莊雪峰, 林文雄, 林金國, 關　鑫, 李吉慶

(1.福建農林大學材料工程學院；2.福建農林大學作物科學學院，福建 福州 350002)

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建柏心材6種試劑提取物的抑菌效果

莊雪峰1, 林文雄2, 林金國1, 關鑫1, 李吉慶1

(1.福建農林大學材料工程學院；2.福建農林大學作物科學學院，福建 福州 350002)

采用生長速率法研究建柏心材6種試劑(蒸餾水、甲醇、三氯甲烷、丙酮、石油醚、乙酸乙酯)提取物對彩絨革蓋菌和密粘褶菌生長抑制的影響，以探究建柏心材的抗腐能力.結果表明：蒸餾水提取物對彩絨革蓋菌無抑菌效果；丙酮提取物的EC50最低，為0.409 g·L-1，當含量為1.000 0 g·L-1時，其抑制率最高，達到64.61%，顯示丙酮提取物對彩絨革蓋菌的抑菌能力最強.除了蒸餾水外，5種試劑提取物都對密粘褶菌有抑菌效果，其中以甲醇提取物的EC50最低，為0.283 g·L-1，當含量為0.500 0 g·L-1時，其抑制率最高，達到64.03%，顯示甲醇提取物對密粘褶菌的抑菌能力最強.此研究結果為建柏在生產加工過程中產生的剩余物的合理利用提供科學依據(jù).

建柏; 木材腐朽菌; 提取物; 抑菌作用

各種抗菌活性成分存在于樹木等自然界的各種植物的提取物中[1-3].而存在于植物提取物中的成百上千種化學物質已被鑒定出來[4].研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)耐腐樹種的心材耐腐能力很強，而樹木的邊材則容易被木材腐朽菌侵蝕[5-7].前人[8-11]對四十多種木材利用木材腐朽真菌進行抑菌試驗的結果表明，各種樹木的抗菌和防腐性能相差懸殊.通過對植物提取物化學物質的探究，很多抑菌物質被發(fā)現(xiàn)，如酯類、酚類、黃酮類和有機酸等[12-14].建柏(Fokieniahodginsii)是一種柏科的喬木，材質堅實、 抗腐性強[15]，主要分布在我國的南方地區(qū)，是國家二級瀕危植物，一些具有抑菌效果的化學物質都能從多種柏科植物中提取出來[16].近些年來，國內外研究者已對多種植物提取物的耐腐和抑菌能力進行了研究.如李素英等[17]用甲醇和乙酸乙酯等試劑對桑和圓柏等4種樹種的心材進行了提取，采用生長速率法測定各種提取物對彩絨革蓋菌和密粘褶菌的抑菌活性，并對木材的防腐性能進行了研究.張玲[18]對銀杏樹木提取物的防腐性能進行了研究，其在試驗中針對不同試劑分別采取了索式提取法和熱回流提取法，并采用濾紙片法對抑菌效果展開了研究，發(fā)現(xiàn)銀杏心材三氯甲烷提取物對白腐菌和褐腐菌都有抑菌作用.此外，前人[5-7,9-11,14,16,19]對龍柏葉、6種蒿屬植物和5種松科植物的提取物進行了抑菌效果的研究，試驗多采用濾紙片擴散法和生長速率法，且常利用金黃色葡萄球菌等細菌及青霉菌、彩絨革蓋菌、密粘褶菌等真菌作為植物提取物抑菌試驗的菌種，在培養(yǎng)基方面則多采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基.目前，關于建柏具有強耐腐性的原因并不大了解，為深入了解建柏心材的抑菌和耐腐機理，本試驗參考前人的方法，使用麥芽糖瓊脂培養(yǎng)基，采用生長速率法研究建柏心材提取物對白腐菌和褐腐菌抑菌能力的影響，旨在為建柏在生產加工過程中產生的邊角料、鋸屑和鋸粉等剩余物的合理利用提供參考.

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1供試樹種建柏心材碎料和鋸屑取自福建省南平市順昌縣林產品市場，風干后用粉碎機粉碎并過篩.篩選40～60目的木粉作為試驗的原材料，置于冷凍室中密封保存.

1.1.2供試菌種白腐菌：彩絨革蓋菌(Coriolusversicolor)，其在國外多被稱為云芝栓菌(Trametesversicolor)，由中國林業(yè)微生物菌種保藏管理中心供應；褐腐菌：密粘褶菌(Gloeophyllumtrabeum)，由福建農林大學生命科學學院供應.

