徐　歡, 俞新玲, 林勇明, 吳承禎,3, 謝安強(qiáng), 陳　燦, 李　鍵, 洪　滔

(1.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院，福建 福州 350002；2.福建省高校森林生態(tài)系統(tǒng)經(jīng)營(yíng)與過程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002；3.武夷學(xué)院生態(tài)與資源工程學(xué)院，福建 南平 354300)

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桉樹根際土壤解磷細(xì)菌的分離、篩選及其解磷效果

徐歡1,2, 俞新玲1,2, 林勇明1,2, 吳承禎1,2,3, 謝安強(qiáng)1,2, 陳燦1,2, 李鍵1,2, 洪滔1,2

(1.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院，福建 福州 350002；2.福建省高校森林生態(tài)系統(tǒng)經(jīng)營(yíng)與過程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002；3.武夷學(xué)院生態(tài)與資源工程學(xué)院，福建 南平 354300)

采用選擇性培養(yǎng)基對(duì)柳桉、鄧恩桉和尾巨桉3種桉樹林地根際土壤解磷細(xì)菌進(jìn)行分離和篩選，并對(duì)其解磷能力進(jìn)行測(cè)定.結(jié)果表明：(1)3種林分根際土壤中均存在大量的解磷細(xì)菌，其中的解有機(jī)磷細(xì)菌數(shù)量為(2.23～4.17)×104cfu·g-1，溶無機(jī)磷細(xì)菌數(shù)量為(2.05～4.00)×104cfu·g-1，解有機(jī)磷細(xì)菌數(shù)量多于溶無機(jī)磷細(xì)菌數(shù)量.不同林分根際土壤解磷細(xì)菌數(shù)量分布有差異，其數(shù)量大小為：柳桉>尾巨桉>鄧恩桉.(2)篩選到12株溶無機(jī)磷細(xì)菌和14株解有機(jī)磷細(xì)菌，且不同解磷細(xì)菌的解磷能力存在顯著差異(P<0.05).12株溶無機(jī)磷細(xì)菌在無機(jī)磷培養(yǎng)液中的有效磷含量為55.854～367.169 μg·mL-1，最大為P7菌株；14株解有機(jī)磷細(xì)菌在有機(jī)磷培養(yǎng)液中的有效磷含量為11.374～30.330 μg·mL-1，最大為YP菌株.溶無機(jī)磷細(xì)菌溶解的無機(jī)磷含量與蒙金娜無機(jī)磷培養(yǎng)基的pH之間存在極顯著負(fù)相關(guān)性(P<0.01)，解有機(jī)磷細(xì)菌分解的有機(jī)磷含量與卵黃培養(yǎng)基的pH之間無顯著相關(guān)性(P>0.05).綜上所述，26株解磷細(xì)菌中，P7菌株溶解無機(jī)磷的能力最強(qiáng)，YP8菌株分解有機(jī)磷的能力最強(qiáng)，這兩個(gè)菌株可作為下一步研制桉樹微生物肥料的重點(diǎn)菌種.

桉樹; 解磷細(xì)菌; 溶磷能力; 有效磷

磷元素是植物生長(zhǎng)過程中必需的三大營(yíng)養(yǎng)元素之一，其含量的高低與植物的生長(zhǎng)發(fā)育和新陳代謝密切相關(guān).然而，我國(guó)75%的耕地土壤缺磷，且土壤中95%的磷以無效磷的形式存在，不能直接被植物吸收利用[1].在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上往往采用施加大量磷肥來補(bǔ)給土壤中磷元素的缺失，但磷肥極易與土壤中的Ca2+、Al3+、Fe2+和Fe3+螯合形成難溶性磷酸鹽，無法被植物吸收利用，且化肥的過度使用會(huì)破壞土壤結(jié)構(gòu)，污染環(huán)境[2-3].可見，研究土壤中被固定的無效態(tài)磷的分解和釋放，對(duì)于提高土壤中的可溶性磷含量、調(diào)節(jié)土壤肥力及科學(xué)合理施肥具有重要意義.

