劉秋玲，龔志華，陳凌，劉遵瑩，鄧燕莉，陳棟，肖文軍,3*

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L-茶氨酸對產(chǎn)腸毒性大腸桿菌引起的免疫應(yīng)激小鼠肝臟的保護(hù)作用研究

劉秋玲1,2，龔志華1,2，陳凌1,2，劉遵瑩1,2，鄧燕莉1,2，陳棟1，肖文軍1,2,3*

1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長沙410128；2. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)國家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南長沙410128；3. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)湖南省植物功能成分利用協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南長沙410128

以SPF級Balb/c雌性小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，對其適應(yīng)性飼養(yǎng)3?d后連續(xù)30?d灌喂不同劑量L-茶氨酸，然后腹腔注射產(chǎn)腸毒性大腸桿菌E44813誘導(dǎo)免疫應(yīng)激，5?h后取樣，分析研究了各組小鼠肝臟與脾臟系數(shù)，血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（Alanine aminotranferease, ALT）與谷草轉(zhuǎn)氨酶（Aspartate aminotransferase, AST）含量，肝組織勻漿丙二醛（Malondialdehyde, MDA）水平與谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase, GSH-PX）、過氧化氫酶（Catalase, CAT）、超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase, SOD）活性，肝組織病理學(xué)變化，以及血清中γ-干擾素（γ-Interferon, IFN-γ）、白細(xì)胞介素-4（Interleukin-4, IL-4）的表達(dá)量，以探明L-茶氨酸對產(chǎn)腸毒性大腸桿菌免疫應(yīng)激小鼠肝臟的保護(hù)作用。結(jié)果表明，不同劑量的茶氨酸干預(yù)處理均能明顯降低由大腸桿菌E44813感染引起的肝臟、脾臟系數(shù)的升高，降低血清ALT、AST及肝組織勻漿MDA水平，提高肝組織勻漿SOD、CAT、GSH-PX活性，減少IFN-γ、IL-4表達(dá)量，改善肝臟組織病理損傷，其中以300?mg·kg-1劑量組效果最好，說明茶氨酸干預(yù)對產(chǎn)腸毒性大腸桿菌誘導(dǎo)的免疫應(yīng)激小鼠肝損傷具有保護(hù)作用，而且可能是通過減少IFN-γ與IL-4的表達(dá)、降低炎癥反應(yīng)、提高抗氧化能力等途徑達(dá)到保護(hù)肝臟的作用。

L-茶氨酸；產(chǎn)腸毒性大腸桿菌E44813；免疫應(yīng)激；肝臟保護(hù)

大腸埃希菌（），俗稱大腸桿菌，存在于人和動(dòng)物腸道，屬正常菌叢。當(dāng)宿主免疫力下降或大腸桿菌侵入腸外組織時(shí)，可引起腸外感染。產(chǎn)腸毒性大腸桿菌（ETEC），是發(fā)展中國家嬰幼兒及旅游者腹瀉的主要病原菌，由食入被污染的食物或水而感染，主要居留于小腸近端，產(chǎn)生腸毒素而致病，也可引起家畜和動(dòng)物大腸桿菌?。–olibacillosis）或腹瀉[1]。全球每年因ETEC感染的病例高達(dá)6.5億人次以上，導(dǎo)致30萬至50余萬5歲以下兒童死亡[2-3]。ETEC引起的動(dòng)物疾病同樣嚴(yán)重影響全球畜牧業(yè)生產(chǎn)和發(fā)展[4]。多年來，復(fù)合抗生素的使用在一定程度上能夠治療大腸桿菌感染引起的疾病，同時(shí)也導(dǎo)致多種耐藥性ETEC菌株不斷產(chǎn)生并迅速傳播擴(kuò)散，造成抗生素低效并在動(dòng)物體內(nèi)的蓄積，引發(fā)機(jī)體抵抗力下降，易繼發(fā)或并發(fā)多種疾病，因此毒副作用小、不易產(chǎn)生耐藥性的生物活性物質(zhì)的開發(fā)利用是未來預(yù)防和防治大腸桿菌感染的重要趨勢。

