位庚，劉紅利，李紅蓉，馬柳一，尹玉潔，姚兵，賈振華

通心絡(luò)對(duì)同型半胱氨酸誘導(dǎo)大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的干預(yù)作用及氧化應(yīng)激機(jī)制研究

位庚，劉紅利，李紅蓉，馬柳一，尹玉潔，姚兵，賈振華

目的：探討通心絡(luò)對(duì)同型半胱氨酸誘導(dǎo)大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的干預(yù)作用及氧化應(yīng)激機(jī)制。

方法：采用植塊法原代培養(yǎng)大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)并通過(guò)CD31免疫熒光法對(duì)培養(yǎng)的大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行辨別、鑒定。用同型半胱氨酸（Hcy）建立細(xì)胞損傷模型，實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、同型半胱氨酸組、通心絡(luò)低濃度組、通心絡(luò)中濃度組、通心絡(luò)高濃度組。分別檢測(cè)各組細(xì)胞的存活率、細(xì)胞上清液中超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量、細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平、內(nèi)皮素-1（ET-1）和內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）表達(dá)水平的變化。

結(jié)果：與對(duì)照組相比，同型半胱氨酸組細(xì)胞存活率降低 ［（74.61±2.88）% vs（100.00±2.07）%］，細(xì)胞上清液中MDA含量升高［（4.10±0.18）nmol/ml vs（1.92±0.10）nmol/ml］，SOD活性降低［（7.55±0.71）U/ml vs（20.77±0.68）U/ml］，細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高［（38.17±10.28）% vs（19.83±2.97）%］，ET-1 mRNA表達(dá)上調(diào)，eNOS蛋白表達(dá)下調(diào)；與同型半胱氨酸組相比，通心絡(luò)各劑量組均能不同程度的改善上述指標(biāo)變化。

結(jié)論：通心絡(luò)能夠改善同型半胱氨酸誘導(dǎo)的大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能損傷，并通過(guò)減輕氧化應(yīng)激損傷發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。

通心絡(luò)；心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞；同型半胱氨酸；內(nèi)皮功能；氧化應(yīng)激

Abstract

Objective: To observe the effect of Tongxinluo （TXL） on homocysteine-induced rat’s cardiac micro vascular endothelial cell（RCMECs） injury and to study the oxidative stress mechanism.

Methods: Primary RCMECs were cultured with tissue explants process， cell morphology was observed by inverted microscope and the cell was identified by CD31 immunofluorescence method. RCMEC injury model was established by Homocysteine （Hcy）induction and the cells were divided into 5 groups: Control group， with normal cells， Hcy group， the cells were treated by Hcy at 10 mmol/L， Low-dose TXL group， Hcy treated cells were cultured with TXL at 100 mg/L， Middle-dose TXL （200 mg/L）group and high-dose TXL （400 mg/L） group. Cell survival rates were detected， supernatant levels of superoxide dismutase （SOD）activity and malondialdehyde （MDA） content were examined， intracellular protein expressions of reactive oxygen species （ROS）and endothelial nitric oxide synthase （eNOS） were detected and mRNA expression of endothelin-1 （ET-1） was measured in different groups respectively.

Results: Compared with Control group， Hcy group showed decreased cell survival rate （74.61 ± 2.88）% vs （100.00 ± 2.07）%， increased supernatant level of MDA （4.10 ± 0.18） nmol/ml vs （1.92 ± 0.10） nmol/ml， reduced SOD activity （7.55 ± 0.71） U/ml vs（20.77 ± 0.68） U/ml， elevated ROS level（38.17 ± 10.28） % vs （19.83 ± 2.97） %， up-regulated mRNA expression of ET-1 and down-regulated protein expression of eNOS. Compared with Hcy group， the above indexes were improved in each TXL group at different levels.

Conclusion: TXL could decrease Hcy induced RCMECs injury， such protection was conducted by reducing the oxidative stress mechanism in cells.

