鄒素蘭，胡 楠（常州市第一人民醫(yī)院藥劑科，江蘇常州 213003）

糖尿病狀態(tài)下Caco-2細(xì)胞CYP3A4和P-gp功能的變化及其機制研究Δ

鄒素蘭＊，胡 楠（常州市第一人民醫(yī)院藥劑科，江蘇常州 213003）

目的：考察糖尿病狀態(tài)下Caco-2細(xì)胞色素P450（CYP）3A4和P糖蛋白（P-gp）功能的變化及其機制。方法：分別在Caco-2細(xì)胞中加入25、50、100 μmol/L咪達唑侖（CYP3A4探針底物）溫孵15、30、60、120、180 min，加入0.1、0.2、0.4 μg/ml羅丹明123（P-gp底物）溫孵15、30、60、90、120 min，以確定底物濃度及溫孵時間；在Caco-2細(xì)胞中加入不同濃度胰島素、葡萄糖和脂肪酸（軟脂酸和油酸）后測定咪達唑侖的代謝產(chǎn)物1′-OH咪達唑侖的生成量和羅丹明123的攝取量，以考察對細(xì)胞CYP3A4和P-gp功能的影響。結(jié)果：底物濃度分別為咪達唑侖50 μmol/L、羅丹明123 0.1 μg/ml，均溫孵2 h。隨著胰島素、葡萄糖、軟脂酸濃度的升高，1′-OH咪達唑侖的生成量降低，CYP3A4活性降低；羅丹明123的攝取增加，P-gp外排功能降低。油酸對1′-OH咪達唑侖的生成量和羅丹明123的攝取量沒有顯著影響。結(jié)論：糖尿病狀態(tài)下，胰島素、葡萄糖和軟脂酸水平的升高均可降低CYP3A4和P-gp的功能，但油酸對CYP3A4和P-gp的功能影響不大。

糖尿??；Caco-2細(xì)胞；CYP3A4；P糖蛋白；胰島素；葡萄糖；脂肪酸；體外試驗

1 材料

1.1 儀器

Synergy2熒光酶標(biāo)儀（美國Bio-tek公司）；VCX130超聲破碎儀（美國SONICS公司）；LC-10ADVP高效液相色譜（HPLC）儀，包括SCL-10A系統(tǒng)控制器、SIL-10ADVP自動進樣器、LC-10AT泵、CTO-10A柱溫箱、RF-10A XL熒光檢測器（日本島津公司）；HW-2000色譜工作站2.12版（南京千譜軟件有限公司）；LC-20AD HPLC系統(tǒng)、2020 HPLC-質(zhì)譜（MS）聯(lián)用系統(tǒng)（日本島津公司）。

1.2 藥品與試劑

咪達唑侖（MDZ）對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：171250-200401，純度：99.0%）；1′-OH咪達唑侖（1′-OH MDZ）對照品（美國Sigma公司，貨號：UC430，純度：98.0%）；地西泮對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：171225-200903，純度：99.9%）；精蛋白鋅胰島素注射液（江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司，批號：1108231，規(guī)格：400 u∶10 ml）；軟脂酸（貨號：P5585，純度：≥99%）、油酸（貨號：S4751，純度：≥98.5%）、羅丹明123（Rho123，貨號：83702，純度：≥85%）均購于美國Sigma公司；高糖DMEM培養(yǎng)基、低糖DMEM培養(yǎng)基（美國Hyclone公司）；胎牛血清、非必需氨基酸、胰蛋白酶消化液（美國Gibco公司）；無脂肪酸牛血清白蛋白（BSA，上海前塵生物科技有限公司，貨號：219989905，純度：98%）；考馬斯亮藍G-250（美國Amersco公司）；D-葡萄糖（南京化學(xué)試劑一廠，貨號：G0020-500，純度：＞99.8%）；水為超純水；甲醇、乙腈為色譜純（美國Merck公司）；其他試劑均為分析純。

1.3 細(xì)胞

Caco-2細(xì)胞購于上海中科院細(xì)胞庫。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將Caco-2細(xì)胞消化后，分散于T-75培養(yǎng)瓶中，用高糖DMEM培養(yǎng)基于37 ℃、含5%CO（2相對濕度90%）的環(huán)境中培養(yǎng)，2～3 d更換1次培養(yǎng)基，促使細(xì)胞融合。

