散熱，而胃腸道中血管收縮（Lambert，2008）。因此，流入腸道上皮的血流量和營養(yǎng)物質(zhì)減少，使腸道屏障完整性受損（Yan等，2006）。緊密連接蛋白對腸道正常屏障功能有重要作用，其合成改變與某些應(yīng)激相關(guān)（包括熱應(yīng)激），會增加腸道通透性。這種增強的滲透性使某種血液內(nèi)毒素標(biāo)記物升高，啟動免疫應(yīng)答，并激活腸道和肝臟解毒機制（Hall等，2001）。

本試驗旨在研究直接或間接熱應(yīng)激（通過減少采食量）是否可以增加生長豬腸道通透性和腸道應(yīng)激標(biāo)記物。假設(shè)熱負(fù)荷增加會引起腸上皮生理改變，導(dǎo)致屏障完整性受損，腸道功能和代謝變化，那么會進(jìn)一步增加熱應(yīng)激相關(guān)疾病的嚴(yán)重性，并使全身代謝發(fā)生變化。

1　材料與方法

1.1試驗動物和設(shè)計本研究中試驗動物、試驗設(shè)計和非腸道結(jié)果在先前的研究中已詳細(xì)描述（Pearce等，2013）。簡單的說，根據(jù)體重選擇雜交后備母豬（n=48，體重43 kg±4 kg；PIC C22/C29× 337，Carthage Veterinary Service，Carthage，IL）兩棟豬舍的一棟在熱中性環(huán)境（20℃±1℃，35%～50%濕度），分別飼喂在單獨的欄中（有單獨的給料器和飲水器）每棟豬舍24欄。動物有5 d的預(yù)試期。然后豬只被分為3個處理：熱中性環(huán)境（TN，自由采食）、熱應(yīng)激環(huán)境［HS，（35±1）℃，相對濕度20%～35%，自由采食］、配對飼喂在熱中性環(huán)境（PFTN，以對比熱應(yīng)激豬營養(yǎng)攝入）。為了評估熱處理的時間響應(yīng)，選擇熱中性豬（n=18）和熱應(yīng)激豬（n= 24）分別在第1（n=12）、3（n=12）、7天（n=18）安樂死。進(jìn)行配對飼喂以量化不同飼料和營養(yǎng)攝入的交互影響（Pearce等，2013；Rhoads等，2009）。僅在限飼后第7天安樂死6頭PFTN豬。所有豬只飼喂配合飼料，并持續(xù)監(jiān)控應(yīng)激現(xiàn)象，如溫度過高（＞41℃）、體重減少和食欲完全喪失。

安樂死前，通過靜脈穿刺收集頸靜脈血，并于4℃、1300 r/min離心10 min以獲得血清和EDTA-血漿，-20℃保存，用于后期分析。屠宰時，刮取收集離胃3 m遠(yuǎn)的空腸近端和空腸黏膜，-80℃液氮凍存用于后期分析。另外，收集20 cm整個空腸段鮮樣立即放入Krebs-Henseleit緩沖液中（包含25 mmol/L NaHCO3，120 mmol/L NaCl，1 mmol/L MgSO4，6.3 mmol/L KCl，2 mmol/L CaCl，0.32 mmol/L NaH2PO4，pH 7.4），置冰塊上，并不斷通風(fēng)送往實驗室，安裝到尤氏灌流室（Mani等，2013；Gabler等，2009、2007）。新鮮空腸段也立即被固定在10%福爾馬林溶液用于組織學(xué)分析。選擇空腸組織是因為其對營養(yǎng)吸收和高血液流量時有重要作用，并對血液內(nèi)毒素和低氧環(huán)境敏感（Maier等，2009）。