植物根際土壤中存在大量具有不同解磷能力的微生物，這類微生物可以通過自身代謝產(chǎn)物或與其他生物協(xié)同溶解土壤中的難溶性無機(jī)磷，增加土壤中的有效磷含量，從而提高土壤磷含量[4-5].Sperber[6]發(fā)現(xiàn)，植物根際土壤的解磷細(xì)菌不僅可提高根際土壤的磷含量，對(duì)植物根系的生理代謝過程也有促進(jìn)作用；Zhao et al[7]從楊樹根際土壤中分離出大量的溶磷菌株，發(fā)現(xiàn)DZ-18菌株的解磷效果最好；馬文文等[8]從7種禾草根際土壤中分離篩選得到2株具有高效解磷能力的菌株P(guān)CRP5和MCMRS4；王浩等[9]從豆科植物根際土壤中分離得到47株對(duì)溶液中磷酸三鈣均有很好溶解效果的溶磷菌；Hussain et al[10]從玉米根際土壤中分離篩選的PS-01菌株不僅有較強(qiáng)的解磷能力，還對(duì)玉米的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用.以上研究表明，從植物根際土壤中篩選得到具有高效解磷能力的菌株可緩解土壤磷素缺乏的問題.但目前我國(guó)學(xué)者關(guān)于植物根際解磷細(xì)菌的研究主要針對(duì)農(nóng)田和草地兩種生態(tài)系統(tǒng)，而對(duì)人工林生態(tài)系統(tǒng)植物解磷細(xì)菌的研究較少.

桉樹自引進(jìn)中國(guó)以來，種植規(guī)模不斷擴(kuò)大，因其速生、高產(chǎn)及短期可采伐的優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已成為我國(guó)南方人工林造林的主要建樹樹種之一[11].桉樹的速生特性對(duì)土壤中的磷元素消耗大，長(zhǎng)期種植桉樹后林地的土壤肥力嚴(yán)重衰退，導(dǎo)致產(chǎn)量下降[12-13].為解決這一問題，開展桉樹根際土壤解磷微生物的分離和篩選工作勢(shì)在必行.因此，本試驗(yàn)以鄧恩桉(Eucalyptusdunnii)、柳桉(E.saligna)和尾巨桉(E.urophglla×E.grandis)3種桉樹林地為研究對(duì)象，研究桉樹根際土壤解磷微生物的解磷能力，以期篩選出優(yōu)良的解磷菌株，為提高桉樹人工林的產(chǎn)量及研制微生物復(fù)合肥提供理論依據(jù).

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1研究區(qū)概況研究區(qū)位于福建省永安國(guó)有林場(chǎng)(N25°56′27″、E117°23′18″).該林場(chǎng)屬典型的亞熱帶季風(fēng)山地氣候，年平均氣溫19.1 ℃，平均降雨量1 688 mm.林地土壤質(zhì)地以紅壤為主，其次為黃壤.林場(chǎng)種植大面積的人工植被，如杉木(Cunninghamialanceolata)、毛竹(Phyllostachysedulis)、尾巨桉和馬尾松(PinusmassomianaLamb.)等.

1.1.2土樣采集采集永安國(guó)有林場(chǎng)柳桉、尾巨桉和鄧恩桉3種桉樹林地的根際土壤，試驗(yàn)區(qū)林地的基本特征如表1所示.采取5點(diǎn)取樣法對(duì)3塊標(biāo)準(zhǔn)地采樣，去除表土，取10～20 cm深度的根際土壤500 g，裝袋并記錄采集地點(diǎn)、日期和土樣號(hào)，取回實(shí)驗(yàn)室置冰箱(4 ℃)中保存.

表1　試驗(yàn)區(qū)林地的基本特征Table 1　Basic characteristics of experiment sites

1.1.3培養(yǎng)基采用蒙金娜無機(jī)磷培養(yǎng)基分離溶無機(jī)磷細(xì)菌，采用卵黃培養(yǎng)基分離解有機(jī)磷細(xì)菌，采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基保存和活化菌株.各培養(yǎng)基組成和配方見文獻(xiàn)[14-16].

1.2解磷細(xì)菌的分離與純化

準(zhǔn)確稱取5 g土壤樣品到裝有95 mL無菌水的250 mL三角瓶中，于25 ℃搖床振蕩30 min，靜置20～30 s，取上清液按十倍稀釋法制成10-4、10-5、10-6一系列稀釋菌液.各取3種稀釋濃度樣品0.1 mL涂布于卵黃平板培養(yǎng)基和蒙金娜無機(jī)磷平板培養(yǎng)基上，每個(gè)濃度重復(fù)3次.解有機(jī)磷細(xì)菌于28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，溶無機(jī)磷細(xì)菌培養(yǎng)7 d，同時(shí)記錄具有透明圈的菌落個(gè)數(shù).培養(yǎng)結(jié)束后，用接種環(huán)挑取有明顯透明圈的菌落，采用劃線法純化5次以上，將純化后的單菌落轉(zhuǎn)至斜面培養(yǎng)基上，保存于冰箱(4 ℃)中備用.

1.3解磷能力的測(cè)定

1.3.1定性分析將分離純化后的菌株分別點(diǎn)植于蒙金娜無機(jī)磷培養(yǎng)基和卵黃培養(yǎng)基上，置于培養(yǎng)箱(28 ℃)中，溶無機(jī)磷細(xì)菌培養(yǎng)7 d，解有機(jī)磷細(xì)菌培養(yǎng)2 d，觀察并測(cè)定溶磷圈直徑(D)、菌落直徑(d)，計(jì)算D與d的比值.