2.2 底物濃度及溫孵時間考察

2.2.1 底物MDZ的濃度及溫孵時間考察 MDZ是CYP3A4的探針底物，通過測定MDZ在Caco-2細(xì)胞上的代謝物1′-OH MDZ的生成可評價CYP3A4的功能。取24孔細(xì)胞培養(yǎng)板上處于對數(shù)生長期的Caco-2細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞生長融合成單層膜時，每孔細(xì)胞用1 ml 37 ℃Hanks平衡鹽溶液（HBSS液）預(yù)溫孵15 min，以平衡體系并除去細(xì)胞表面雜質(zhì)；吸去HBSS液后，每孔中加入含50 μmol/L MDZ的HBSS液1 ml，在37 ℃下分別溫孵15、30、60、120、180 min。另取上述細(xì)胞每孔分別加入含MDZ 25、50、100 μmol/L的HBSS溶液1 ml，37 ℃溫孵120 min。吸出HBSS溫孵液，采用HPLC-MS法測定1′-OH MDZ含量。每孔加入1 ml超純水，破碎細(xì)胞后測定細(xì)胞蛋白含量。

2.2.2 底物Rho123的濃度及溫孵時間考察 Rho123是P-gp的底物，通過Rho123在Caco-2細(xì)胞上的穩(wěn)態(tài)攝取可評價P-gp的功能。將細(xì)胞接種于24孔板，待細(xì)胞貼壁完全并融合成單層膜時，每孔細(xì)胞用1 ml 37 ℃HBSS液預(yù)溫孵15 min，以平衡體系并除去細(xì)胞表面雜質(zhì)；吸去HBSS液后，每孔中加入含0.1 μg/ml Rho123的HBSS液1 ml，在37 ℃下分別溫孵15、30、60、90、120 min。另取上述細(xì)胞每孔分別加入含Rho123的0.1、0.2、0.4 μg/ml的HBSS溶液1 ml，37 ℃溫孵120 min。吸去HBSS溫孵液，將細(xì)胞培養(yǎng)板移至冰板上，用4 ℃空白HBSS溶液清洗細(xì)胞3次后，每孔加入0.4 ml超純水，破碎細(xì)胞后測定細(xì)胞蛋白含量；再取出200 μl，采用HPLC法測定Rho123的濃度。細(xì)胞內(nèi)藥物攝取量（ng/μg）=測得藥物濃度/細(xì)胞懸液的蛋白濃度。

2.2.3 考馬斯亮藍測定Caco-2細(xì)胞中蛋白含量 取“2.2.1”和“2.2.2”項下細(xì)胞反復(fù)凍融3次，超聲破碎（功率：200 W）15 s后，每孔吸取30 μl細(xì)胞懸液，另取濃度為50、100、200、400 μg/ml的BSA標(biāo)準(zhǔn)品各30 μl，分別與1.5 ml新制的考馬斯亮藍應(yīng)用液振蕩混勻，置于搖床中振搖溫孵10 min。吸取200μl至96孔板中，用酶標(biāo)儀在595 nm波長處測定溶液的吸光度值。以30 μl超純水加入1.5 ml新制的考馬斯亮藍應(yīng)用液作為空白對照。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算細(xì)胞樣品的蛋白含量。

2.3 胰島素、葡萄糖和脂肪酸對Caco-2細(xì)胞CYP3A4和P-gp功能的影響考察

2.3.1 胰島素對Caco-2細(xì)胞CYP3A4和P-gp功能的影響 將Caco-2細(xì)胞傳代于24孔板中，待細(xì)胞長滿至80%左右時將其分為4組，用正常培養(yǎng)基（含5.2 mu/L胰島素）為對照組，其他3組培養(yǎng)基中分別加入含不同濃度胰島素（25、50、100 mu/L）的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后，測定1′-OH MDZ含量和Rho123的攝取量。

2.3.2 葡萄糖對Caco-2細(xì)胞CYP3A4和P-gp功能的影響 將Caco-2細(xì)胞傳代于24孔板中，待細(xì)胞長滿至80%左右時將其分為3組，分別用含不同濃度葡萄糖（5.5、25、68 mmol/L）的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后（5.5 mol/L作為對照組），測定1′-HO MDZ含量和Rho123的攝取量。

2.3.3 脂肪酸對Caco-2細(xì)胞CYP3A4和P-gp功能的影響 將Caco-2細(xì)胞傳代于24孔板中，待細(xì)胞長滿至80%左右時將其分為6組，其中2組作為對照組，其他4組分別加入含不同濃度的軟脂酸（100、200 μmol/L）、油酸（100、200 μmol/L）的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后，測定1′-HO MDZ含量和Rho123的攝取量。