1.2腸道結(jié)構(gòu)及功能完整性測定

1.2.1腸道組織形態(tài)觀察固定在福爾馬林中的空腸樣品被送到愛荷華州立大學(xué)獸醫(yī)診斷實驗室，做腸道組織切片和蘇木伊紅染色。使用顯微鏡（DMI3000B倒置顯微鏡，班諾克本，徠卡顯微系統(tǒng)有限公司）附帶相機（12-bit QICAM Fast 1394，QImaging，Surrey，BC，Canada）觀察，每個切片分3個部分，選取10處絨毛和10處隱窩。測量每個圖片的絨毛高度和隱窩深度。最終，計算30個絨毛和隱窩的平均值作為每頭豬的一個數(shù)值。使用Q-capture Pro 6.0軟件（QImaging，Surey，BC）獲得每個絨毛和隱窩照片，并用Image-Pro Plus 7.0軟件測量（Media Cybernetics，Bethesda，MD）。

1.2.2腸道完整性和脂多糖滲透性體外試驗收集近端新鮮空腸樣品安裝到尤式灌流室，檢測腸道完整性和內(nèi)毒素及標(biāo)記的脂多糖（LPS）。選取每頭豬的一個代表性組織樣本，固定并垂直放置在連接有雙通道電流的尤氏室，其電壓電極浸沒在3%的瓊脂中，以3 mol的氯化鉀作為電導(dǎo)率。各段漿膜和黏膜層被浸泡在4 mL Krebs-Henseleit緩沖液中，給組織樣品提供穩(wěn)定的O2-CO2混合物。各段用0 mV電壓固定，處理30 min，測定其跨膜電阻抗（TER），通過前10 min組織穩(wěn)定化的平均電流來計算（Gabler等，2007）。

使用異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的LPS（來自大腸桿菌055：B5）測定空腸段內(nèi)毒素滲透性（Mani等，2013；Tomita等，2004）。組織穩(wěn)定在修正的尤氏室30min后，將20μg/mL的FITC-LPS加到黏膜側(cè)，每20 min一次，持續(xù)120 min從黏膜和漿膜室獲得培養(yǎng)基樣品在熒光分光光度計495 nm處讀數(shù)。計算FITC-LPS穿過空腸的表觀滲透系數(shù)（APP）（Mani等，2013；Tomita等，2004）。

1.3循環(huán)內(nèi)毒素測定使用市售試劑盒測定血液內(nèi)毒素水平。用重組C因子（rFC）內(nèi)毒素法，將豬血漿樣品稀釋1000倍測定內(nèi)毒素含量（Pyro-Gene Recombinant Factor C Endotoxin Detection System，Lonza，Walkersville，MD），3個平行樣分析。使用96微孔板，37℃培養(yǎng)0 h和1 h時測定熒光值。使用Synergy 4酶標(biāo)儀（Bio-Tek，Winooski，VT），激發(fā)和發(fā)射波長分別為380 nm和440 nm，熒光讀數(shù)。由于內(nèi)毒素的高敏感性，使用此方法組間和組內(nèi)差異小于20%。相對熒光單位表示為任意單位（AU/mL）。

1.4空腸、血漿炎癥和應(yīng)激標(biāo)記物測定使用市售試劑盒測定空腸的溶菌酶活性。用EnzChek熒光試劑盒測定溶壁微球菌細(xì)胞壁溶菌酶活性（Invitrogen Molecular Probes，Carlsbad，CA）。稀釋樣品，用Synersy 4酶標(biāo)儀（Bio-Tek，Winooski，VT），激發(fā)和發(fā)射波長分別為485 nm和530 nm，測定熒光值。建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，校正樣品稀釋倍數(shù)，計算溶菌酶活性。此方法檢測限為0～500 U/mL，組間和組內(nèi)差異分別為1.1%和2.9%。

使用市售試劑盒（QuantiChrom，Bioassay Systems，Hayward，CA）測定組織堿性磷酸酶活性，檢測限為0～800 IU/L。從空腸中提取蛋白，并檢測蛋白含量。然后取50 μL樣品加入到150 μL含有鎂、乙酸鹽、磷酸對硝基苯酯和檢測緩沖液的混合工作液中。樣品置于96微孔板，使用Synergy 4酶標(biāo)儀（Bio-Tek，Winooski，VT），分別在0 min和4 min于405 nm處讀數(shù)。