1.3.2定量分析分別在150 mL三角瓶中加入蒙金娜無機(jī)磷液體培養(yǎng)基和卵黃液體培養(yǎng)基，每瓶30 mL，高溫滅菌20 min(121 ℃、1.01 Pa)后備用.提取已在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上活化24 h的菌液，在蒙金娜無機(jī)磷液體培養(yǎng)基和卵黃液體培養(yǎng)基中各加1 mL，以加1 mL無菌水為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次，搖床培養(yǎng)(28 ℃、160 r·min-1)5 d.培養(yǎng)完畢后，發(fā)酵液于4 ℃、10 000 r·min-1離心20 min，取上清液定容至50 mL，于37 ℃水浴1 h，再于4 ℃、10 000 r·min-1離心20 min，取上清液定容至50 mL，采用鉬銻抗比色法[9]測(cè)定兩次離心后上清液的磷含量.第1次上清液的測(cè)定結(jié)果表示培養(yǎng)液中的有效磷含量，第2次上清液的測(cè)定結(jié)果表示菌體所吸收的磷含量.培養(yǎng)基的pH用酸度計(jì)測(cè)定.

1.4數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Excel和SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，利用鄧肯氏新復(fù)極差法進(jìn)行方差分析，菌株溶磷能力與pH之間的相關(guān)性采用Pearson軟件分析.

2　結(jié)果與分析

2.1不同桉樹根際土壤解磷細(xì)菌的數(shù)量

表2　不同桉樹根際土壤解磷細(xì)菌的數(shù)量1)Table 2　Quantity of phosphate solubilizing bacteria in different Eucalyptus forest soil　104 cfu·g-1

1)同列數(shù)據(jù)后附不同小寫字母者表示差異顯著(P<0.05)，附相同字母者表示差異不顯著(P>0.05).

鄧恩桉、柳桉和尾巨桉3種林分類型的根際土壤中均存在大量解有機(jī)磷細(xì)菌和溶無機(jī)磷細(xì)菌，以柳桉林磷細(xì)菌的總量最多，其他依次為尾巨桉林和鄧恩桉林，柳桉林的溶無機(jī)磷細(xì)菌和解有機(jī)磷細(xì)菌數(shù)量均與其他兩種林型存在顯著差異(表2).在3種林分類型的根際土壤中，除鄧恩桉林解有機(jī)磷細(xì)菌的數(shù)量大致與溶無機(jī)磷細(xì)菌數(shù)量相等外，其他兩種林型均為解有機(jī)磷細(xì)菌數(shù)量大于溶無機(jī)磷細(xì)菌數(shù)量.

2.2固體培養(yǎng)基上解磷細(xì)菌的解磷能力

D/d可作為初步判斷解磷細(xì)菌相對(duì)解磷能力的一個(gè)指標(biāo).根據(jù)D/d的大小，從蒙金娜無機(jī)磷平板培養(yǎng)基和卵黃平板培養(yǎng)基上各篩選出D/d大于1.0的溶無機(jī)磷細(xì)菌和解有機(jī)磷細(xì)菌各30株，并進(jìn)行編號(hào)，溶無機(jī)磷細(xì)菌編號(hào)為P1～P30，解有機(jī)磷細(xì)菌編號(hào)為YP1～YP30.結(jié)果(表3)表明：30株溶無機(jī)磷細(xì)菌的解磷能力存在顯著差異(P<0.05).解磷能力較強(qiáng)的(D/d>2)有7株，占總數(shù)的20.33%；解磷能力強(qiáng)的(2.02)有12株，占總數(shù)的40.00%；解磷能力強(qiáng)的(2.0

2.3液體培養(yǎng)基上解磷細(xì)菌的解磷能力

對(duì)初步篩選獲得的60株解磷細(xì)菌進(jìn)行液體培養(yǎng)，部分解磷細(xì)菌在多次純化和復(fù)篩過程中失去了解磷能力，最終篩選得到26株解磷能力穩(wěn)定的菌株，其中，溶無機(jī)磷細(xì)菌12株，解有機(jī)磷細(xì)菌14株.

2.3.1溶解無機(jī)磷的能力表4表明，12株溶無機(jī)磷細(xì)菌在液體搖瓶中均表現(xiàn)出較強(qiáng)的解磷能力.從菌體自身所吸收的磷含量來看，在12株溶無機(jī)磷細(xì)菌中，P7菌株在培養(yǎng)液中吸收的可溶性磷含量最大，達(dá)29.162 μg·mL-1；其次是P5、P26和P28菌株，分別為17.887、17.572和10.252 μg·mL-1；其余菌株自身吸收的磷含量均在10.00 μg·mL-1以下.