（Chinese Circulation Journal， 2016，31: 908.）

同型半胱氨酸（Homocysteine，Hcy）是誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，它可以通過(guò)誘導(dǎo)血管壁氧化應(yīng)激反應(yīng)而導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙［1］，這可能是Hcy導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制之一。中藥復(fù)方制劑通心絡(luò)在脈絡(luò)學(xué)說(shuō)理論指導(dǎo)下對(duì)心血管疾病的防治具有調(diào)脂、抗氧化、抗炎，改善內(nèi)皮功能、穩(wěn)定易損斑塊等多種作用，臨床療效明顯［2］。我們課題組前期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)了通心絡(luò)可明顯改善Hcy誘發(fā)的血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，可能與其抑制自由基的過(guò)量生成有關(guān)［3］。為了進(jìn)一步觀察通心絡(luò)的保護(hù)機(jī)制，本研究采用Hcy誘導(dǎo)原代培養(yǎng)的大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞（Rat cardiac microvascular endothelial cells，RCMECs）為損傷模型，觀察Hcy對(duì)心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷機(jī)制，并探討通心絡(luò)對(duì)微血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用和作用機(jī)制，以期為動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制研究和臨床治療提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：2周齡SPF級(jí)SD雄性大鼠10 只，體重（30±5）g，由北京富豪實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（京）2011-0012。大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞由大鼠心室肌分離提取，連續(xù)傳4代用于實(shí)驗(yàn)。

藥物及試劑：通心絡(luò)藥粉由石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司提供；內(nèi)皮細(xì)胞（ECM）培養(yǎng)套裝購(gòu)自美國(guó)Sciencell公司；CCK-8細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)測(cè)試盒購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所；丙二醛測(cè)試盒、超氧化物歧化酶測(cè)試盒和活性氧簇測(cè)試盒均購(gòu)自江蘇南京建成生物工程研究所；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）試劑盒購(gòu)自美國(guó)Fermentas公司；CD31抗體、內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）抗體、DyLight 488標(biāo)記的羊抗小鼠IgG抗體購(gòu)自美國(guó)Abcame公司；內(nèi)皮素-1（ET-1）引物購(gòu)自上海生工生物公司。

主要儀器：PrimoVert倒置顯微鏡購(gòu)自德國(guó)Zeiss公司； Operetta高通量高內(nèi)涵細(xì)胞分析系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)PerkinELmer公司；FACSAriaⅢ超速流式細(xì)胞分選系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)BD公司；ABI 7300實(shí)時(shí) PCR 系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)ABI公司；UVP凝膠掃描系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)UVP公司；電轉(zhuǎn)膜儀、半干轉(zhuǎn)膜儀、垂直電泳儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

藥物配制：稱取通心絡(luò)藥粉溶于無(wú)血清ECM培養(yǎng)基，超聲促溶20 min，6500 g，離心10 min，收集上清液，用0.22 μm微孔濾器過(guò)濾除菌，將所得所有沉淀于60℃加熱烘干，計(jì)算實(shí)際溶于無(wú)血清ECM培養(yǎng)基藥物重量，制備成10 mg/ml通心絡(luò)貯存液，分裝后-20℃貯存?zhèn)溆茫?］。

原代大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞分離、培養(yǎng)：采用植塊法分離和培養(yǎng)原代RCMECs，參照文獻(xiàn)［5］的方法提取RCMECs，待細(xì)胞培養(yǎng)至80 %匯合狀態(tài)，以0.25%胰蛋白酶消化傳代，取第2～4代用于實(shí)驗(yàn)。

原代大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞鑒定：首先倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，其次CD31作為微血管內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)志物，它參與了調(diào)節(jié)微血管內(nèi)皮細(xì)胞間的連接穩(wěn)定性和完整性［6］，故本實(shí)驗(yàn)采用細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)RCMECs胞膜上CD31的表達(dá)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定。將原代培養(yǎng)的細(xì)胞消化后，接種于96孔板中，約1～2 d后細(xì)胞生長(zhǎng)鋪滿皿底，棄上清，4%多聚甲醛固定10 min，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）沖洗3次，0.5% Trition X-100 孵育細(xì)胞5 min；磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3次后用封閉液室溫封閉細(xì)胞30 min；加入1:200稀釋的CD31一抗孵育，4 ℃過(guò)夜，DyLight 488標(biāo)記的熒光二抗1:200稀釋室溫避光孵育1 h，甘油封片后高通量高內(nèi)涵細(xì)胞分析系統(tǒng)檢測(cè)CD31表達(dá)。