使用Suzuki等（1983）描述的方法測定空腸髓過氧化物酶（MPO）活性。組織樣品加入0.5%十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）磷酸鉀緩沖液（PPB，pH 6.0），勻漿，冰融，渦旋3次。然后，于4℃、10000r/min離心15 min。上清液轉(zhuǎn)移到新管中，沉淀部分再加入500 μL 0.5%的PPB+HTAB混合液，懸浮物冰融，勻漿2 min，取500 μL轉(zhuǎn)移至另一新管。樣品于4℃、10000 r/min離心15 min，收集上清液。最終上清液與鄰聯(lián)茴香胺鹽酸鹽和0.005%過氧化氫混合。1單位MPO活性以分解1 μmol過氧化氫的值來表示。反應(yīng)10 min讀取在460 nm處吸光度，以每毫克組織1 mL樣品計算。

空腸黏膜組織使用T-PER哺乳動物蛋白提取試劑（Pierce，Rockford，IL）提取，補充有蛋白酶（羅氏，印第安納波利斯，IN）抑制劑和12 mmol/L丁基化羥基甲苯，裂解液在4℃、10000 r/min離心5 min?？漳c裂解液蛋白含量用二喹啉酸測定法測定。等量的空腸組織蛋白（100 μg）用于分析白細(xì)胞介素8（IL-8），使用豬特異性ELISA法（DuoSet豬IL-8，目錄號DY535，R&D系統(tǒng)，明尼阿波利斯，明尼蘇達(dá)），按說明書測定。結(jié)果以每單位蛋白為基礎(chǔ)。檢測限為0～8000 pg/mL，組內(nèi)和組間差異分別為10.8和12.9%。

根據(jù)先前發(fā)表的評估炎癥對組織4-NHE加合物的影響（Yin等，2009），采用狹縫雜交分析法檢測空腸4-羥基壬烯醛（4-HNE）加合物。蛋白質(zhì)裂解物（15 μg）使用狹縫印跡裝置印跡到硝酸纖維素膜上，兩個平行樣分析。Ponceau S印跡可視化蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移染色，膜在4℃下與4-HNE羊抗兔抗體（AB5605，Millipore，Temecula，CA）反應(yīng)，稀釋度為1∶5000，孵育過夜。羊抗兔IgG抗體偶聯(lián)辣根過氧化物酶（HRP，皮爾斯），使用化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒連同柯達(dá)影像專業(yè)4000 mm成像系統(tǒng)和軟件（紐約州羅切斯特市）可視化和量化反應(yīng)物。

刮取黏膜測定谷胱甘肽濃度，黏膜樣品在含有1 mmol/L EDTA的冰凍MES緩沖液中勻漿，于4℃、10000 r/min下離心15 min。上清液中加入等體積10%的偏磷酸以去除蛋白，4℃、2000 r/min離心2 min。脫蛋白質(zhì)裂解物中總谷胱甘肽濃度使用比色谷胱甘肽試劑盒測定（開曼化工，安阿伯，密歇根州），結(jié)果以每單位蛋白為基礎(chǔ)。

使用市售ELISA試劑盒（ALPCO Diagnostics，Salem，NH）分析樣品中的血漿結(jié)合珠蛋白，將樣品加入到吸附有抗豬結(jié)合珠蛋白的孔中。清洗后，HRP-偶聯(lián)的抗結(jié)合珠蛋白抗體添加到板中。再次清洗后，加入顯色底物3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB），在450 nm處測定吸光度，從而測定HRP。測試樣品中結(jié)合珠蛋白數(shù)量通過標(biāo)準(zhǔn)曲線和校正樣品稀釋倍數(shù)得到。結(jié)合珠蛋白檢測限為25～400 ng/mL，組內(nèi)變異系數(shù)為4.9%。