從菌株溶解有效磷的含量來看，所有接種處理培養(yǎng)液中的有效磷含量均高于CK，表明各菌株對(duì)磷酸三鈣均有一定的溶解作用.12株溶無機(jī)磷細(xì)菌接種處理培養(yǎng)液中的有效磷含量為55.854～367.169 μg·mL-1，增幅是CK的10.190～66.989倍，各菌株間溶磷效果的差異極顯著(P<0.01).其中，P7菌株的解磷能力最強(qiáng)，該菌株接種處理的培養(yǎng)液中有效磷含量達(dá)367.169 μg·mL-1，其次是P8和P19菌株，分別為265.397 和235.614 μg·mL-1，這3個(gè)菌株在固體培養(yǎng)基上也表現(xiàn)出較強(qiáng)的解磷能力.而在固體培養(yǎng)基上有較高D/d的P29和P30菌株在液體培養(yǎng)基中的解磷能力僅分別為77.145和55.854 μg·mL-1.

表3　解磷細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上的解磷能力1)Table 3　Capacities of different phoshporus-solubilizing bacteria cultivated on solid nutrient medium

1)同列數(shù)據(jù)后附不同小寫字母者表示差異顯著(P<0.05).

表4　溶無機(jī)磷細(xì)菌在液體培養(yǎng)基上的溶磷能力1)Table 4　Capacities of different inorganic phoshporus-solubilizing bacteria cultivated in liquid medium

1)同列數(shù)據(jù)后附不同小寫字母者表示差異顯著(P<0.05)，附相同字母者表示差異不顯著(P>0.05).

相對(duì)于未接種的培養(yǎng)液(pH 6.73)，12株溶無機(jī)磷細(xì)菌接種處理的培養(yǎng)液pH均有不同程度的下降，各處理液的pH為4.26～5.03，降幅為1.70～2.47.其中，P7菌株接種處理的培養(yǎng)液pH最低，為4.26，但該菌株的溶磷量最高；P29和P30菌株接種處理的培養(yǎng)液pH分別為5.03和4.98，兩個(gè)菌株的溶磷量較低.利用相關(guān)性回歸方程進(jìn)一步分析菌株溶磷量與pH的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，12株溶無機(jī)磷細(xì)菌的溶磷量與pH之間存在極顯著相關(guān)性(P<0.01)，線性回歸方程為：y=-277.650x+1 445.900，R2=0.647 4.

2.3.2分解有機(jī)磷的能力表5表明，14株解有機(jī)磷細(xì)菌在液體搖瓶中也表現(xiàn)出一定的解磷能力.從菌體自身吸收的磷含量來看，在14株解有機(jī)磷細(xì)菌中，只有5株自身吸收的磷含量超過1.00 μg·mL-1，其中，YP25菌株最高，達(dá)1.398 μg·mL-1，其余菌株自身吸收的磷含量均在1.00 μg·mL-1以下，各菌株吸收的磷含量之間存在極顯著差異(P<0.01).

從菌株分解有效磷的含量來看，14株解有機(jī)磷細(xì)菌雖也表現(xiàn)出一定的解磷能力，但其解磷能力遠(yuǎn)不及溶無機(jī)磷細(xì)菌.12株解有機(jī)磷細(xì)菌接種處理的培養(yǎng)液中有效磷含量為11.374～30.330 μg·mL-1，增幅是CK的2.130～5.680倍，各菌株間的解磷能力差異極顯著(P<0.01).其中，YP8菌株的解磷能力最強(qiáng)，與其他菌株的差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)，而YP24菌株的解磷能力最弱.結(jié)合平板培養(yǎng)基試驗(yàn)結(jié)果，YP8菌株在兩種不同的培養(yǎng)方式中均表現(xiàn)出很好的解磷能力.

表5　解有機(jī)磷細(xì)菌在液體培養(yǎng)基上的解磷能力1)Table 5　Capacities of different organic phoshporus-solubilizing bacteria cultivated in liquid medium

1)同列數(shù)據(jù)后附不同小寫字母者表示差異顯著(P<0.05)，附相同字母者表示差異不顯著(P>0.05).

14株解有機(jī)磷細(xì)菌接種處理的培養(yǎng)液pH為7.92～8.25，與未接種的培養(yǎng)液pH無明顯差異.利用相關(guān)性回歸方程進(jìn)一步分析菌株溶磷量與pH的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，14株解有機(jī)磷細(xì)菌的解磷量與pH之間無顯著相關(guān)性(P>0.05)，線性回歸方程為：y=-27.325x+238.980，R2=0.242 1.