2.3.4 細(xì)胞損傷試驗 將Caco-2細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞長滿至80%時，吸出每個培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)基，分別加入HBSS液200 μl，于37 ℃溫孵15 min后吸去空白HBSS液；向每孔中加入“2.3.1”～“2.3.3”項下含不同濃度胰島素、葡萄糖、脂肪酸的HBSS液200 μl，37 ℃溫孵48 h后吸去藥液；每孔加入含MTT的培養(yǎng)基200 μl，37 ℃繼續(xù)溫孵4 h；洗去MTT溶液，加入200 μl二甲基亞砜（DMSO）溫孵10 min。設(shè)定參比波長為690 nm，采用酶聯(lián)免疫檢測儀在490 nm波長處測定各孔吸光度，若給藥組的吸光度值與空白對照組無顯著性差異時，即認(rèn)為所用試劑及其濃度對細(xì)胞沒有損傷。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 MDZ濃度及溫孵時間考察結(jié)果

MDZ的代謝物1′-OH MDZ在Caco-2細(xì)胞中的生成具有時間依賴性和濃度依賴性，詳見圖1。

圖1 不同濃度MDZ溫孵Caco-2細(xì)胞不同時間后1′-OH MDZ生成量結(jié)果Fig 1 Productions of 1′-OH MDZ after Caco-2 cells were incubated with MDZ at different concentrations for different time

代謝物1′-OH MDZ的生成在15～180 min之間呈線性增長，且隨著MDZ濃度的增加而增加，說明本研究所用的Caco-2細(xì)胞以及所用試驗設(shè)計可用于檢測CYP3A4酶的活性。綜合MDZ在Caco-2細(xì)胞上代謝的時間及濃度依賴性試驗結(jié)果，在考察胰島素、葡萄糖、脂肪酸對CYP3A4功能影響的研究中，均選擇50μmol/L的MDZ作為底物濃度，孵育時間為2 h。

3.2 Rho123濃度及溫孵時間考察結(jié)果

結(jié)果顯示，隨著Rho123質(zhì)量濃度的增加，其在細(xì)胞中的攝取量均增加顯著，并且在試驗濃度范圍內(nèi)Caco-2細(xì)胞對Rho123的攝取近似呈線性關(guān)系，詳見圖2。

圖2 不同質(zhì)量濃度Rho123溫孵Caco-2細(xì)胞不同時間后Rho123的攝取量結(jié)果Fig 2 Results of intakes of Rho123 after Caco-2 cells were incubated with Rho123 at different concentrations for different time

綜合Rho123在Caco-2細(xì)胞上攝取的時間及濃度依賴性試驗結(jié)果，在考察胰島素、葡萄糖、脂肪酸對P-gp功能影響的研究中均選擇0.1μg/ml的Rho123作為底物濃度，孵育時間為2 h。

3.3 胰島素對Caco-2細(xì)胞CYP3A4和P-gp功能的影響

隨著培養(yǎng)基中胰島素濃度的升高，Caco-2細(xì)胞1′-OH MDZ的生成量逐漸降低，即Caco-2細(xì)胞CYP3A4的活性降低。與對照組比較，50、100 mu/L的胰島素培養(yǎng)的Caco-2細(xì)胞1′-OH MDZ的生成量顯著下降（P＜0.05），分別降低了21%、27%，詳見圖3A（圖中設(shè)對照組為100%，其他組均為對照組的相對值，下同）。相反，隨著培養(yǎng)基中胰島素濃度的升高，Caco-2細(xì)胞對Rho123的攝取量逐漸增加，表明細(xì)胞P-gp的外排功能降低。與對照組比較，25、50、100 mu/L的胰島素培養(yǎng)的Caco-2細(xì)胞對Rho123的攝取量顯著增加（P＜0.05或P＜0.01），分別增加了18%、29%、40%，詳見圖3B。

圖3 不同濃度胰島素培養(yǎng)Caco-2細(xì)胞后1′-OH MDZ生成量和Rho123攝取量結(jié)果Fig 3 Productions of 1′-OH MDZ and intakes of Rho123 after Caco-2 cells were cultured by insulin at different concentrations

3.4 葡萄糖對Caco-2細(xì)胞CYP3A4和P-gp功能的影響

隨著培養(yǎng)基中葡萄糖濃度的增加，Caco-2細(xì)胞1′-OH MDZ的生成量逐漸降低。與對照組比較，25 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)的Caco-2細(xì)胞CYP3A4的酶活性有下降趨勢，但沒有顯著性差異，而68 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)的Caco-2細(xì)胞1′-OH MDZ生成量則顯著降低了25%（P＜0.05），詳見圖4A。相反，隨著培養(yǎng)基中葡萄糖濃度的增加，Caco-2細(xì)胞對Rho123的攝取量逐漸增加。與對照組比較，68 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)的Caco-2細(xì)胞對Rho123的攝取量顯著增加（P＜0.05），表明細(xì)胞P-gp的功能隨著葡萄糖濃度的增加而降低，詳見圖4B。

