張亞真，韋康，王麗鴛，成浩

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基于轉(zhuǎn)錄組測序?qū)Σ铇浠虮磉_(dá)的研究

張亞真，韋康*，王麗鴛，成浩

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所國家茶樹改良中心農(nóng)業(yè)部茶樹生物學(xué)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州 310008

谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（Glutathione-transferases,）在植物體內(nèi)普遍存在，是一類具有多種生物學(xué)功能的超家族蛋白酶。本研究通過對中黃2號、龍井43在正常光照和遮蔭處理下的轉(zhuǎn)錄組測序，篩選獲得了49個(gè)基因家族成員，并對其中19個(gè)在芽葉中表達(dá)量較高的基因進(jìn)行了序列分析和聚類分析。另外對表達(dá)量較高的8個(gè)候選基因進(jìn)行熒光定量表達(dá)分析，研究它們在龍井43不同葉位中的表達(dá)模式。結(jié)果表明這些基因在一芽一葉到第六葉中均有表達(dá)，但各自呈現(xiàn)出不同的變化規(guī)律。在龍井43一芽一葉到第六葉中的表達(dá)量逐漸上升，可能與植物抗脅迫有關(guān)，而的表達(dá)量則顯著下降，可能與花青素代謝有關(guān)。

茶樹；轉(zhuǎn)錄組測序；谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶；表達(dá)分析

谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（）是一類由多基因編碼、具有多種功能的超家族蛋白酶，普遍存在于動(dòng)物、植物及微生物中。根據(jù)基因結(jié)構(gòu)及蛋白同源性可分為8類，即phi（F型）、tau（U型）、zeta（Z型）、theta（T型）、lambda（L型）、脫氫抗壞血酸還原酶（Dehydroascorbate reductase, DHAR）、四氯代氫醌脫鹵素酶（Tetrachlorohy droquione dehalogenase, TCHQD）和微粒體GST（Membrane-associated proteins in eicosanoid and glutathione metabolism, MAPEG），除微粒體GST外，其他7類均為可溶性GST，且GSTF和GSTU一般只存在于植物體內(nèi)，含量較高，種類也最為豐富[1]。自20世紀(jì)70年代在玉米中首次發(fā)現(xiàn)GST以來[2]，許多植物中的GST也都相繼被發(fā)掘。目前，基因已在17種植物中得到克隆和研究[3]，如擬南芥中有54個(gè)基因，水稻59個(gè)，玉米42個(gè)，大豆26個(gè)[4]。

雖然家族數(shù)量眾多，序列差異較大，但具有相似的三維結(jié)構(gòu)，一般是由兩個(gè)亞基組成的同源或異源二聚體，且每個(gè)亞基都具有兩個(gè)基本的功能域：位于N端的谷胱甘肽結(jié)合位點(diǎn)（G-site）和位于C端的疏水性底物作用位點(diǎn)（H-site）[4]。不同種類基因的差異主要體現(xiàn)在G位點(diǎn)功能和H位點(diǎn)結(jié)合底物的不同，由此決定了基因具有解毒、調(diào)節(jié)植物次級代謝[5]和參與植物生長發(fā)育、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及細(xì)胞凋亡等多種功能[6-9]。

茶樹作為我國重要的經(jīng)濟(jì)作物，在生長發(fā)育的不同階段，往往會(huì)受到多種生物或非生物脅迫，如病原菌侵害、干旱、高溫等，由此造成茶葉產(chǎn)量和品質(zhì)的下降；另一方面，茶葉對人體具有多種營養(yǎng)價(jià)值和保健功效，而類黃酮物質(zhì)是其首要的生物活性成分，占鮮葉干重的18%~36%[10]。近年來，已有大量研究表明，在多種植物體內(nèi)與抗脅迫和類黃酮等次生代謝產(chǎn)物緊密相關(guān)，而茶樹中有關(guān)基因家族只有少量研究，完整序列也僅有2條（登錄號分別為FJ014478、KF612020），在茶樹體內(nèi)的相關(guān)功能研究則更為缺乏。因此，本研究在對不同處理下龍井43和中黃2號進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序的基礎(chǔ)上，獲得基因，再經(jīng)過進(jìn)一步篩選、生物信息學(xué)分析和不同組織部位的表達(dá)分析，以明確候選基因的時(shí)空表達(dá)規(guī)律，為以后開展基因克隆及功能的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

以種植于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所的龍井43和中黃2號為轉(zhuǎn)錄組測序材料，一組經(jīng)遮蔭處理（20?m×20?m遮陽網(wǎng)覆蓋，遮光率為80%±5%），另一組不遮蔭（CK）。7?d后采一芽一葉，液氮速凍后于－80℃冰箱保存，用于轉(zhuǎn)錄組測序。