L-茶氨酸是茶葉中特征性游離氨基酸，具有增強(qiáng)抗腫瘤藥物藥效[5-8]、增強(qiáng)記憶[9]、抗衰老[10]、緩解抑郁[11-12]、保護(hù)心腦血管[13-14]、抗疲勞[15]、降壓安神[16]等多種生物活性，已被人們廣泛認(rèn)可。肝臟是機(jī)體物質(zhì)與能量代謝的重要器官，同時(shí)也是重要的免疫器官，在抵抗細(xì)菌感染方面具有重要作用，有研究表明L-茶氨酸對酒精性肝損傷具有一定的保護(hù)作用[17]，但對免疫性肝損傷的保護(hù)作用未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究以SPF級Balb/c雌性小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，采用L-茶氨酸預(yù)防干預(yù)，再腹腔注射產(chǎn)腸毒性大腸桿菌E44813，研究L-茶氨酸對產(chǎn)腸毒性大腸桿菌免疫應(yīng)激小鼠肝臟的保護(hù)作用，為Ｌ-茶氨酸的深層開發(fā)利用及臨床大腸桿菌感染病的防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器設(shè)備

1.1.1材料

L-茶氨酸：純度≥98%，購于德國sigma試劑公司。

產(chǎn)腸毒性大腸桿菌E44813菌種：由國家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心保存。

1.1.2試劑

干擾素-γ（IFN-γ）ELISA試劑盒、白細(xì)胞介素4（IL-4）ELISA試劑盒購于武漢華美生物工程有限公司。

天門冬氨酸轉(zhuǎn)移酶（AST）、丙氨酸轉(zhuǎn)移酶（ALT）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）、過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

1.1.3儀器設(shè)備

多功能酶標(biāo)儀（賽默飛世爾上海儀器有限公司），MIKRO22R 型臺(tái)式冷凍離心機(jī)（德國 Hettich 公司），紫外分光光度計(jì)UV-2550（日本島津公司），壓力蒸汽滅菌鍋（上海中安醫(yī)療器械廠），電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）。

1.2 方法

1.2.1動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

SPF級Balb/c雌性小鼠，每只小鼠體質(zhì)量（21±2）g，購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，飼料亦購于該公司，飼養(yǎng)條件為：環(huán)境溫度20~25℃，相對濕度50%~70%，12?h光照。小鼠購回后于動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)3?d，期間自由飲水進(jìn)食。

小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)結(jié)束后，隨機(jī)分成6組，即正常對照組、免疫應(yīng)激模型組、地塞米松給藥組（5?mg·kg-1），以及L-茶氨酸低（100?mg·kg-1）、中（300?mg·kg-1）、高（500?mg·kg-1）劑量組，每組10只。L-茶氨酸和地塞米松用生理鹽水配制成相應(yīng)濃度，空白對照組和模型組灌喂等量生理鹽水，各組小鼠于每日定時(shí)接受灌喂，灌喂量為每只0.3?mL，連續(xù)灌喂30?d。最后一次灌喂結(jié)束后禁食12?h，除空白對照組以外，其余各組小鼠腹腔注射大腸桿菌E44813（0.6×108cfu·mL-1）0.02?mL·g-1，5?h后摘眼球取血，并解剖取肝臟、脾臟。

1.2.2臟器指數(shù)測定

將肝臟、脾臟于4℃生理鹽水洗凈血漬，濾紙吸干表面水分后稱重。

計(jì)算方法：肝臟（脾臟）指數(shù)=肝臟（脾臟）質(zhì)量/小鼠體質(zhì)量×100%

1.2.3肝組織病理學(xué)觀察

剪取肝臟右葉同一部位經(jīng)10%甲醛固定24?h，石蠟包埋切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織病理改變。

1.2.4血清ALT、AST、IFN-γ、IL-4測定

各組小鼠摘眼球取血，在冰上靜置2?h，3?000?r·min-14℃離心10?min，取上清液，嚴(yán)格按試劑盒說明書步驟操作檢測血清ALT、AST水平。同時(shí)嚴(yán)格按ELISA試劑盒說明書檢測IFN-γ、IL-4表達(dá)量。

1.2.5肝組織勻漿MDA、SOD、GSH-Px、CAT的測定

取凍存組織，液氮研磨，加預(yù)冷生理鹽水制備10%的肝勻漿，嚴(yán)格按試劑盒說明書步驟操作檢測肝臟MDA、SOD、GSH-Px、CAT水平。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)方差分析，各組間采用最小顯著差數(shù)法（LSD）檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，<0.05表明有顯著性差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠體征觀察結(jié)果

產(chǎn)腸毒性大腸桿菌E44813腹腔注射小鼠后，各組小鼠生理狀況表現(xiàn)出一定的差異，ETEC模型組小鼠表現(xiàn)為弓背、皮毛蓬松易脫落，呼吸緩慢，行動(dòng)遲緩，精神萎靡，嗜睡，大便稀稠帶白色粘液及血跡；而L-茶氨酸各劑量組及地塞米松組小鼠亦出現(xiàn)上述癥狀及體征，但均有所減輕，且以300 mg·kg-1L-茶氨酸劑量組上述癥狀最輕。