1.1.3試劑及其他材料蒸餾水自制；甲醇、三氯甲烷、丙酮、石油醚和乙酸乙酯都為分析純，由天津市富宇精細化工有限公司生產；馬鈴薯、瓊脂和麥芽糖等購自市場.

1.1.4麥芽糖瓊脂培養(yǎng)基的配制取削皮后的土豆200 g、15 g瓊脂、20 g麥芽糖和1000 mL蒸餾水，加熱溶解混合后過濾，稀釋定容至1000 mL，平均裝到6個150 mL錐形瓶中，隨后高壓滅菌(于121 ℃滅菌30 min).

1.2方法

1.2.1提取物的制備采用冷凝管進行熱回流提取.分別將100 g建柏心材木粉裝進圓底燒瓶中，用6種試劑分別提取兩次.第1次按照原料與試劑為1∶7的比例提取5 h，隨后取出過濾；第2次按照原料與試劑為1∶5的比例提取3 h.為了節(jié)約原料，盡可能將原料中的提取物都提取出來，倡導循環(huán)利用，第2次所用的原料即為第1次提取過濾完的剩料.由于第1次提取后原料中的提取物已不多，為了節(jié)省試劑，將第2次原料與試劑的比例設為1∶5，所加試劑少于第1次，且提取時間也相應縮短，為3 h.將兩次的濾液混合，在旋轉蒸發(fā)儀上進行減壓蒸發(fā)，制得膏狀物.將膏狀物置冰箱(4 ℃)中待用.

1.2.2提取物抑菌活性的測定采用生長速率法[19]測定6種試劑提取的建柏心材提取物對彩絨革蓋菌和密粘褶菌生長的抑制率.將兩種木材腐朽菌放在麥芽糖瓊脂培養(yǎng)基平板上分別培養(yǎng)7～10 d，再將滅菌后的培養(yǎng)基加熱熔化，冷卻到50 ℃左右，用移液槍分別量取供試樣品到滅菌的盛有一定量培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中搖勻.由于蒸餾水提取物對彩絨革蓋菌和密粘褶菌無抑菌作用，只對其他5種試劑的含量進行設置(表1、2)，同時分別設置空白對照(即培養(yǎng)皿中不加入試劑).在超凈工作臺上進行接菌操作，沿著菌落的外圍，用打孔器制取菌絲塊，直徑為7.0 mm，用接種環(huán)移到上述6個培養(yǎng)皿的中央(每種試劑含藥培養(yǎng)基都設置5個含量梯度，再加上空白對照的培養(yǎng)皿，則每種試劑含藥培養(yǎng)基都要用到6個培養(yǎng)皿).此外，為避免試劑對兩種真菌的抑菌作用，設置1組5個空白對照，分別加入1 mL各自的提取試劑到相應的培養(yǎng)皿中.在試驗過程中發(fā)現(xiàn)微量的甲醇都會對兩種真菌產生較強的抑菌作用，因此在移入菌絲塊前要將培養(yǎng)基中的甲醇揮發(fā)掉.將培養(yǎng)皿放到恒溫、恒濕的培養(yǎng)箱中，溫度設置為28 ℃.若空白對照培養(yǎng)皿(即每組中不加入試劑的培養(yǎng)皿)中的菌絲約長到培養(yǎng)皿直徑的三分之二時，就可以測量菌落的生長直徑.試驗重復3次.菌絲生長抑制率/%=(對照菌落生長直徑-處理菌落生長直徑)/對照菌落生長直徑×100.

毒力EC50是指在一定時間內，一半的試驗物出現(xiàn)某種傷害的毒物濃度，在本試驗中指的是抑制50%菌體生長所對應的試劑含量，EC50越小，則試劑的抑菌能力越強.毒力EC50由抑制率與幾率值換算，算出每個抑制率所對應的幾率值.用對數(shù)值表示含量，用每種試劑含量的對數(shù)值(x)減掉幾率值(y)，即得到毒力回歸方程(y=bx+a)，并算出抑制菌絲生長的毒力EC50[20].

表1　彩絨革蓋菌抑菌試驗培養(yǎng)基中的試劑含量Table 1　Concentration of poison malt agar solid medium against C.versicolor　g·L-1

表2　密粘褶菌抑菌試驗培養(yǎng)基中的試劑含量Table 2　Concentration of poison malt agar solid medium against G.trabeum　g·L-1

2　結果與分析

2.1建柏心材提取物的得率及膏狀物質的顏色

表3　建柏心材提取物的得率及膏狀物質的顏色Table 3　Yield and colour of extractives of F.hodginsii

表3顯示，除蒸餾水外，5種試劑提取物的得率與試劑極性呈正相關，甲醇的得率最大，其次分別為丙酮、乙酸乙酯和三氯甲烷，非極性試劑石油醚提取物的得率最低.

