張　潔, 林文武, 宛柏杰, 余小芳, 吳祖建

(1.福建農(nóng)林大學(xué)植物病毒研究所/福建省植物病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002；2.拜耳作物科學(xué)(中國(guó))有限公司，浙江 杭州 310018)

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福州番茄黃化曲葉病毒的全基因組結(jié)構(gòu)特征

張潔1, 林文武1, 宛柏杰1, 余小芳2, 吳祖建1

(1.福建農(nóng)林大學(xué)植物病毒研究所/福建省植物病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002；2.拜耳作物科學(xué)(中國(guó))有限公司，浙江 杭州 310018)

為明確引起福建省福州市長(zhǎng)樂(lè)地區(qū)番茄上曲葉癥狀的病原，提取樣品總DNA，利用簡(jiǎn)并引物PA/PB進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從10個(gè)樣品中均可擴(kuò)增到500 bp左右的特異條帶.NCBI BLAST序列比對(duì)表明，該序列與番茄黃化曲葉病毒(TYLCV)核苷酸序列相似性最高，達(dá)99.0%.再根據(jù)已知500 bp序列設(shè)計(jì)1對(duì)反向引物，擴(kuò)增TYLCV分離物Fz01全基因組近全長(zhǎng)，克隆并測(cè)序.經(jīng)序列拼接發(fā)現(xiàn)，TYLCV分離物Fz01基因組全長(zhǎng)2781 nts(KP685598)，與已報(bào)道的TYLCV其他各分離物相似性均在89.3%以上，而與來(lái)自中國(guó)不同地區(qū)的TYLCV分離物的相似性均在98.7%以上.因此，F(xiàn)z01屬于TYLCV的一個(gè)分離物.

福州; 番茄黃化曲葉病毒; 全基因組; 序列分析

番茄黃化曲葉病毒病主要由番茄黃化曲葉病毒(Tomatoyellowleafcurlvirus, TYLCV)侵染所致.2006年首次報(bào)道TYLCV入侵我國(guó)[1]，目前該病毒已經(jīng)在我國(guó)20多個(gè)省(市)發(fā)生，并造成嚴(yán)重?fù)p失.番茄感病后植株矮化，頂部葉片發(fā)黃、變小，葉片邊緣上卷、皺縮等，果實(shí)的產(chǎn)量和商品價(jià)值降低[2-3].

TYLCV屬于雙生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花葉病毒屬(Begomovirus).根據(jù)基因組結(jié)構(gòu)的不同，TYLCV可以分為雙組份(DNA-A和DNA-B)和單組份(DNA-A)2種類型，大多數(shù)單組份雙生病毒還伴隨有衛(wèi)星DNA(satellite DNA)，稱為DNA β[4].目前，國(guó)內(nèi)外發(fā)現(xiàn)的TYLCV大部分為DNA-A單組份病毒，基因組大小為2.7～2.8 kb[1-3].

福建省位于中國(guó)東南沿海，屬于高溫多雨的季風(fēng)亞熱帶氣候，植物種類豐富，植物病毒也多樣化，僅福建省植物病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)并鑒定的雙生病毒就達(dá)14種之多.2014年秋季，福州市長(zhǎng)樂(lè)地區(qū)的番茄植株表現(xiàn)嚴(yán)重的曲葉癥狀，疑似感染了TYLCV.因此，本文對(duì)此番茄病樣的病原進(jìn)行分子鑒定，并測(cè)定病毒分離物Fz01全長(zhǎng)序列，分析其序列同源性及結(jié)構(gòu)特征，以期為該病毒的防治提供依據(jù).

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1病樣來(lái)源2014年11月采集福建省福州市長(zhǎng)樂(lè)地區(qū)的番茄樣本，病株均表現(xiàn)為曲葉、葉緣黃化的癥狀.

1.1.2菌株和載體大腸桿菌菌株DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存，克隆載體pMD18-T購(gòu)自TaKaRa公司.

1.1.3試劑DNA凝膠純化試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司，TransStart Fast Pfu DNA Polymerase購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純.

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1植物總DNA的提取利用CTAB法[5]提取各樣本番茄葉片總DNA.