2.2 L-茶氨酸對免疫應(yīng)激模型小鼠肝臟、脾臟指數(shù)的影響

L-茶氨酸對試驗(yàn)各組小鼠肝臟、脾臟指數(shù)的影響結(jié)果見表1。從表中可以看出，與正常對照組相比，模型組小鼠肝臟、脾臟指數(shù)顯著升高（<0.01）；L-茶氨酸各劑量處理組和地塞米松組均能顯著降低大腸桿菌E44813引起的肝臟、脾臟指數(shù)升高（<0.05或<0.01）。

表1 L-茶氨酸對各組小鼠肝臟、脾臟指數(shù)的影響（n=10）

注：與正常組比較，##：<0.01；與模型組比較，*：<0.05，**：<0.01。下同。

Note: Compared with normal group, ##:<0.01. Compared with model group: *:<0.05, **:<0.01. The same below.

2.3 L-茶氨酸對免疫應(yīng)激模型小鼠肝臟病理的影響

經(jīng)HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織的病變情況，結(jié)果如圖1所示。正常組小鼠肝組織肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝索排列整齊，以中央靜脈為中心向四周呈放射狀，核膜清晰核仁明顯；模型組肝組織損傷嚴(yán)重，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，小葉內(nèi)有大量空泡狀病變，伴中性粒細(xì)胞單核細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤；地塞米松組和L-茶氨酸各劑量組僅有少量炎癥細(xì)胞浸潤及小空泡，說明其均能減輕大腸桿菌引起的肝臟組織病變范圍與程度。

注：a：正常組；b：模型組；c：茶氨酸低劑量組；d：茶氨酸中劑量組；e：茶氨酸高劑量組；f：地塞米松組。

2.4 L-茶氨酸對免疫應(yīng)激模型小鼠血清ALT、AST的影響

ALT、AST是目前臨床上常用的肝細(xì)胞損傷生化指標(biāo)，當(dāng)肝臟發(fā)生損傷時(shí)血清中ALT、AST顯著升高。由表2可知，與正常對照組比較，模型組小鼠血清ALT、AST含量顯著升高（<0.01），表明產(chǎn)腸毒性大腸桿菌感染嚴(yán)重?fù)p傷肝臟；茶氨酸各劑量組和地塞米松組均能明顯降低產(chǎn)腸毒性大腸桿菌E44813引起的小鼠血清ALT、AST的升高（<0.01），減輕肝損傷，其中以L-茶氨酸中劑量組效果最佳。

表2 L-茶氨酸對各組小鼠血清ALT、AST的影響（n=10）

2.5 L-茶氨酸對免疫應(yīng)激模型小鼠血清IFN-γ、IL-4表達(dá)量的影響

由表3可以看出，與正常對照組比較，模型組小鼠血清促炎因子IFN-γ和抗炎因子IL-4表達(dá)顯著升高（<0.01），說明炎癥反應(yīng)劇烈；L-茶氨酸各劑量組和地塞米松組均能顯著降低產(chǎn)腸毒性大腸桿菌E44813引起的小鼠血清IFN-γ、IL-4升高（<0.01），減輕炎癥反應(yīng)，其中以L-茶氨酸中劑量組效果最佳。

表3 L-茶氨酸對各組小鼠血清IFN-γ、IL-4的影響（n=10）

2.6 L-茶氨酸對免疫應(yīng)激模型小鼠肝組織勻漿MDA、SOD、GSH-Px、CAT的影響

MDA為脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，間接反映細(xì)胞損傷程度。圖2顯示，與正常對照組比較，模型組小鼠肝組織勻漿MDA顯著升高，SOD、GSH-Px、CAT活性顯著降低（<0.01）；與模型組相比，L-茶氨酸各劑量組和地塞米松組MDA顯著降低（<0.01），SOD、CAT活性顯著升高（<0.01）；與模型組比較，L-茶氨酸低、中劑量組GSH-Px顯著升高（<0.01），L-茶氨酸高劑量組和地塞米松組與模型組比較GSH-Px差異不顯著，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