細(xì)胞分組及處理：（1）對(duì)照組：細(xì)胞正常培養(yǎng)；（2）同型半胱氨酸組：培養(yǎng)液含10 mmol/L Hcy；（3）通心絡(luò)低濃度組：通心絡(luò)預(yù)孵育4 h，終溶液Hcy 10 mmol/L加通心絡(luò)100 mg/L；（4）通心絡(luò)中濃度組：通心絡(luò)預(yù)孵育4 h，終溶液Hcy 10 mmol/L加通心絡(luò)200 mg/L；（5）通心絡(luò)高濃度組：通心絡(luò)預(yù)孵育4 h，終溶液Hcy 10 mmol/L加通心絡(luò) 400 mg/L。

CCK-8法檢測(cè)大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞存活率［7］：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RCMECs以1.0×108/L的細(xì)胞濃度接種于96孔培養(yǎng)板中，每組3個(gè)復(fù)孔，每孔加入100 μl 細(xì)胞懸液培養(yǎng)24 h 后用于實(shí)驗(yàn)。5組細(xì)胞于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育24 h，吸棄培養(yǎng)基，加入含有CCK-8的無(wú)血清培養(yǎng)基100 μl（CCK-8溶液：無(wú)血清培養(yǎng)基=1：10），37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育1 h， 酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處光密度（OD）值。以對(duì)照組OD值作為參照，以其他各組OD值與對(duì)照組OD值比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

羥胺法及TBA法檢測(cè)細(xì)胞上清中超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量［8］：藥物相應(yīng)處理細(xì)胞24 h后收集細(xì)胞上清液，羥胺法檢測(cè)SOD活性，于波長(zhǎng)550 nm處，雙蒸水調(diào)零，酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值，按說(shuō)明書上給出的公式計(jì)算出SOD活性；TBA法檢測(cè)MDA含量，于532 nm處，雙蒸水調(diào)零，酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值，按說(shuō)明書上給出的公式計(jì)算出MDA含量，實(shí)驗(yàn)操作步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行。

流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞中活性氧（ROS）水平：藥物相應(yīng)處理細(xì)胞24 h后棄去上清，PBS清洗細(xì)胞兩次，按照1:10000濃度用無(wú)血清ECM培養(yǎng)基稀釋DCFH-DA，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育30 min，0.25%的胰酶消化2 min，加入培養(yǎng)基終止消化，制成細(xì)胞懸液，350 g離心5 min收集細(xì)胞，用PBS洗滌細(xì)胞2次后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)皮素-1（ET-1）mRNA的表達(dá)：各組細(xì)胞相應(yīng)處理24 h后，Trizol試劑提取總RNA。用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA完整性及純度，并用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶系統(tǒng)和隨機(jī)引物逆轉(zhuǎn)錄。以β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）作為內(nèi)參照基因，分別與各組相比，得到目的基因表達(dá)的相對(duì)定量值（RQ值），將RQ值用于統(tǒng)計(jì)分析，引物序列見表1。

表1　引物序列

蛋白免疫印跡（Western blot）法檢測(cè)細(xì)胞eNOS蛋白的表達(dá)：各組細(xì)胞相應(yīng)處理24 h后，將細(xì)胞充分裂解，超聲破碎后蛋白定量，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干轉(zhuǎn)膜后封閉，與eNOS一抗結(jié)合，4℃過(guò)夜，與二抗結(jié)合，化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內(nèi)參，以各目的蛋白灰度值與GAPDH灰度值的比值進(jìn)行分析。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組間比較用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)及鑒定結(jié)果（圖1）

植塊法分離的RCMECs培養(yǎng)至第2～3天時(shí)，可見未融合狀態(tài)下單個(gè)微血管內(nèi)皮細(xì)胞呈梭形、星型或多角形，去除組織塊繼續(xù)培養(yǎng)至第5天時(shí)，可見細(xì)胞匯合成鋪路石樣。CD31免疫熒光鑒定結(jié)果顯示所提取的大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞純度大于95%。