1.2.2PCR擴(kuò)增、克隆和測(cè)序(1)DNA-A的擴(kuò)增.利用菜豆金色花葉病毒屬病毒DNA-A保守序列設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物PA/PB[6]對(duì)樣品DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)DNA凝膠純化試劑盒純化，與載體pMD18-T連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選陽(yáng)性克隆，送交上海博尚生物技術(shù)有限公司測(cè)序.再根據(jù)測(cè)得的序列設(shè)計(jì)1對(duì)反向引物TY-Full-F(5′-GACACTTATCTAACGTTTGAGGATG-3′)/TY-Full-R(5′-CACAAACAAGCGACGATCATG-3′)，擴(kuò)增病毒DNA-A的近全長(zhǎng)序列，克隆并測(cè)序.

(2)DNA-B和DNA β的擴(kuò)增.利用DNA-B和DNA β的通用引物[7-9]對(duì)樣品DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增.

1.2.3序列分析利用DNAStar分析軟件(DNAStar Inc., Madison, WI, USA)中的MegAlign程序及Clustal W方法比較序列相似性.通過(guò)NCBI BLAST查找序列相似性.系統(tǒng)關(guān)系樹的構(gòu)建采用Mrbaye軟件的貝葉斯法.

2　結(jié)果與分析

2.1樣品的PCR檢測(cè)及TYLCV Fz01 DNA-A基因組結(jié)構(gòu)特征

利用簡(jiǎn)并引物PA和PB，對(duì)10個(gè)表現(xiàn)曲葉癥狀的番茄樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均得到約500 bp的特異性條帶(圖1A).測(cè)序結(jié)果表明，10個(gè)病樣的序列相似性均在98.2%以上；NCBI BLAST顯示，與TYLCV很多分離物的相應(yīng)序列高度同源，達(dá)99.0%.PCR擴(kuò)增樣品Fz01近全長(zhǎng)序列，可以得到1條約2.4 kb的特異性條帶(圖1B).克隆、測(cè)序并拼接全長(zhǎng)序列，命名為TYLCV Fz01.序列分析發(fā)現(xiàn)，TYLCV Fz01 DNA-A全長(zhǎng)2781 nts(GenBank登錄號(hào)為KP685598)，其DNA-A基因組結(jié)構(gòu)具有典型的雙生病毒特性，共編碼6個(gè)開(kāi)放閱讀框(open frame reading, ORFs)：病毒鏈編碼2個(gè)ORFs，分別為AV1(308～1084 nt)和AV2(148～498 nt)，互補(bǔ)鏈編碼4個(gè)ORFs，分別為AC1(1542～2615 nt)、AC2(1226～1633 nt)、AC3(1081～1485 nt)和AC4(2171～2464 nt).AC4與AV2之間的基因間隔區(qū)(intergenic region,IR)內(nèi)含有病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄必需的各種元件，包括一條含有9個(gè)核苷酸TAATATT/AC(2～2775 nt)的莖環(huán)結(jié)構(gòu).利用通用引物對(duì)樣品進(jìn)行DNA-B和DNA β的PCR擴(kuò)增，但均未檢測(cè)到任何特異性條帶.

A.10個(gè)番茄樣本中TYLCV DNA-A 500 bp部分片段的PCR檢測(cè);B.TYLCV Fz01近全長(zhǎng)序列的PCR擴(kuò)增.M.分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；CK.陰性對(duì)照.

2.2TYLCV Fz01 DNA-A與其他雙生病毒的同源性比較

選取全國(guó)不同地區(qū)具有代表性的分離物以及國(guó)外相似性較近的一些TYLCV分離物構(gòu)建系統(tǒng)關(guān)系樹，以TYLCV伊朗(Iran)和蘇丹(Sudan)分離物為外群.結(jié)果表明，TYLCV Fz01與我國(guó)新疆、上海、北京、廣東、河北等地區(qū)的TYLCV聚類為一個(gè)大分支(圖2)，連同澳大利亞(Australia)、墨西哥(Mexico)、美國(guó)(USA)、哥斯達(dá)黎加(Costa Rica)等國(guó)家的一些分離物屬于番茄黃化曲葉病毒以色列株系(TYLCV-IL).序列相似性比對(duì)發(fā)現(xiàn)，TYLCV Fz01與以上TYLCV分離物的相似性都在89.3%以上(表1).IR是基因組中變異最大的區(qū)域，TYLCV Fz01的IR序列長(zhǎng)度為313 nts，與伊朗和蘇丹分離物IR序列相似性僅為84.5%和70.6%，而與其他以色列株系的分離物相似性都在94.9%以上(表1).氨基酸相似性比對(duì)發(fā)現(xiàn)，TYLCV Fz01的AV1、AV2和AC4序列高度保守，與TYLCV其他分離物的氨基酸序列相似性均高達(dá)100.0%(表1).以上結(jié)果充分說(shuō)明TYLCV保守性極高，并未因地理來(lái)源的不同產(chǎn)生較大變異.