肝臟作為機(jī)體重要的免疫器官，含有豐富的kupffer細(xì)胞，正常情況下可以清除通過門靜脈進(jìn)入肝臟的微生物、內(nèi)毒素、異種抗原和免疫復(fù)合物等大分子物質(zhì)，從而起到抵御細(xì)菌感染的作用[18]。當(dāng)機(jī)體受到嚴(yán)重創(chuàng)傷、燒傷、感染時(shí)，腸黏膜通透性增高，導(dǎo)致細(xì)菌及細(xì)菌產(chǎn)物易位，由腸腔進(jìn)入門靜脈血流，大量細(xì)菌感染造成肝臟kupffer細(xì)胞的過度激活，一方面釋放大量細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)，產(chǎn)生炎癥級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)肝損傷；另一方面生成大量氧自由基，脂質(zhì)過氧化物堆積，抗氧化酶活性降低，進(jìn)一步使肝損傷加劇，造成肝臟功能衰退，一旦肝臟遭受損傷，機(jī)體整個(gè)免疫系統(tǒng)紊亂，細(xì)菌迅速傳播全身，進(jìn)一步引發(fā)多器官衰竭，甚至死亡[19-20]。因此，提高肝臟免疫力，減輕肝損傷，防止細(xì)菌蔓延是防治大腸桿菌感染的關(guān)鍵。

本研究以產(chǎn)腸毒性大腸桿菌E44813腹腔注射小鼠，注射后各組小鼠生理狀況表現(xiàn)出一定的差異，模型組小鼠表現(xiàn)為弓背、皮毛蓬松易脫落，呼吸緩慢，行動(dòng)遲緩，嗜睡，大便稀稠帶白色粘液及血跡，肝臟病理切片可見出血，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，小葉內(nèi)大量空泡狀病變，伴中性粒細(xì)胞單核細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤等病變，肝臟、脾臟指數(shù)顯著升高，小鼠血清ALT、AST、IFN-γ、IL-4及肝組織勻漿MDA顯著升高，SOD、CAT、GSH-Px活性顯著降低，說明產(chǎn)腸毒性大腸桿菌感染造成小鼠肝臟抗氧化能力下降，炎癥反應(yīng)劇烈，嚴(yán)重?fù)p傷肝臟。L-茶氨酸低、中劑量組及地塞米松給藥組顯著降低了大腸桿菌誘導(dǎo)的ALT、AST、MDA、IFN-γ、IL-4的升高，升高SOD、CAT活性，其中以300 mg·kg-1劑量的L-茶氨酸效果最好，說明L-茶氨酸對免疫應(yīng)激小鼠肝臟保護(hù)作用與減輕體內(nèi)炎癥反應(yīng)、增強(qiáng)肝臟抗氧化能力、減少自由基生成、減輕氧化應(yīng)激損傷密切相關(guān)。

參考文獻(xiàn)

[1] 李中興. 診斷細(xì)菌學(xué)[M]. 香港: 黃河文化出版社, 1992: 286-291.

[2] WHO IRIS. Future directions for research on enterotoxigenicvaccines for developing countries [J]. Wkly Epidemiol Ree, 2006, 8l(11): 97-104.

[3] Qadri F, Svennerholm A M, Faruque A S, et al. Enterotoxigenicin developing countries: epidemiology, microbiology, clinical features, treatment, and prevention [J]. Clin Micribiol Rev, 2005, 18(3): 465-483.

[4] 陳盼霖, 周明旭, 朱國強(qiáng). 產(chǎn)腸毒素大腸桿菌研究進(jìn)展和面臨挑戰(zhàn)[J]. 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2015, 37(10): 813-816.

[5] Qian Liu, Huiying Duan, Jinling Luan, et al. Effects of theanine on growth of human lung cancer and leukemia cells as well as migration and invasion of human lung cancer cells [J]. Cytotechnology, 2009, 59(3): 211-217.

[6] Zhang G, Miura Y, Yakasaki K. Effects of powdered green tea and theanine on tumor growth and endogenous hyperlipidemia in hepatoma-bearing rats [J]. Biosei Biotechnol Biochem, 2002, 66(4): 711-716.

[7] Sugiyama T, Sadzuka Y. Combination of theanine with doxorubicin inhibits hepatic metastasis of M5076 ovarian sarcoma [J]. Clinical Cancer Research, 1999, 5(5): 413-416.

[8] Sadzuka Y, Yamashita Y, Kishimoto S, et al. Glutamate transporter mediated increase of antitumor activity by theanine, an amino acid in green tea [J]. The Pharmaceutical Society of Japan, 2002, 122(11): 995-999.

[9] 雪玲, 程朝輝, 黃才歡, 等. 茶氨酸對小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響[J]. 食品科學(xué), 2004, 25(5): 171-173.