圖4 不同濃度葡萄糖培養(yǎng)Caco-2細(xì)胞后1′-OH MDZ生成量和Rho123攝取量結(jié)果Fig 4 Productions of 1′-OH MDZ and intakes of Rho123 after Caco-2 cells were cultured by glucose at different concentrations

3.5 脂肪酸對Caco-2細(xì)胞CYP3A4和P-gp功能的影響

軟脂酸可降低Caco-2細(xì)胞1'-OH MDZ的生成。與對照組比較，100、200 μmol/L的軟脂酸分別使Caco-2細(xì)胞1′-OH MDZ生成量降低了20%、34%（P＜0.05），詳見圖5A。相反，100、200 μmol/L的軟脂酸可增加Caco-2細(xì)胞對Rho123的攝取，且隨濃度升高攝取量逐漸增加。與對照組比較，分別增加了57%、144%（P＜0.01），詳見圖5C。而另外一種不飽和脂肪酸油酸對CYP3A4和P-gp的功能則沒有顯著影響，詳見圖5B、圖5D。

圖5 不同濃度軟脂酸和油酸培養(yǎng)Caco-2細(xì)胞后1′-OH MDZ生成量和Rho123攝取量結(jié)果Fig 5 Productions of 1′-OH MDZ and intakes of Rho123 after Caco-2 cells were cultured by palmitic acid and oleic acid at different concentrations

3.6 細(xì)胞損傷試驗結(jié)果

研究結(jié)果表明，各組吸光度與空白對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，表明本研究中Caco-2細(xì)胞孵育48 h所用的各濃度的胰島素、葡萄糖、脂肪酸均未對細(xì)胞造成損傷。

4 討論

本研究結(jié)果顯示，高濃度的胰島素、葡萄糖和軟脂酸均可降低CYP3A4和P-gp的功能，而油酸對CYP3A4和P-gp的功能均未見有影響。CYP3A4和P-gp均受孕甾烷X受體調(diào)控，某些影響因素對腸CYP3A4和P-gp功能的調(diào)節(jié)方向一致。例如很多藥物是CYP3A4和P-gp的共同誘導(dǎo)劑或共同抑制劑，在一些病理狀態(tài)下，如糖尿病、慢性腎衰的大鼠腸細(xì)胞CYP3A4 和P-gp的變化也是一致的［3，11-12］。

飽和與不飽和脂肪酸對腸道CYP3A4和P-gp的調(diào)節(jié)作用并不相同，飽和脂肪酸軟脂酸可下調(diào)腸細(xì)胞上CYP3A4和P-gp的功能，而不飽和脂肪酸油酸則無影響，提示這兩種脂肪酸對腸道CYP3A4和P-gp的調(diào)控途徑與作用機制可能不同。筆者前期研究了脂肪酸對肝細(xì)胞CYP3A4的影響，發(fā)現(xiàn)飽和與不飽和脂肪酸均誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞CYP3A4的酶活性［13］，這提示脂肪酸對肝細(xì)胞和腸細(xì)胞CYP3A4酶的調(diào)節(jié)也并不相同。

鏈脲菌素誘導(dǎo)的Ⅰ型糖尿病大鼠和小鼠與正常組比較，血中胰島素含量降低，血糖和脂肪酸含量升高，其腸道CYP3A 和P-gp的功能和蛋白表達水平均低于正常組［2-3，5］。谷氨酸鈉誘導(dǎo)的Ⅱ型糖尿病肥胖模型小鼠具有高血糖、高胰島素血癥以及血脂異常等癥狀，然而這種模型小鼠的十二指腸和空腸細(xì)胞的P-gp表達與正常小鼠比較顯著增加［14］。無論Ⅰ型還是Ⅱ型糖尿病，血糖和血脂水平均顯著升高，然而不同類型糖尿病以及糖尿病不同的病理過程中胰島素水平的變化則有所區(qū)別。僅通過本研究中的體外研究結(jié)果并不能完全解釋不同類型糖尿病狀態(tài)下腸道CYP3A4和P-gp的變化差異。胰島素、葡萄糖和脂肪酸只是糖尿病病理狀態(tài)下異常指標(biāo)中的一小部分［15］，其他生理生化指標(biāo)、激素及轉(zhuǎn)錄因子水平等也有可能導(dǎo)致腸細(xì)胞CYP3A4和P-gp的改變，需要進一步研究探索。且體外試驗難以完全模擬體內(nèi)代謝過程，因此該結(jié)論需要進一步研究證實。