3　小結(jié)

本試驗(yàn)通過溶磷圈法和鉬銻抗比色法對(duì)3種桉樹林根際土壤解磷細(xì)菌進(jìn)行篩選，并對(duì)其解磷能力進(jìn)行測(cè)定，得到26株具有穩(wěn)定解磷能力的菌株，但各菌株對(duì)磷酸三鈣和卵磷脂的溶解能力差異較大.12株溶無機(jī)磷細(xì)菌溶解磷酸三鈣的量為55.854～367.169 μg·mL-1，解磷能力最強(qiáng)的是P7菌株；14株解有機(jī)磷細(xì)菌分解卵磷脂的量為11.374～30.330 μg·mL-1，解磷能力最強(qiáng)的是YP8菌株.P7和YP8菌株可作為研制微生物肥料的重點(diǎn)菌株.溶無機(jī)磷細(xì)菌溶解的無機(jī)磷含量與培養(yǎng)液pH之間存在顯著負(fù)相關(guān)性，解有機(jī)磷細(xì)菌分解的有機(jī)磷含量與培養(yǎng)液pH之間無顯著相關(guān)性.目前只是初步探討P7和YP8菌株的解磷效果和解磷機(jī)制，以后有望進(jìn)一步開展兩個(gè)菌株對(duì)桉樹的長(zhǎng)期接種效應(yīng)及其促生機(jī)制的研究.

4　討論

植物根際土壤解磷微生物不僅可將土壤中的難溶性磷轉(zhuǎn)化為可溶性磷以供植物吸收利用，還可通過分泌生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)和提高植物對(duì)其他營(yíng)養(yǎng)元素的吸收利用能力等方面促進(jìn)植物生長(zhǎng).植物根際土壤解磷微生物的數(shù)量與植物所處區(qū)域的植被類型、水熱狀況和土壤肥力密切相關(guān)[8].就植被類型對(duì)植物根際土壤解磷微生物的影響而言，有研究發(fā)現(xiàn)植物根系可向生長(zhǎng)環(huán)境中分泌有機(jī)物以供磷細(xì)菌生長(zhǎng)，根系分泌物數(shù)量會(huì)直接影響磷細(xì)菌的數(shù)量.由于不同類型植物的根系分泌物數(shù)量不同，導(dǎo)致不同植被類型其根際土壤微生物數(shù)量的差異[17].臧威等[18]研究大豆、玉米、小麥和水稻4種農(nóng)作物根際土壤磷細(xì)菌數(shù)量發(fā)現(xiàn)，玉米根際土壤磷細(xì)菌數(shù)量最多，水稻最少，但各作物根際土壤磷細(xì)菌數(shù)量分布差異未達(dá)到顯著水平(P>0.05).本試驗(yàn)結(jié)果表明，3種桉樹林地根際土壤中均存在大量的磷細(xì)菌，磷細(xì)菌數(shù)量分布大小為：柳桉>尾巨桉>鄧恩桉，這與臧威等的研究結(jié)果[18]相似.產(chǎn)生這種差異的原因可能是由于不同品種桉樹的根系分泌物數(shù)量存在差異所致.3種桉樹林地根際土壤中磷細(xì)菌的數(shù)量、分布均為解有機(jī)磷細(xì)菌多于溶無機(jī)磷細(xì)菌，這可能是由于林地土壤有較厚的枯枝落葉層，豐富的有機(jī)物為解有機(jī)磷細(xì)菌的生長(zhǎng)提供更有利的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境.

目前，測(cè)定解磷細(xì)菌的解磷能力一般是通過測(cè)量固體培養(yǎng)基上菌落周圍溶磷圈的大小來判斷菌株解磷能力的強(qiáng)弱，但許多研究表明，溶磷圈大小與菌株解磷能力呈弱相關(guān)關(guān)系[19].部分解磷細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上無溶磷圈產(chǎn)生，但經(jīng)過液體培養(yǎng)，也能表現(xiàn)出一定的解磷能力.因此，固體培養(yǎng)基上解磷細(xì)菌溶磷圈的大小以及D/d只能定性地反應(yīng)菌株的解磷能力，要精確地了解解磷細(xì)菌解磷能力的強(qiáng)弱，需采用液體培養(yǎng)法對(duì)菌株的解磷能力進(jìn)行定量分析.本試驗(yàn)中，12株溶無機(jī)磷細(xì)菌和14株解有機(jī)磷細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上測(cè)定的D/d與液體培養(yǎng)上測(cè)定的解磷能力不成正比，即在固體培養(yǎng)基上D/d較小的菌株，在液體培養(yǎng)階段卻有較強(qiáng)的解磷能力，而在固體培養(yǎng)基上有較大D/d的菌株，在液體培養(yǎng)階段解磷能力減弱，溶液中有效磷含量也顯著低于其他菌株，這與前人對(duì)玉米[20]和馬尾松[21]解磷能力的研究結(jié)果相似.產(chǎn)生這種結(jié)果的原因，一方面可能是由于在配置平板培養(yǎng)基的過程中無法保證每個(gè)培養(yǎng)皿中含有相同體積的磷酸三鈣或卵磷脂，因此各菌株所分解磷酸三鈣或卵磷脂的量不同，導(dǎo)致各菌株在固體平板培養(yǎng)基上產(chǎn)生的溶磷圈大小也不一樣[22]；另一方面可能是由兩種培養(yǎng)方式所致，部分解磷細(xì)菌在液體培養(yǎng)方式下的生長(zhǎng)繁殖速度比固體培養(yǎng)方式更快，菌株在液體培養(yǎng)方式的解磷能力也更強(qiáng)[20].