1.5空腸Na+/K+ATP酶活性測定回腸黏膜在含有50 mmol/L蔗糖、1 mmol/L EDTA二鈉、20 mmol/L三羥甲基氨基甲烷的蔗糖緩沖液（pH 7.4）中勻漿，于4℃、1000 r/min離心10 min得到蛋白提取物。蛋白提取物被分成5等份：兩份用水處理，兩份用烏本苷處理，一份用于BCA蛋白分析。蛋白提取物用MQ水或20 mmol/L烏本苷，及Na+/K+ATP酶反應(yīng)緩沖液（pH 7.0；2000 mmol/L NaCl，100 mmol/L KCl，50 mmol/L MgCl2和250 mmol/L HEPES）預(yù)孵15 min，然后，添加新鮮的105 mmol/L ATP孵育45 min以啟動反應(yīng)。反應(yīng)45 min后，用50%冰冷的三氯乙酸終止反應(yīng)。樣品在4℃、1500 r/min離心10 min得到上清液中最終產(chǎn)物（Fuller等，2003）。最后，用鉬釩酸鹽方法（Ueda和Wada，1970）分析樣品中無機磷（Pi），3個重復(fù)，使用Synergy 4酶標(biāo)儀（Bio-Tek，Winooski，VT）在400 nm處讀數(shù)。在無烏本苷（特定Na+/K+ATP抑制劑）存在的情況下，特定Na+/K+ATP酶活性取決于ATP中無機磷含量。非特異性磷酸通過測定無蛋白懸浮液中釋放出的無機磷計算，結(jié)果以每單位蛋白為基礎(chǔ)。

1.6RNA分離和定量PCR使用市售試劑盒分離組織中總RNA（RNeasy纖維組織小型試劑盒，Qiagen公司，瓦倫西亞，加利福尼亞）。使用分光光度計（ND-100，NanoDrop Technologies，Rockland，DE）在260 nm處測定吸光度，對總RNA定量分析，通過測定260nm和280 nm的吸光度之比評估RNA純度。所有樣品OD260/280大于1.8，RNA制備的完整性評估，經(jīng)過2%瓊脂凝膠電泳后，以SYBR Safe DNA凝膠染色（Life Technologies，Carlsbad，CA），觀察18S和28S核糖體條帶決定。使用市售cDNA試劑盒（Quantitect reverse transcription kit，Qiagen，Valencia，CA）完成總RNA（1 μg）反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和消除基因組DNA。使用NanoDrop對cDNA定量，并用于實時定量PCR反應(yīng)。在含總體積為25 μL的2×quantitect的SYBR Green PCR主混合物（iQ SYBR green supermix，Bio-Rad，Hercules，CA）、正向和反向引物（0.3 mmol/L）及200 ng cDNA中完成擴增。目的基因和看家基因引物序列如表1所示。循環(huán)條件包括變性溫度95℃，15 min，然后以下循環(huán)50次：95℃，30 s；55℃，30s；72℃，30 s。72℃進(jìn)行光學(xué)檢測分析。PCR反應(yīng)結(jié)束時，進(jìn)行溶解曲線分析驗證引物特異性。每個分析同時伴隨非模板控制，所有檢測3個平行。每個樣品的mRNA豐度值根據(jù)2-ΔΔCT方法標(biāo)準(zhǔn)化為RPL32（Livak和Schmittgen，2001）。

表1　試驗用引物

1.7數(shù)據(jù)分析使用SAS 9.2軟件（SAS Inst. Inc.，Cary，NC）混合線性模式過程進(jìn)行雙模型統(tǒng)計學(xué)分析。每只豬均作為一個試驗樣品單位，用以評估隨時間的推移，熱應(yīng)激對豬生理的影響。正如預(yù)期結(jié)果，不同時間（0、3、7 d）TN組豬沒有顯著差異。因此，第一次統(tǒng)計模型將這些豬作為無熱應(yīng)激，時間作為固定因素，比較TN組第0天和HS組第1、3、7天的差異。為了更好的理解隨時間的變化我們所測的參數(shù)類型，將這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步作線性分析和二次方對比。設(shè)計二次統(tǒng)計模型，將第7天數(shù)據(jù)作為固定效應(yīng)，分析TN、PFTN和HS組差異（Pearce等，2013）。所有數(shù)據(jù)均以最小二乘“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，以P＜0.05表示差異顯著，P＜0.1表示有差異趨勢。