[10] 劉顯明, 李月芬, 李國平. 茶氨酸對D-半乳糖衰老模型小鼠抗衰老作用的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 刨傷外科雜志, 2008, 10(3): 257-259.

[11] Anne L Lardner. Neurobiological effects of the green tea constituent theanine and its potential role in the treatment of psychiatric and neurodegenerative disorders [J]. Nutritional Neuroscience, 2014, 17(4): 145-155.

[12] 彭彬, 劉仲華, 林勇, 等. L-茶氨酸改善慢性應(yīng)激大鼠抑郁行為作用研究[J]. 茶葉科學(xué), 2014, 34(4): 355-363.

[13] 王慶利, 張力軍, 吳明春, 等. 茶氨酸對腦缺血損傷大鼠自由基代謝的影響[J]. 實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志, 2008, 24(11): 1898-1900.

[14] 王玉芬, 秦志祥, 唐振山, 等. 茶氨酸對家兔腦缺血后lL-8和NSE及腦超微結(jié)構(gòu)的影響[J]. 中國醫(yī)師雜志, 2007, 9(1): 4-6.

[15] 王小雪, 邱雋, 宋宇, 等. 茶氨酸的抗疲勞作用研究[J]. 中國公共衛(wèi)生, 2002, 18(3): 315-318.

[16] Yokogoshi H, Mochizuki M, Saitoh K. Theanine-induced reduction of brain serotonin concentration in rats [J]. Bioscience Biotechnology Biochemistry, 1998, 62(4): 816-817.

[17] Li G, Ye Y, Kang J, et al. L-Theanine prevents alcoholic liver injury through enhancing the antioxidant capability of hepatocytes [J]. Food Chem Toxicol, 2012, 50(2): 363-372.

[18] 王寶恩, 張定鳳. 現(xiàn)代肝臟病學(xué)[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 2003, 67-77.

[19] Sakaguchi S, Furusawa S. Oxidative stress and septic shock: metabolic aspects of oxyfen-derived free radicals generated in the liver during endotoxemia [J]. FEMS Immunol Med Microbiol, 2009, 39(9): 167-177.

[20] 蘇磊, 劉志鋒. “腸-肝軸”與膿毒癥[J]. 中華急診醫(yī)學(xué)雜志, 2010, 19(2): 124-125.

Study on the Protective Effect of L-Theanine on the Liver of Mice with Immune Stress Induced by ETEC

LIU Qiuling1,2, GONG Zhihua1,2, CHENG Ling1,2, LIU Zunying1,2, DENG Yanli1,2, CHEN Dong1, XIAO Wenjun1,2,3*

1. Key Lab of Tea Science of Ministry of Education, Changsha 410128, China; 2. National Research Center of Engineering Technology for Utilization of Botanical Functional Ingredients, Changsha 410128, China; 3. Hunan Collaborative Innovation Center for Utilization of Botanical Functional Ingredients, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China

SPF grade Balb/c female mice were used for this experiment. After adaptive feeding for 3?d, the mice were pre-treated orally with different dosages of L-theanine once daily for 30?d. ETEC E44813 intraperitoneal injection was subsequently performed and samples were collected 5h later. The coefficient of liver and spleen, levels of serum alanine aminotranferease (ALT), aspartate aminotransferase (AST) as well as liver homogenate malondialdehyde (MDA), and activities of liver homogenate superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase(GSH-Px), pathological changes of liver, expressions of serum γ-Interferon (IFN-γ) and Interleukin-4 (IL-4) were studied to explore the protective effects of L-theanine on liver of ETEC immune mouse model. Results show that pretreatment with L-theanine significantly reduced the increase of liver and spleen coefficient caused by ETEC infection, lowered the levels of serum ALT, AST and liver homogenate MDA, increased the activities ofliver homogenate SOD, CAT, GSH-Px, decreased the expressions of serum IFN-γ, IL-4, and improved pathological injury of liver tissue. Therefore, it can be concluded that L-theanine is able to prevent ETEC-induced hepatic injury through depressing IFN-γ, IL-4 and inflammatory reaction and enhancing hepatocyte antioxidant abilities.

L-theanine, enterotoxigenicE44813, immune stress, liver protection

Q51；Q939.1

A

1000-369X（2016）05-484-07

2016-01-20

2016-03-21

國家“十二五”科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2011BAD10B00）

劉秋玲，女，碩士研究生，主要從事茶葉功能成分利用研究。

xiaowenjun88@sina.com