圖1　 大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)及鑒定結(jié)果（×200）

2.2通心絡(luò)對(duì)同型半胱氨酸損傷大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞存活率的影響（表2）

與對(duì)照組比較，同型半胱氨酸組細(xì)胞存活率顯著降低（P＜0.01）；與同型半胱氨酸組比較，通心絡(luò)高濃度組細(xì)胞存活率顯著增高（P＜0.01）。

2.3通心絡(luò)對(duì)同型半胱氨酸損傷大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞上清液SOD活性和MDA含量的影響（表2）

與對(duì)照組比較，同型半胱氨酸組細(xì)胞上清液SOD活性降低（P＜0.01），MDA含量升高（P＜0.01）；與同型半胱氨酸組相比，通心絡(luò)低濃度組、通心絡(luò)中濃度組及通心絡(luò)高濃度組細(xì)胞上清液SOD活性升高（P＜0.01），通心絡(luò)中濃度組及通心絡(luò)高濃度組細(xì)胞上清液MDA含量降低（P＜0.01）；與通心絡(luò)低濃度組比較，通心絡(luò)高濃度組細(xì)胞上清液SOD活性升高（P＜0.05），通心絡(luò)中濃度組及通心絡(luò)高濃度組細(xì)胞上清液MDA含量降低（P＜0.01）；與通心絡(luò)中濃度組比較，通心絡(luò)高濃度組細(xì)胞上清液MDA含量降低（P＜0.01）。

2.4通心絡(luò)對(duì)同型半胱氨酸損傷大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞ROS水平的影響（表2、圖2）

流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧探針DCFH-DA熒光強(qiáng)度，在以下流式結(jié)果圖中，X軸代表了相對(duì)熒光強(qiáng)度，Y軸代表了細(xì)胞數(shù)目，所以峰值越靠右，則表明了在相同數(shù)目（10 000個(gè)）的細(xì)胞樣本中熒光強(qiáng)度越大，而P2門的位置是固定的，所以P2門中樣本的比例越大，則代表熒光強(qiáng)度越高。與對(duì)照組比較，同型半胱氨酸組ROS熒光強(qiáng)度升高（P＜0.05）；與同型半胱氨酸組比較，通心絡(luò)高濃度組ROS熒光強(qiáng)度降低（P＜0.05）。

表2　各組大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞存活率、細(xì)胞上清液超氧化物歧化酶活性、丙二醛含量及細(xì)胞內(nèi)活性氧水平比較（n=3，±s）

表2　各組大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞存活率、細(xì)胞上清液超氧化物歧化酶活性、丙二醛含量及細(xì)胞內(nèi)活性氧水平比較（n=3，±s）

注：與對(duì)照組比較*P＜0.05，**P＜0.01；與同型半胱氨酸組比較△P＜0.05，△△P＜0.01；與通心絡(luò)低濃度組比較▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與通心絡(luò)中濃度組比較#P＜0.01

活性氧（%）對(duì)照組　100.00±2.07　20.77±0.68　1.92±0.10　19.83±2.97同型半胱氨酸組　74.61±2.88**　7.55±0.71**　4.10±0.18**　38.17±10.28*通心絡(luò)低濃度組　82.11±7.84　17.31±1.29△△　3.90±0.15　33.83±9.41通心絡(luò)中濃度組　83.10±7.19　19.11±1.30△△　3.50±0.16△△▲▲　30.90±9.83通心絡(luò)高濃度組　90.03±3.59△△　19.64±0.89△△▲　2.26±0.13△△▲▲#　22.50±3.66△組別　　存活率（%）超氧化物歧化酶（U/ml）丙二醛（nmol/ml）

圖2　流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞活性氧熒光強(qiáng)度

2.5通心絡(luò)對(duì)同型半胱氨酸損傷大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞ET-1 mRNA表達(dá)的影響（表3）

與對(duì)照組比較，同型半胱氨酸組ET-1 mRNA表達(dá)升高（P＜0.01）；與同型半胱氨酸組比較，通心絡(luò)低濃度組、通心絡(luò)中濃度組及通心絡(luò)高濃度組ET-1 mRNA表達(dá)降低（P＜0.01）。