2　結(jié)果與分析

2.1熱應(yīng)激第0、1、3、7天對腸道完整性和功能標(biāo)記物的影響由圖1可知，熱應(yīng)激第7天，空腸TER線性降低（P=0.02）。相反地，7 d內(nèi)空腸LPS滲透性呈二次方增加（P=0.023）。第3天，F(xiàn)ITCLPS APP增加118%（P＜0.05），但第7天僅增加52%（P＞0.05）。由圖2可見，與TN組第0天豬相比，HS組所有觀察日（1、3、7天）血漿內(nèi)毒素均顯著升高（P＜0.05）。另外，7 d內(nèi)血漿內(nèi)毒素水平呈線性和二次方增加趨勢（P＜0.10）。由表2可見，空腸形態(tài)也明顯受長期熱應(yīng)激影響。與第0天TN組豬相比，熱應(yīng)激組第1、3、7天，絨毛高度和絨毛/隱窩均下降（線性和二次方，P＜0.05）至23%。與第0天TN組豬相比，前3天HS組隱窩深度增加，而在第7天顯著降低（P＜0.05）。

圖1　熱應(yīng)激對豬體外空腸脂多糖滲透性和跨膜電阻抗的影響

圖2　熱應(yīng)激對豬血液內(nèi)毒素水平的影響

表2　持續(xù)熱應(yīng)激對空腸絨毛形態(tài)的影響

由表3可見，熱應(yīng)激前24 h，空腸Na+/K+ATP酶活性和氧化應(yīng)激標(biāo)記物（4-HNE）水平均顯著增加（P＜0.05）。然而，抗氧化劑谷胱甘肽呈降低趨勢（P=0.062），下降到26%，到第7天呈線性降低（P=0.016）。隨著時間的推移，未見空腸細(xì)胞因子和趨化因子IL-8有顯著差異（P＞0.05）。第3、7天，空腸中性粒細(xì)胞浸潤標(biāo)記物（MPO活性）明顯增加（P＜0.01）。隨著時間推移，溶菌酶和堿性磷酸酶活性顯著降低（P＜0.05）。

由表4可知，第7天mRNA緊密連接蛋白Occludin、Claudin 3和ZO-1豐度比第0、1、3天高2～6倍。盡管無統(tǒng)計學(xué)差異，但熱應(yīng)激第1天和第3天這些緊密連接蛋白基因表達(dá)量較低。與0 d和7 d相比，第1天和第3天空腸HSP27分別增加254%和367%（P=0.041）。然而，HIF-1α表達(dá)量在熱應(yīng)激第3天達(dá)到最高值，到第7天呈二次方下降趨勢（P＜0.10）。主要緊密連接蛋白調(diào)節(jié)激酶-肌球蛋白輕鏈激酶（MLCK）的基因表達(dá)與HSP27相似（P=0.011）。

表3　熱應(yīng)激對腸道應(yīng)激、炎癥和功能標(biāo)記物的影響

表4　熱應(yīng)激誘導(dǎo)豬空腸應(yīng)激和mRNA豐度變化

2.2持續(xù)熱應(yīng)激和減少采食量對腸道完整性和功能的影響由表5可見，TN、HS和PFTN組間TER無顯著差異（P＞0.10）。然而，熱應(yīng)激使體外空腸LPS滲透性增加（240%，P=0.045）。與TN組相比，PTFN組豬LPS滲透性也增加（170%），但差異不顯著。7 d后不同處理組血漿內(nèi)毒素水平無明顯差異。但與TN組豬相比，HS組第7天結(jié)合珠蛋白升高（171%，P＜0.05），而PFTN組豬與TN組無差異（P＞0.10）。