圖2　基于TYLCV Fz01 DNA-A與18個(gè)TYLCV其他分離物DNA-A全長(zhǎng)基因組核苷酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)關(guān)系樹

3　討論

本研究對(duì)福建省福州市長(zhǎng)樂(lè)地區(qū)的番茄病樣進(jìn)行了分子生物學(xué)檢測(cè)，并進(jìn)一步獲得TYLCV Fz01的全基因組序列，該序列與國(guó)內(nèi)外已報(bào)道的TYLCV各分離物相似性均在89.0%以上，而與我國(guó)其他地區(qū)及美國(guó)等國(guó)家的TYLCV-IL株系分離物的相似性均在98.0%以上.根據(jù)國(guó)際上雙生病毒分類原則[10]，確定侵染福州長(zhǎng)樂(lè)地區(qū)番茄植株的病原為TYLCV的一個(gè)分離物.

本試驗(yàn)利用DNA-B和betasatellite的通用引物對(duì)樣品DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，未檢測(cè)到任何特異性條帶，說(shuō)明福州地區(qū)的TYLCV是單組份病毒，這與國(guó)內(nèi)外的報(bào)道相一致.Zhang et al[11]研究發(fā)現(xiàn)，中國(guó)番茄黃化曲葉病毒伴隨的衛(wèi)星分子(DNA β)可促進(jìn)TYLCV在番茄及煙草中復(fù)制，產(chǎn)生更加嚴(yán)重的癥狀.關(guān)于TYLCV是否會(huì)與其他雙生病毒/衛(wèi)星分子復(fù)合侵染產(chǎn)生更嚴(yán)重的危害，還需要進(jìn)一步檢測(cè).

表1　TYLCV Fz01與18個(gè)TYLCV其他分離物DNA-A、IR及其各ORFs的序列相似性比較Table 1　Comparison of nucleotide and amino acid sequence identities of complete DNA-A, IR and ORF between Fz01 DNA-A and other 18 TYLCV isolates　%

致謝：特別感謝福建農(nóng)林大學(xué)植物病毒研究所的高芳鑾博士給予序列分析方面的指導(dǎo).

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(責(zé)任編輯:楊郁霞)

Molecular characterization ofTomatoyellowleafcurlvirusin Fuzhou

ZHANG Jie1, LIN Wenwu1, WAN Baijie1, YU Xiaofang2, WU Zujian1

(1.Key Laboratory of Plant Virology of Fujian Province/Institute of Plant Virology, Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou, Fujian 350002, China; 2.Bayer CropScience (China) Co., Ltd., Hangzhou, Zhejiang 310018, China)

To identify pathogens that caused tomato leaf curl symptoms in Changle area of Fuzhou, Fujian Province, total DNA was extracted from 10 infected samples. By using degenerate primers PA/PB, 500 bp fragments were obtained from all samples. Sequence analysis showed nucleotide sequences of all fragments showed the highest identity (99.0%) with that ofTomatoyellowleafcurlvirus(TYLCV). To get the complete nucleotide sequence of virus isolate Fz01, a pair of reverse primers was designed according to known genome sequence. Results showed that isolate Fz01 comprised of 2781 nucleotides, reaching 89.3% identity with other isolates of TYLCV from GenBank, and more than 98.7% identity with other isolates of TYLCV from China. Therefore， the virus that infected tomato in Fuzhou was an isolate of TYLCV.

Fuzhou;Tomatoyellowleafcurlvirus; complete genome; sequence analysis

2015-11-11

2015-12-16

國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(31301640、31301642)；福建省教育廳科技項(xiàng)目(JA13103)；福建農(nóng)林大學(xué)博士后項(xiàng)目(132300117).

張潔(1983-)，女，講師，博士.研究方向：植物病毒學(xué).Email:jiezhang3553@163.com.通訊作者吳祖建(1967-)，男，研究員，博士.研究方向：植物病毒學(xué).Email:wuzujian@126.com.

S432.1

A

1671-5470(2016)05-0501-04

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2016.05.004