表3　各組大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)皮素-1 mRNA及內(nèi)皮型一氧化氮合酶蛋白表達(dá)比較

表3　各組大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)皮素-1 mRNA及內(nèi)皮型一氧化氮合酶蛋白表達(dá)比較

注：eNOS： 內(nèi)皮型一氧化氮合酶；GAPDH： 甘油醛-3-磷酸脫氫酶。與對(duì)照組比*P＜0.01；與同型半胱氨酸組比較△P＜0.01；與通心絡(luò)低濃度組比較▲P＜0.01；與通心絡(luò)中濃度組比較#P＜0.05

組別　　內(nèi)皮素-1 mRNA　eNOS灰度值/GAPDH灰度值對(duì)照組　1.03±0.19　0.74±0.03同型半胱氨酸組　3.33±0.62*　0.21±0.03*通心絡(luò)低濃度組　1.71±0.24△　0.35±0.03△通心絡(luò)中濃度組　1.44±0.23△　0.43±0.03△▲通心絡(luò)高濃度組　1.21±0.21△　0.48±0.02△▲#

2.6通心絡(luò)對(duì)同型半胱氨酸損傷大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞eNOS蛋白表達(dá)的影響（表3、圖3）

與對(duì)照組比較，同型半胱氨酸組eNOS蛋白表達(dá)降低（P＜0.01）；與同型半胱氨酸組比較，通心絡(luò)低濃度組、通心絡(luò)中濃度組及通心絡(luò)高濃度組eNOS蛋白表達(dá)升高（P＜0.01）；與通心絡(luò)低濃度組比較，通心絡(luò)中濃度組及通心絡(luò)高濃度組eNOS蛋白表達(dá)升高（P＜0.01）；與通心絡(luò)中濃度組比較，通心絡(luò)高濃度組eNOS蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）。

圖3　 各組大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)皮型一氧化氮合酶蛋白表達(dá)水平蛋白免疫印跡圖

3　討論

目前的研究認(rèn)為內(nèi)皮細(xì)胞損傷是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的始動(dòng)因素之一，Hcy是動(dòng)脈粥樣硬化形成的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，它可以引起血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激，炎癥反應(yīng)，使血管內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂，促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖等［9，10］。通心絡(luò)是在中醫(yī)絡(luò)病理論指導(dǎo)下研制而成的中藥復(fù)方制劑，主要由人參、全蝎、水蛭、土鱉蟲、蟬蛻、降香、冰片等中藥組成，具有益氣、活血、化瘀通絡(luò)等功效。通心絡(luò)已廣泛用于心腦血管疾病的治療，大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)其對(duì)于微血管具有明顯的保護(hù)作用，在保護(hù)微血管內(nèi)皮細(xì)胞及其功能方面更顯示出其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)［11，12］。我們前期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)通心絡(luò)可以抑制自由基的過(guò)量生成改善Hcy誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷，而且通心絡(luò)能導(dǎo)致Hcy損傷的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的基因表達(dá)譜改變，這些基因改變可能參與了細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激等過(guò)程［13］。所以本研究通過(guò)Hcy誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的RCMECs損傷，用通心絡(luò)進(jìn)行藥物干預(yù)，進(jìn)一步探討其保護(hù)微血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用及氧化應(yīng)激機(jī)制。