表5　熱應(yīng)激7 d和限制采食量對豬腸道完整性和血液應(yīng)激標(biāo)記物的影響

與TN組相比，HS組第7天絨毛高度（圖3A）及絨毛高度/隱窩深度（圖3C）顯著降低（P＜0.05）；另外，HS組和PFTN組隱窩深度分別降低5%～18%（圖3B，P＜0.05）；PFTN環(huán)境不會改變豬絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度（圖3A、3C）。然而，與TN組和HS組相比，PFTN組豬隱窩深度較淺（P＜0.05，圖3B）。

圖3　熱中性環(huán)境（TN，20℃）自由采食、熱應(yīng)激環(huán)境（HS，35℃）自由采食及熱中性環(huán)境（PFTN）配對飼喂對空腸形態(tài)的影響

到第7天，與TN組和PFTN組相比，HS組脂質(zhì)過氧化物標(biāo)記物4-HNE水平升高（P＜0.05，圖4A）。與預(yù)期一樣，熱應(yīng)激導(dǎo)致4-HNE增加50%（P＜0.05）。與TN組豬相比，HS組和PFTN組豬腸道谷胱甘肽均降低，分別降低36%和61%（圖4B，P＜0.05）。腸道IL-8水平（圖4C）不受配對飼喂影響，但熱應(yīng)激導(dǎo)致其減少36%（P＜0.05）。熱應(yīng)激導(dǎo)致腸道MPO活性增加（圖4D），是衡量中性粒細(xì)胞浸潤和炎癥的指標(biāo)。然而，HS組腸道溶菌酶活性比PFTN組豬低（P＜0.05），但與TN組相比無差異（圖4E）。堿性磷酸酶活性（圖4F）不受配對飼喂的影響，但熱應(yīng)激導(dǎo)致其降低65%（P＜0.05）。試驗處理7 d后，與對照組相比，PFTN組空腸Na+/K+ATP酶活性降低（P＜0.05），并有與HS組同減弱的趨勢（分別為每毫克蛋白每小時143.77 μmol和108 μmol無機磷）（P＜0.10）。

由圖5可知，與TN組豬相比，HS組空腸緊密連接蛋白o(hù)ccludin mRNA豐度增加1～2倍（P＜0.10），ZO-1（P＜0.05）和claudin 3豐度差異顯著。然而，HS組和PFTN組claudin 3 mRNA豐度未見明顯差異（P＜0.05）。不同處理組7 d的熱休克蛋白27和HIF-1α mRNA豐度沒有差異（圖5D和5E）。與TN組豬相比，HS組和PFTN組豬第7天MLCK mRNA豐度降低（P＜0.05，圖5F），然而，HS組和PFTN組無顯著差異。

圖4　熱中性環(huán)境（TN，20℃）自由采食、熱應(yīng)激環(huán)境（HS，35℃）自由采食及熱中性環(huán)境（PFTN）配對飼喂對7 d時空腸炎癥和功能標(biāo)記物的影響

圖5　熱中性環(huán)境（TN，20℃）自由采食、熱應(yīng)激環(huán)境（HS，35℃）自由采食及熱中性環(huán)境（PFTN）配對飼喂對7 d時腸道完整性和炎癥標(biāo)記物mRNA豐度的影響