解磷細(xì)菌在多次純化的過程中，部分菌株的解磷能力隨著純化次數(shù)的增加而呈下降趨勢(shì)，甚至消失.Kucey[23]發(fā)現(xiàn)解磷細(xì)菌在純化的過程中有50%的菌株失去解磷能力；柯春亮等[24]篩選的8株溶無機(jī)磷細(xì)菌在純化后，僅3株仍表現(xiàn)出穩(wěn)定的解磷能力.研究表明，解磷細(xì)菌解磷能力的發(fā)揮受土壤中其他大量微生物(如固氮菌)的影響，這種影響表現(xiàn)為解磷細(xì)菌與其他微生物的協(xié)同作用[25].如磷細(xì)菌與固氮菌同時(shí)存在時(shí)，磷細(xì)菌通過提高土壤中的磷含量為固氮菌的生長(zhǎng)繁殖提供磷源，固氮菌可通過自身分泌生理活性物質(zhì)加速解磷細(xì)菌芽孢的萌發(fā)速度[26].本試驗(yàn)中，60株解磷細(xì)菌在純化后，僅12株溶無機(jī)磷細(xì)菌和14株解有機(jī)磷細(xì)菌仍具有一定的解磷能力，與Kucey[23]和柯春亮等[24]的研究結(jié)果一致.產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是，部分菌株通過與其他菌株形成類似共生的關(guān)系來表現(xiàn)出一定的解磷能力，而菌株之間這種相互促進(jìn)的關(guān)系在純化的過程中逐漸消失，從而導(dǎo)致部分菌株的解磷能力下降甚至喪失.

解磷細(xì)菌在生長(zhǎng)繁殖的過程中，不僅能分解環(huán)境中的難溶性磷，而且可將分解出來的磷同化后貯存在自身細(xì)胞中.趙小蓉等[27]研究發(fā)現(xiàn)，菌株本身會(huì)吸收培養(yǎng)液中溶解的磷用于自身的生長(zhǎng)繁殖，忽視菌體吸收利用的有效磷含量，會(huì)低估某些菌株的實(shí)際解磷能力.陳陽等[28]利用溶菌酶對(duì)26株解磷芽孢桿菌的細(xì)胞進(jìn)行破碎后發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液中的有效磷含量增加，表明各菌株在分解溶液中磷酸三鈣的同時(shí)，自身也吸收同化部分溶液中分解的磷.因此，不能因?yàn)榻饬准?xì)菌在液體培養(yǎng)基上測(cè)定的有效磷增量為負(fù)值而認(rèn)為該菌株沒有解磷能力，應(yīng)該考慮菌體自身對(duì)分解的磷吸收同化的量，這樣才能對(duì)菌株的解磷能力做出更準(zhǔn)確的判斷.本試驗(yàn)中，26株解磷細(xì)菌在液體培養(yǎng)過程中均吸收部分溶液中分解的磷貯存于菌體細(xì)胞中，這表明各菌株實(shí)際溶解磷酸三鈣和卵磷脂的量多于溶液中測(cè)得的有效磷含量，這一結(jié)果證實(shí)了趙小蓉等[27]的結(jié)論.但不同菌株自身吸收同化的磷含量存在差異，出現(xiàn)這種差異的原因可能是由于不同菌株自身生長(zhǎng)繁殖對(duì)養(yǎng)分需求不同.

關(guān)于溶磷量與培養(yǎng)介質(zhì)pH之間的關(guān)系，李蓉等[29]研究表明兩者并沒有顯著的相關(guān)性，而喬志偉等[30]研究證明兩者存在極顯著負(fù)相關(guān)性，即培養(yǎng)介質(zhì)的pH越低，培養(yǎng)液中的溶磷量越大，表明培養(yǎng)介質(zhì)的酸度對(duì)溶磷量有很大影響.本試驗(yàn)結(jié)果表明，蒙金娜無機(jī)磷培養(yǎng)基的pH與溶無機(jī)磷細(xì)菌培養(yǎng)液中有效磷含量之間呈極顯著負(fù)相關(guān)，卵黃培養(yǎng)基的pH與解有機(jī)磷細(xì)菌培養(yǎng)液中有效磷含量無顯著相關(guān)性.這可能與不同類型解磷細(xì)菌的溶磷機(jī)制不同有關(guān)：溶無機(jī)磷細(xì)菌通過在生長(zhǎng)過程中分泌出有機(jī)酸，或與NH4+同化作用釋放H+，產(chǎn)生的酸既能溶解培養(yǎng)液中的難溶性磷，又能降低培養(yǎng)介質(zhì)的pH[31]；而解有機(jī)磷細(xì)菌是通過分泌胞外磷酸酶等非有機(jī)酸類物質(zhì)來分解有機(jī)磷脂，釋放有機(jī)磷，其代謝產(chǎn)物對(duì)培養(yǎng)液的pH無顯著影響[29].