一氧化氮（NO）為內(nèi)皮細(xì)胞合成的主要舒血管物質(zhì)，參與維持血管的正常張力、抑制血小板黏附，防止血栓的形成，發(fā)揮積極的心血管保護(hù)作用。它的前體是L-精氨酸，由一氧化氮合酶催化合成，NOS有三種類型，內(nèi)皮細(xì)胞中存在的是eNOS。Hcy可抑制eNOS的合成和活性，抑制L-精氨酸的轉(zhuǎn)運(yùn)，導(dǎo)致eNOS的脫偶聯(lián)，從而減少NO的生成。ET具有強(qiáng)烈的收縮血管作用，主要由內(nèi)皮細(xì)胞合成和釋放，其表達(dá)的異常及伴隨的內(nèi)皮功能障礙是血管病理學(xué)的一個(gè)重要早期事件。生理狀態(tài)下，內(nèi)皮細(xì)胞分泌的舒血管物質(zhì)和縮血管物質(zhì)在局部維持一定的濃度比，互相制約，保持動(dòng)態(tài)平衡。當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞受到損傷時(shí)，其分泌的舒血管因子就會(huì)減少，縮血管因子增多，可誘發(fā)高血壓、AS等疾病。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)Hcy損傷后，RCMECs的eNOS蛋白表達(dá)下調(diào)，同時(shí)ET-1 mRNA表達(dá)上調(diào)，ET/NO間的動(dòng)態(tài)平衡被破壞，可引起內(nèi)皮細(xì)胞的舒縮功能發(fā)生障礙。通心絡(luò)各給藥組干預(yù)后，eNOS蛋白表達(dá)上調(diào)，ET-1 mRNA表達(dá)下調(diào)，均以通心絡(luò)高濃度組改善效果最佳，且呈劑量依賴性，表明通心絡(luò)能夠從基因和蛋白水平有效改善Hcy誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙。

Hcy代謝過(guò)程中產(chǎn)生過(guò)氧化氫自由基、羥自由基，而誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)，降低內(nèi)皮細(xì)胞NO釋放，減弱內(nèi)皮依賴性的血管舒張反應(yīng)［14］，所以Hcy可通過(guò)其誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激介入AS的病理生理過(guò)程，并可以加劇內(nèi)皮細(xì)胞的功能障礙。SOD是清除自由基的主要防御酶，能清除超氧陰離子自由基（O2-·）保護(hù)細(xì)胞免受損傷［15］，其活力的高低間接反應(yīng)了機(jī)體清除氧自由基的能力，而MDA是細(xì)胞被自由基攻擊，經(jīng)細(xì)胞壁破裂和細(xì)胞膜脂降解形成的最終裂解產(chǎn)物，間接反應(yīng)了機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度［16］，ROS是氧元素在體內(nèi)氧化還原反應(yīng)的產(chǎn)物，其表達(dá)量過(guò)多導(dǎo)致的氧化應(yīng)激可直接導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞的氧化損傷和功能障礙，ROS還作為信號(hào)分子放大和疊加損傷作用［17，18］，所以三者聯(lián)合檢測(cè)可更好的反映氧化應(yīng)激程度。本研究結(jié)果顯示，Hcy組細(xì)胞上清中MDA含量及ROS水平升高，細(xì)胞上清中SOD活性降低，表明Hcy誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷存在著明顯的氧化應(yīng)激反應(yīng)。通心絡(luò)不同濃度干預(yù)后，細(xì)胞上清中SOD活性和MDA含量及細(xì)胞中ROS水平均有不同程度的改善，其中通心絡(luò)高劑量組改善作用最為明顯。

［1］ Bellamy MF， McDowell IF， Ramsey MW， et al. Hyperhomocysteinemia after an oral methionine load acutely impairs endothelial function in healthy adults. Circulation， 1998， 98: 1848-1852.

［2］ 劉紅利， 郎艷松， 王宏濤. 通心絡(luò)膠囊治療心血管疾病研究進(jìn)展.中國(guó)新藥雜志， 2014， 23: 1769-1772.

［3］ 梁俊清， 吳以嶺， 徐海波， 等. 同型半胱氨酸對(duì)血管內(nèi)皮功能的影響及通心絡(luò)超微粉的干預(yù)作用. 中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志， 2008， 24: 66-70.

［4］ 李紅蓉， 位庚， 孫穎， 等. 通絡(luò)藥物對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞與單核細(xì)胞黏附作用的影響. 中國(guó)循環(huán)雜志， 2016， 31: 480-483.

［5］ Nishida M， Carley WW， Gerritsen ME， et al. Isolation and characterization of human and rat cardiac microvascular endothelial cells. Am J Physiol， 1993， 264: H639-652.