3　討論

本研究旨在確定熱應(yīng)激直接或間接（通過采食量減少介導(dǎo)）增加生長豬腸道滲透性。隨著環(huán)境熱負(fù)荷增加，內(nèi)臟血液重新分配到皮膚（通過調(diào)控外周血管擴張和胃腸道血管收縮）（Hall等，1999）。最終，腸道上皮細(xì)胞變得缺氧、酸性、ATP耗盡、經(jīng)歷氧化或亞硝化應(yīng)激，最終可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡（Yan等，2006）。這些結(jié)果會損傷腸上皮細(xì)胞，使其滲透性增加，最終導(dǎo)致內(nèi)毒素血癥、炎癥及器官損傷（Lambert，2004）。本研究表明，熱應(yīng)激引起HIF-1α mRNA豐度、4-HNE快速增加，且谷胱甘肽減少，驗證了這一結(jié)論。肉雞4-HNE增加證明其與飼料利用率降低和代謝改變有關(guān)（Bottje和Carstens，2008）。另外，HS組腸道Na+/K+ATP酶活性明顯增加，而配對飼喂無此現(xiàn)象。離子泵大量耗能，且離子主動運輸跨質(zhì)膜要消耗ATP水解釋放的能量。因此，能量消耗中額外的20%用于骨骼肌、肝臟和腸道運輸Na+/K+，10%用于運輸Ca+（Milligan和McBride，1985）。熱應(yīng)激下這些離子泵正向調(diào)節(jié)以維持腸道滲透壓平衡。如果離子平衡和滲透壓沒有被嚴(yán)格控制，可能會導(dǎo)致酶功能、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、細(xì)胞膜完整性和保水性紊亂（Street等，2010；Craig，2004）。

本試驗發(fā)現(xiàn)小腸絨毛形態(tài)發(fā)生變化；然而，熱應(yīng)激對絨毛形態(tài)的影響是可變的。40℃熱應(yīng)激降低豬空腸和十二指腸絨毛高度和隱窩深度（Yu等，2010）。同樣地，熱應(yīng)激導(dǎo)致十二指腸和空腸絨毛高度變短，隱窩深度變淺（Liu等，2009）。腸絨毛高度變短和隱窩變淺表明腸道上皮細(xì)胞受損。腸上皮細(xì)胞受損（例如上皮脫落和壞死）引起腸道滲透性增加（Lambert等，2002）。上皮細(xì)胞損傷發(fā)生在其他臟器損傷之前是由于血流量減少首先影響腸道。腸道上皮細(xì)胞損傷也可能影響營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收（Liu等，2009）。但研究表明，僅限制飼喂（類似于HS和PFTN豬）就可以引起腸道功能、運輸和形態(tài)的改變，也可能會增加細(xì)菌敗血癥形成的風(fēng)險（Ferraris和Carey，2000）。因此，熱應(yīng)激期觀察到的影響可能被大幅度降低采食量而混淆并加劇。

研究表明熱應(yīng)激可以調(diào)控腸道完整性（Dokladny等，2008；Lambert，2004）。腸道上皮由黏附分子、間隙和緊密連接蛋白組成，并形成保護(hù)屏障，有助于營養(yǎng)物質(zhì)吸收和轉(zhuǎn)運，防止?jié)撛诘挠泻Ψ肿右孜弧Ｉ掀ぜ?xì)胞還包含一個肌動蛋白骨架，它是上皮屏障的主要組成部分。通過MLCK活化調(diào)節(jié)，肌動蛋白細(xì)胞骨架收縮有助于維持細(xì)胞活力，導(dǎo)致緊密連接打開，并增加腸道通透性（Lambert，2009；Yang等，2007）。本研究數(shù)據(jù)表明熱應(yīng)激對MLCK和緊密連接基因表達(dá)豐度的影響是周期性的，因為在急性熱應(yīng)激下其迅速上調(diào)，而在第3天急劇下降。體外試驗表明，熱應(yīng)激引起ZO-1蛋白重新分配，例如擴散到胞漿（Ikari等，2005）。同樣地，ZO-1蛋白表達(dá)降低，表明緊密連接被破壞（Dokladny等，2006）。本試驗與已有研究報道一致，熱應(yīng)激可以正向調(diào)節(jié)occludin基因的表達(dá)（Dokladny等，2008），這是一種可以維持屏障功能的重要緊密連接蛋白，其表達(dá)增加可能與腸道上皮復(fù)原的保護(hù)性反應(yīng)相關(guān)。腸應(yīng)激時，急性期反應(yīng)在改善腸上皮細(xì)胞傷口愈合和恢復(fù)上有重要作用。