[1] 魏偉,吳小芹,喬歡.馬尾松根際高效解磷真菌的篩選鑒定及其促生效應(yīng)[J].林業(yè)科學(xué),2014,50(9):82-88.

[2] BHATTACHARYYA P N, JHA D K. Plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR): emergence in agriculture [J]. World Journal of Microbiol and Biotechnology, 2012,28(4):1 327-1 350.

[4] 崔邢,張亮,林勇明,等.不同土壤條件下解磷菌處理對(duì)巨尾桉土壤有效磷含量的影響[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào),2015,21(4):740-746.

[5] AHEMAD M, KIBRET M. Mechanisms and applications of plant growth promoting rhizobacteria: Current perspective [J]. Journal of King Saud University-Science, 2014,26(1):1-20.

[6] SPERBER J I. The incidence of apatite-solubilizing organisms in the rhizosphere and soil [J]. Crop and Pasture Science, 1958,9(6):778-781.

[7] ZHAO L, WU X Q, YE J R, et al. Isolation and characterization of a mycorrhiza helper bacterium from rhizosphere soils of poplar stands [J]. Biology and Fertility of Soils, 2014,50(4):593-601.

[8] 馬文文,姚拓,蒲小鵬,等.東祁連山7種禾草根際溶磷菌篩選及其溶磷特性[J].草業(yè)科學(xué),2015,32(4):515-523.

[9] 王浩,姜妍,劉偉,等.大豆根際高效溶磷菌株的分離及溶磷能力分析[J].大豆科學(xué),2014,33(3):404-407.

[10] HUSSAIN M I, ASGHAR H N, AKHTAR M J, et al. Impact of phosphate solubilizing bacteria on growth and yield of maize [J]. Soil & Environment, 2013,32(1):71-78.

[11] 楊尚東,吳俊,譚宏偉,等.紅壤區(qū)桉樹人工林煉山后土壤肥力變化及其生態(tài)評(píng)價(jià)[J].生態(tài)學(xué)報(bào),2013,33(24):7 788-7 797.

[12] 譚宏偉,楊尚東,吳俊,等.紅壤區(qū)桉樹人工林與不同林分土壤微生物活性及細(xì)菌多樣性的比較[J].土壤學(xué)報(bào),2014,51(3):575-584.

[13] 王勁松,呂成群,覃林海,等.兩個(gè)桉樹無性系接種固氮菌造林試驗(yàn)效果初探[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2010,30(12):50-55.

[14] 潘虹,曹翠玲,林雁冰,等.石灰性土壤解磷細(xì)菌的鑒定及其對(duì)土壤無機(jī)磷形態(tài)的影響[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2015,43(10):114-122.

[15] 朱培淼,楊興明,徐陽春,等.高效溶磷細(xì)菌的篩選及其對(duì)玉米苗期生長(zhǎng)的促進(jìn)作用[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào),2007,18(1):107-112.

[16] 劉聰,林維,孫瓏,等.黑土區(qū)林地土壤高效解磷細(xì)菌的分離、篩選及其解磷效果[J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2013,41(11):83-85.

[17] 于翠,呂德國(guó),秦嗣軍,等.甜櫻桃砧木根際和非根際解磷細(xì)菌研究初報(bào)[J].沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2006,37(5):769-771.

[18] 臧威,孫劍秋,王鵬,等.東北地區(qū)四種農(nóng)作物根際磷細(xì)菌的分布[J].中國(guó)生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2009,17(6):1 206-1 210.

[19] 葉震,陳秀蓉,楊淑君.東祁連山高寒植被土壤解磷菌篩選及其解磷能力的初步研究[J].草原與草坪,2010 30(5):6-10.

[20] 白文娟,胡蓉蓉,章家恩,等.玉米根際溶磷細(xì)菌的分離、篩選及溶磷能力研究[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2013,34(2):167-176.

[21] 黃鵬飛,劉君昂,靳愛仙,等.馬尾松根際土壤溶磷菌分離篩選、鑒定及其溶磷效果研究[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2012,28(19):12-16.