2.2建柏心材提取物對兩種木材腐朽菌的抑菌活性

從圖1可見，除蒸餾水外，建柏心材5種試劑提取物對彩絨革蓋菌都有一定的抑菌效果，抑菌活性隨著試劑含量的增加而增大，與含量呈正相關，原因是試劑含量越大，培養(yǎng)基中的抗菌成分越多.當試劑含量為0.500 0 g·L-1時，丙酮、乙酸乙酯、甲醇、石油醚和三氯甲烷提取物對彩絨革蓋菌的抑制率分別為48.49%、47.70%、42.13%、37.04%和35.91%，抑制率最高的是丙酮提取物；當試劑含量為1.000 0 g·L-1時，丙酮提取物的抑制率也最高，達到64.61%.

圖1　建柏心材提取物對彩絨革蓋菌的抑菌活性

從圖2可見，除蒸餾水外，建柏心材5種試劑提取物都對密粘褶菌有抑菌效果，且5種試劑提取物的抑菌效果隨著試劑含量的增加而增大.當試劑含量為0.500 0 g·L-1時，甲醇、石油醚、丙酮、乙酸乙酯和氯仿提取物對密粘褶菌的抑制率分別為64.03%、54.78%、47.98%、45.06%和34.84%，抑制率最高的是甲醇提取物；當試劑含量大于0.500 0 g·L-1時，石油醚提取物的抑制率稍好于甲醇提取物.

2.3建柏心材提取物對兩種木材腐朽菌的毒力

從表4可見，除蒸餾水外，建柏心材5種試劑的含量與抑菌效果呈正相關，毒力回歸方程的相關系數(shù)(R2)都大于0.9，隨著提取物含量的增加，提取物對彩絨革蓋菌的抑菌效果逐漸增強.5種試劑提取物對彩絨革蓋菌的EC50為0.409～0.690 g·L-1.根據(jù)EC50的大小，顯示5種試劑提取物對彩絨革蓋菌抑菌能力的大小為：丙酮提取物>甲醇提取物>乙酸乙酯提取物>三氯甲烷提取物>石油醚提取物，蒸餾水提取物基本無抑菌能力.可見，在木材防腐方面，建柏心材最適的試劑為丙酮.但與傳統(tǒng)的木材防腐劑ACQ相比，丙酮提取物的EC50比ACQ[21]大很多.

圖2　建柏心材提取物對密粘褶菌的抑菌活性

試劑毒力回歸方程(y=bx+a)相關系數(shù)(R2)EC50/(g·L-1)ACQy=1.2290x+7.29310.96120.0138丙酮y=1.0640x+5.41270.97050.4094甲醇y=1.5558x+5.42870.94820.5302乙酸乙酯y=1.5381x+5.41080.97580.5407三氯甲烷y=1.2544x+5.21040.91700.6796石油醚y=2.0294x+5.32720.98550.6899蒸餾水 ---

1)EC50為3次重復試驗的平均值；ACQ的數(shù)據(jù)引自文獻[21].

從表5可見，除蒸餾水外，建柏心材5種試劑的含量與抑菌效果呈正相關，毒力回歸方程的相關系數(shù)(R2)都大于0.9，EC50為0.283～0.856 g·L-1.根據(jù)EC50的大小，顯示5種試劑提取物對密粘褶菌抑菌能力的大小為：甲醇提取物>石油醚提取物>丙酮提取物>乙酸乙酯提取物>三氯甲烷提取物.可見，甲醇提取物對密粘褶菌的抑菌效果最好

對毒力回歸方程y=bx+a進行分析可知，式中斜率b的大小表示真菌對藥劑反應的靈敏度，b越大，靈敏度越高，即隨著藥劑含量的增加，抑制率明顯增大，但當含量達到某個峰值時，抑制率的增大會逐漸放緩.表5顯示：石油醚提取物毒力回歸方程的b大于甲醇提取物，在含量達到1.000 0 g·L-1時，抑制率增幅明顯且略超過甲醇提取物，此后增幅趨于平穩(wěn)；而石油醚提取物的最低抑制含量為0.125 0 g·L-1，甲醇提取物則為0.062 5 g·L-1，再結合EC50的大小，可得出抑制密粘褶菌的最佳試劑提取物為甲醇提取物.這也可以解釋圖2中，當試劑含量大于0.500 0 g·L-1時，石油醚提取物的抑制率稍好于甲醇提取物的現(xiàn)象.但與ACQ的EC50[21]相比，甲醇提取物的抑菌效果明顯較弱.