由于緊密連接蛋白和MLCK的改變與腸道滲透性變化和抗應(yīng)激相關(guān)，本試驗中以空腸TER作為腸道上皮過緊或滲透的指標(biāo)。已有報道指出熱應(yīng)激引起豬回腸和結(jié)腸FITC-葡聚糖（4kDa）大分子滲透性增加（Pearce等，2012）。與體外試驗（Dokladny等，2006）和體內(nèi)小鼠試驗（Prosser等，2004）研究報道一致的是隨著熱應(yīng)激時間推移，腸道TER減少。LPS APP和血液內(nèi)毒素增加這一數(shù)據(jù)也驗證了熱應(yīng)激豬TER呈線性降低。APP增加是對FITC-LPS腸道通透性定量測定，是滲漏的另一個評估指標(biāo)。雖然我們懷疑細(xì)胞旁路轉(zhuǎn)運，但LPS可通過主動、被動、跨細(xì)胞或受體介導(dǎo)的過程進(jìn)入腸上皮細(xì)胞（Mani等，2013）。

由于PFTN組和HS組變化相似，因此熱應(yīng)激對腸道完整性的影響似乎是由采食量降低直接介導(dǎo)的。因此，由熱應(yīng)激引起許多生物效應(yīng)（Leon，2007；Lambert，2004；Hall等，2001）可能是由環(huán)境引起的過高熱造成的間接影響（采食量降低介導(dǎo)）。高水平血液內(nèi)毒素有可能導(dǎo)致炎癥形成，并降低生長潛力。本研究中，熱應(yīng)激動物血清內(nèi)毒素和急性蛋白、結(jié)合珠蛋白有升高趨勢。血清內(nèi)毒素數(shù)據(jù)與熱應(yīng)激下小鼠（Lim等，2007；Hall等，2001）、雞（Cronje，2007）研究數(shù)據(jù)一致。這表明腸道滲透性增加，內(nèi)毒素解毒、中和和清除功能降低。熱應(yīng)激導(dǎo)致腸道堿性磷酸酶和溶菌酶活性降低。這歸結(jié)于熱應(yīng)激期間炎癥和LPS反應(yīng)的增加。受損黏膜堿性磷酸酶和溶菌酶活性可能會使細(xì)菌和病原菌黏膜通道增加，降低對LPS誘發(fā)炎癥的保護(hù)作用（Mani等，2013；Lackeyram和Yang，2010）。雖然試驗未發(fā)現(xiàn)腸道細(xì)胞因子增加，但MPO活性顯著增加。這兩個標(biāo)記物都是常用于評估腸道炎癥和中性粒細(xì)胞浸潤的指標(biāo)（Suzuki等，1983）。

已有報道指出，與TN和PFTN豬相比，整個熱應(yīng)激豬直腸溫度（1.5℃）和呼吸速率（2倍）有明顯的和持續(xù)的增加。另外，與TN組豬相比，熱應(yīng)激豬從第1天開始采食量較少，整個試驗期內(nèi)持續(xù)減少超過46%。通過設(shè)計，PFTN豬采食量與HS組豬相同。整個試驗期TN組豬日增重為1.14 kg/d，而HS組豬在第1天在初始體重基礎(chǔ)上損失2.7 kg，但是與初始重相比，3、7 d累積增重分別為0.03 kg和1.65 kg。PTFN組豬試驗期內(nèi)損失2.47 kg體重。這些表征變化可能與腸道完整性降低和內(nèi)毒素滲透性增加相關(guān)。

總之，長期熱應(yīng)激可導(dǎo)致腸道完整性破壞，功能和代謝紊亂。這可能部分歸結(jié)于營養(yǎng)攝入減少，如PFTN組豬，由于采食量減少，引起食糜流速和蠕動發(fā)生潛在變化。總之，本試驗結(jié)果有助于解釋熱應(yīng)激是如何直接或間接（通過減少采食量）影響腸道生理、吸收代謝和動物生長性能參數(shù)的（Pearce等，2013）。

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1004-3314（2016）03-0036-08

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20160309