[22] CHEN Y P, REKHA P D, ARUN A B, et al. Phosphate solubilizing bacteria from subtropical soil and their tricalcium phosphate solubilizing abilities [J]. Applied Soil Ecology, 2006,34(1):33-41.

[23] KUCEY R M N. Phosphate-solubilizing bacteria and fungi in various cultivated and virgin Alberta soils [J]. Canadian Journal of Soil Science, 1983,63(4):671-678.

[24] 柯春亮,陳宇豐,周登博,等.香蕉根際土壤解磷細(xì)菌的篩選、鑒定及解磷能力[J].微生物學(xué)通報(bào),2015,42(6):1 032-1 042.

[25] 覃麗金,王真輝,陳秋波.根際解磷微生物研究進(jìn)展[J].華南熱帶農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2006,12(2):44-49.

[26] 王富民,張彥,吳皓瓊,等.解磷固氮菌劑的研制及其對(duì)小麥的增產(chǎn)效應(yīng)[J].生物技術(shù),1994,4(4):15-18.

[27] 趙小蓉,孫焱鑫.細(xì)菌解磷能力測(cè)定方法的研究[J].微生物學(xué)通報(bào),2001,28(1):1-4.

[28] 陳陽,朱天輝,樸春根,等.解磷芽孢桿菌的篩選及其解磷能力的測(cè)定[J].貴州林業(yè)科技,2008,36(2):17-24.

[29] 李蓉,周德明,吳毅,等.杉木根際溶磷菌篩選及其部分特性的初步研究[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào),2012,32(4):95-99.

[30] 喬志偉,洪堅(jiān)平,謝英荷,等.石灰性土壤拉恩式溶磷細(xì)菌的篩選鑒定及溶磷特性[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào),2013,24(8):2 294-2 300.

[31] 賀夢(mèng)醒,高毅,胡正雪,等.解磷菌株B25的篩選、 鑒定及其解磷能力[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào),2012,23(1):235-239.

(責(zé)任編輯:施曉棠)

Isolation, screening of phosphate solubilizing capacity of phosphate solubilizing bacteria inEucalyptusspecies

XU Huan1,2, YU Xinling1,2, LIN Yongming1,2, WU Chengzhen1,2,3,XIE Anqiang1,2, CHEN Can1,2, LI Jian1,2, HONG Tao1,2

(1.College of Forestry, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China; 2.Key Lab for Forest Ecosystem Processes and Management in Fujian Province, Fuzhou, Fujian 350002, China; 3.College of Ecology and Resources Engineering, Wuyi Universiy, Nanping, Fujian 354300, China)

To develop microbial compound fertilizer forEucalyptusplantation, rhizosphere phosphorus (P) bacteria were separated and selected from the soil ofEucalyptussalignai,E.DunniiandE.urophglla×grandisby selective medium. Then strains with most stable solubilizing capacity were further screened. Results showed that there existed about 2.23×104～4.17×104cfu·g-1organic phosphate-solubilizing bacteria and 2.05×104～4.00×104cfu·g-1inorganic phosphate -solubilizing bacteria in 3 kinds of forest soils. The quantity of bacteria from different stands in a descending order wasEucalyptussaligna,E.urophglla×E.grandisandE.Dunnii. Phosphate solubilizing capacities varied significantly among 12 strains of organic phosphate-solubilizing bacteria and 14 strains of inorganic phosphate-solubilizing bacteria (P<0.05), with available P absorbed by inorganic phosphate-solubilizing bacteria ranging from 55.854 to 367.169g·mL-1, and available P dissolved by organic phosphate-solubilizing bacteria ranging from 11.374 to 30.330g·mL-1. There was significantly negative relationship between pH of culture solution and the content of inorganic P solubilized by inorganic phosphate-solubilizing bacteria, though pH was not correlated with the content of organic P dissolved by organic phosphate-solubilizing bacteria. Among 26 strains, strain P7 demonstrated the highest capacity in solubilizing inorganic P and strain YP8 was the most efficient in dissolving organic P, which were recommended as microbial fertilizer forEucalyptusspecies.

Eucalyptus; phosphate solubilizing bacteria; phosphate solubilizing capacity; available phosphorous

2016-03-08

2016-04-18

福建省科技廳重大專項(xiàng)項(xiàng)目(2012NZ01)；教育部博士點(diǎn)學(xué)科專項(xiàng)基金資助項(xiàng)目(20123515110011).

徐歡(1992-)，女，碩士研究生.研究方向：森林生態(tài).Email:a357766714@qq.com.通訊作者吳承禎(1970-)，男，教授.研究方向：森林經(jīng)營(yíng)和森林生態(tài).Email:fjwcz@126.com.

S718.81

A

1671-5470(2016)05-0529-07

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2016.05.009