本研究對糖尿病狀態(tài)下腸道CYP3A4和P-gp變化機制進行了初步探索，發(fā)現(xiàn)胰島素、葡萄糖以及脂肪酸濃度的異常變化可影響腸道CYP3A4和P-gp的功能改變。本試驗為進一步深入探索糖尿病狀態(tài)下腸道CYP3A4和P-gp變化機制提供了一定的基礎(chǔ)。

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（編輯：劉明偉）

Study on the Function Change of Caco-2 Cell CYP3A4 and P-gp under Diabetic Conditions and Its Mechanism

ZOU Sulan，HU Nan（Department of Pharmacy，the First People’s Hospital of Changzhou，Jiangsu Changzhou 213003，China）

OBJECTIVE：To investigate the function change of intestinal CYP3A4 and P-glycoprotein（P-gp）under diabetic conditions and its mechanism.METHODS：Caco-2 cells were respectively added with 25，50 and 100 μmol/L midazolam （CYP3A4 probe substrate）for incubation for 15，30，60，120，180 min；with 0.1，0.2，0.4 μg/ml rhodamine 123（P-gp substrate）for incubation for 15，30，60，90，120 min to determine the substrate concentrations and incubation time.Caco-2 cells were added with insulin，glucose and fatty acid（palmitic acid and oleic acid）at different concentrations，and then the production of 1′-OH-midazolam，the metabolite of midazolam，and the intake of rhodamine 123 were determined，in order to investigated the effect on the function of CYP3A4 and P-gp.RESULTS：The optimal substrate concentrations and incubation time were as follows as 50 μmol/L midazolam，0.1 μg/ml rhodamine 123 and incubation for 2 h.With the increase in the concentration of insulin，glucose and palmitic acid，the production of 1′-OH-midazolam and the activity of CYP3A4 reduced；the intake of rhodamine 123 increased，and the efflux transport function of P-gp decreased.Oleic acid had no significant effect on the production of 1′-OH-midazolam or the intake of rhodamine 123.CONCLUSIONS：Under diabetes condition，the increase of insulin，glucose and palmitic acid may reduce the function of CYP3A4 and P-gp，while oleic acid has no effect on the function.

Diabetes；Caco-2 cells；CYP3A4；P-glycoprotein；Insulin；Glucose；Fatty acid；in vitro test

R969

A

1001-0408（2016）25-3471-04

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.25.05

國家自然科學(xué)基金資助項目（No.81503136）；常州市高層次衛(wèi)生人才培養(yǎng)工程（No.2016CZBJ010）過體外試驗考察胰島素、葡萄糖、脂肪酸對Caco-2細(xì)胞CYP3A4和P-gp功能的影響，并對糖尿病狀態(tài)下腸道CYP3A4 和P-gp的變化機制進行初步研究。

2015-11-09

2016-07-18）

＊主任藥師。研究方向：臨床藥學(xué)。電話：0519-68870870。E-mail：zsl661104@163.com

腸細(xì)胞中細(xì)胞色素P450（CYP）3A4介導(dǎo)的生物轉(zhuǎn)化和腸道P糖蛋白（P-gp）介導(dǎo)的藥物主動泵出是決定口服藥物生物利用度的主要因素［1］。多項研究表明糖尿病可影響腸道CYP3A4 和P-gp的功能與表達［2-7］，但其作用機制迄今尚未闡明。一般來說，糖尿病狀態(tài)下體內(nèi)胰島素、葡萄糖、脂肪酸代謝與分泌會發(fā)生紊亂，進而對代謝酶和轉(zhuǎn)運體——如大鼠原代肝細(xì)胞上的CYP2E1的mRNA表達［8］、豬冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞上CYP2C9的酶活性和蛋白表達［9］、HepG2細(xì)胞上的轉(zhuǎn)運體ABCA1蛋白的表達［10］產(chǎn)生影響，但關(guān)于胰島素、葡萄糖和脂肪酸對腸CYP3A4和P-gp的影響目前鮮有報道。Caco-2細(xì)胞來源于人結(jié)腸腺癌細(xì)胞，結(jié)構(gòu)和功能類似于分化的小腸上皮細(xì)胞，常用于藥物在腸細(xì)胞上的吸收和轉(zhuǎn)運研究。因此，本研究通