表5　建柏心材提取物對密粘褶菌的毒力1)Table 5　Toxicity of extractives from F.hodginsii on G.trabeum

1)EC50為3次重復試驗的平均值；ACQ的數(shù)據(jù)引自文獻[21].

3　結論與討論

(1)除蒸餾水外，建柏心材5種試劑提取物對彩絨革蓋菌的EC50為0.409～0.690 g·L-1，且抑菌效果與試劑含量呈正相關.其中，丙酮提取物的EC50最低，為0.409 g·L-1，表明其對彩絨革蓋菌的毒力最大，當含量為2.000 0 g·L-1時，丙酮提取物的抑制率達到80%，但抑制率略小于石油醚提取物.在y=bx+a的毒力回歸方程中，b的大小對于各試劑在不同含量下的抑制率有較大影響，且由于在某種程度上彩絨革蓋菌的每次生長是不可控的，試驗中略有誤差在所難免.綜合各方面考量，再根據(jù)EC50的大小，得出建柏心材5種試劑提取物對彩絨革蓋菌抑菌能力的大小為：丙酮提取物>甲醇提取物>乙酸乙酯提取物>氯仿提取物>石油醚提取物.可見，對彩絨革蓋菌抑菌能力最強的是丙酮提取物.

(2)除蒸餾水外，建柏心材5種試劑提取物對密粘褶菌的抑菌效果也不盡相同，且抑菌效果與試劑含量呈正相關.5種試劑提取物對密粘褶菌的EC50為0.283～0.856 g·L-1，以甲醇提取物的EC50最低，為0.283 g·L-1，表明其對密粘褶菌的毒力最大；而氯仿提取物的毒力最小，當含量為2.000 0 g·L-1時，甲醇提取物的抑制率大于96%；當含量大于0.500 0 g·L-1時，石油醚提取物的抑制率稍好于甲醇提取物.結合“結論與討論”中(1)的分析結果，再根據(jù)EC50的大小，得出建柏心材5種試劑提取物對密粘褶菌抑菌能力的大小為：甲醇提取物>石油醚提取物>丙酮提取物>乙酸乙酯提取物>氯仿提取物.可見，對密粘褶菌抑菌能力最強的是甲醇提取物.

本試驗結果探明了建柏心材提取物對彩絨革蓋菌和密粘褶菌的抑菌效果，為建柏在生產加工過程中產生的剩余物的合理利用提供了科學依據(jù).

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(責任編輯:施曉棠)

A comparative analysis of the antibacterial effect of six kinds of reagent extractives ofFokieniahodginsiiheartwood

ZHUANG Xuefeng1, LIN Wenxiong2, LIN Jinguo1, Guan Xin1, LI Jiqing1

(1.College of Material and Engineering; 2.College of Crop Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China)

To study the anti-corrosive capacity ofFokieniahodginsiiheartwood, six kinds of reagents were used to extractFokieniahodginsiiheartwood, and followed by inhibiting ability againstCoriolusversicolorandG.trabeumby growth rate method. Results showed that hot water extracts had no antibacterial effects onC.versicolor. Among them, acetone extracts had the lowestEC50at 0.409 g·L-1, and the highest bacteriostatic rate at 64.61% when its concentration was 1.000 0 g·L-1. Except for hot water extracts, all the five extractives demonstrated antibacterial effects againstG.trabeum. Among them, methanol extracts had the lowestEC50at 0.283 g·L-1, and when its concentration was 0.500 0 g·L-1, it showed the highest bacteriostatic rate at 64.03%. To summarize, acetone extracts fromF.hodginsiihad the best antibacterial effects againstC.versicolorand methanol extracts had the best antibacterial effects againstG.trabeum, which provided a sound theory basis for utilization ofF.hodginsiiresidues.

Fokieniahodginsii; wood-rotting fungi; extractive; inhibiting effect

2015-11-02

2015-12-13

國家農業(yè)成果轉化項目(K1A14102A)；福建省科技計劃項目星火計劃重點項目(2013S0034、2014S0027、2015S0035)；福建省高校產學合作項目(2015H6001).

莊雪峰(1990-)，男，碩士研究生.研究方向：家具與木材科學.Email:1562655090@qq.com.通訊作者李吉慶(1970-)，男，副教授.研究方向：家具與木材科學.Email:nfuljq@163.com.

S781.42

A

1671-5470(2016)05-0576-05

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2016.05.016