［6］ Mei H， Campbell JM， Paddock CM， et al. Regulation of endothelial cell barrier function by antibody-driven affinity modulation of platelet endothelial cell adhesion molecule-1 （PECAM-1）. J Biol Chem， 2014，289: 20836-20844.

［7］ 曹娜， 葛力萁， 程明月， 等. 阿托伐他汀通過(guò) SIRT1/NADPH 氧化酶對(duì)抗高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的氧化損傷作用. 中國(guó)循環(huán)雜志， 2014， 29: 1000-1004.

［8］ 龐潔， 梁俊清， 王志鑫， 等. 津力達(dá)聯(lián)合通心絡(luò)對(duì)高糖誘導(dǎo)胰島微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷干預(yù)作用及機(jī)制研究. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)， 2015，31: 430-435.

［9］ 王生蘭， 劉輝琦， 曹學(xué)鋒， 等. 同型半胱氨酸促進(jìn)大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖和表型轉(zhuǎn)化. 中國(guó)病理生理雜志， 2010， 26: 1321-1324.

［10］ Han S， Wu H， Li W， et al. Protective effects of genistein in homocysteine-induced endothelial cell inflammatory injury. Mol Cell Biochem， 2015， 403: 43-49.

［11］ 吳以嶺， 袁國(guó)強(qiáng)， 游佳華， 等. 通心絡(luò)超微粉對(duì)高脂飲食兔主動(dòng)脈內(nèi)皮保護(hù)機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究. 中國(guó)病理生理雜志， 2007， 23: 629-633.

［12］ Cui H， Li X， Li N， et al. Induction of autophagy by Tongxinluo through the MEK/ERK pathway protects human cardiac microvascular endothelial cells from hypoxia/reoxygenation injury. J Cardiovasc Pharmacol， 2014， 64: 180-190.

［13］ 陳燕銘， 吳琳， 劉勇， 等. 通心絡(luò)對(duì)同型半胱氨酸損傷的內(nèi)皮細(xì)胞的基因表達(dá)譜的影響. 中國(guó)病理生理雜志， 2011， 27: 42-47.

［14］ Stanger O， Weger M. Interactions of homocysteine， nitric oxide， folate and radicals in the progressively damaged endothelium. Clin Chem Lab Med， 2003， 41: 1444-1454.

［15］ Ye N， Liu S， Lin Y， et al. Protective effects of intraperitoneal injection of TAT-SOD against focal cerebral ischemia/reperfusion injury in rats. Life Sci， 2011， 89: 868-874.

［16］ Duryee MJ， Klassen LW， Schaffert CS， et al. Malondialdehydeacetaldehyde adduct is the dominant epitope after MDA modification of proteins in atherosclerosis. Free Radical Bio Med， 2010， 49: 1480-1486.

［17］ Case J， Ingram DA， Haneline LS. Oxidative stress impairs endothelial progenitor cell function. Antioxid Redox Sign， 2008， 10: 1895-1907.

［18］ Ingram DA， Krier TR， Mead LE， et al. Clonogenic endothelial progenitor cells are sensitive to oxidative stress. Stem Cells， 2007， 25: 297-304.

Effect of Tongxinluo on Homocysteine-induced Rat’s Cardiac Micro Vascular Endothelial Cell Injury and the Oxidative Stress Mechanism

WEI Geng， LIU Hong-li， LI Hong-rong， MA Liu-yi， YIN Yu-jie， YAO Bing， JIA Zhen-hua.
Graduate School of Hebei Medical University， Shijiazhuang （050017）， Hebei， China
Corresponding Author: JIA Zhen-hua， Email: jiatcm@163.com

Tongxinluo； Cardiac micro vascular endothelial cells； Homocysteine； Endothelial function； Oxidative stress

2016-04-05 ）

（編輯:許菁）

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（973計(jì)劃）（2012CB518606）

050017 河北省石家莊市，河北醫(yī)科大學(xué) 研究生學(xué)院

位庚 主治醫(yī)師 博士 主要從事心血管疾病的研究 Email：weigengtcm@163.com 通訊作者：賈振華 Email：jiatcm@163.com

R54

A

1000-3614（2016）09-0908-05 doi:10.3969/j.issn.1000-3614.2016.09.019