用于熒光定量PCR的材料為種植于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所的龍井43，選取生長勢相對一致的正常植株，于2015年8月7日采摘一芽一葉、第二葉、第三葉、第四葉、第五葉、第六葉，液氮速凍后于－80℃冰箱保存。

1.2 CsGSTs的篩選及其差異表達(dá)分析

根據(jù)Wei等[11]的方法對4組樣品（龍井43對照、龍井43遮蔭、中黃2號對照、中黃2號遮蔭）的測序結(jié)果進(jìn)行分析，主要是將序列重新組裝和進(jìn)行功能注釋，篩選得到基因。

1.3 CsGSTs序列分析及聚類分析

將得到的序列在NCBI網(wǎng)站上利用ORF Finder和BLASTX工具進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析；并與擬南芥基因家族成員進(jìn)行BLASTX比對；然后根據(jù)RPKM (Reads Per kb Million reads) 最大值大于10進(jìn)一步篩選，得到的序列，經(jīng)修飾后用MEGA6進(jìn)行多序列比對和聚類分析。

1.4 總RNA提取及cDNA合成

茶樹葉片總RNA提取方法參照天根公司提供的多糖多酚植物總RNA提取試劑盒進(jìn)行，然后以500?ng RNA為模板，根據(jù)天根Fast Quant RT Kit（with gDNase）提供的的方法反轉(zhuǎn)錄成cDNA，稀釋至統(tǒng)一濃度（40?ng·μL-1），作為熒光定量模板。

1.5 CsGSTs基因熒光定量PCR分析

以龍井43一芽一葉、第二葉、第三葉、第四葉、第五葉、第六葉的cDNA為模板，選取RPKM值較高的基因進(jìn)行熒光定量PCR分析。根據(jù)前期轉(zhuǎn)錄組測序獲得的基因序列片段，使用NCBI在線Prime-blast軟件設(shè)計(jì)熒光定量特異引物（表1）。采用相對定量的方法，以GAPDH為內(nèi)參基因，分析基因的表達(dá)量。反應(yīng)體系為SYBR Premix Ex Taq 10mL，ROX DyeⅡ 0.4mL，10mmol·L-1上、下游引物各0.8mL，cDNA 2mL，加水至終體積20mL，反應(yīng)在ABI PRISM 7500實(shí)時(shí)定量PCR儀上進(jìn)行。反應(yīng)程序如下：95℃預(yù)變性30?s，95℃變性5?s，62℃退火延伸34?s，40個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后分析熒光值變化曲線和融解曲線。4次技術(shù)性重復(fù)，結(jié)果采用2-??CT算法分析。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物

2 結(jié)果與分析

2.1 CsGSTs基因的篩選結(jié)果及表達(dá)情況

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果篩選得到49個(gè)基因，按照基因序列號從小到大進(jìn)行命名，并對其進(jìn)行亞家族分類。4組轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中，以RPKM最高值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)（表2），結(jié)果表明，49個(gè)基因可分為7個(gè)亞家族，其中近一半基因?qū)儆赨型（25個(gè)：）其次是F型（10個(gè)：），T型（6個(gè)：），DHAR型（3個(gè)：），Z型（2個(gè)：），TCHQD型（2個(gè)：），MAPEG型最少（1個(gè)：）。按照基因表達(dá)水平進(jìn)行分析，結(jié)果表明，12.24%的基因?yàn)槌弑磉_(dá)水平（RPKM≥100），主要是U型和F型；26.53%的基因?yàn)楦弑磉_(dá)水平（10≤RPKM＜100）；42.86%的基因?yàn)橹斜磉_(dá)水平（1≤RPKM＜10）；18.37%的基因?yàn)榈捅磉_(dá)水平（0＜RPKM＜1），總體來說，基因在茶樹芽葉中表達(dá)量較為豐富。

表2 不同亞家族CsGSTs基因的RPKM值分布

亞家族中基因的表達(dá)量差異較大（圖1），大部分為中低表達(dá)水平。其中，以的RPKM值最高，在中黃2號對照組中甚至高達(dá)650，其次是、和。大部分基因在經(jīng)過遮蔭處理后，表達(dá)量均有一定程度的下降，如、和；、和的RPKM值在品種之間的差異明顯大于處理之間的差異，如在不同品種對照組間的表達(dá)差異達(dá)到6倍以上。

CsGSTF亞家族的表達(dá)情況如圖2所示。其中以的表達(dá)量最高，4組數(shù)據(jù)中RPKM的平均值在470左右。中黃2號品種，大部分基因的表達(dá)量經(jīng)遮蔭處理后略有上升；而龍井43多數(shù)基因的表達(dá)量在遮蔭后則略有降低，尤其是，對照組與處理組的RPKM值相差3倍，說明茶樹基因的表達(dá)具有一定的品種差異。

其他CsGSTs亞家族的表達(dá)情況如圖3所示。大部分基因?yàn)橹懈弑磉_(dá)水平，以MAPEG亞家族的表達(dá)量最高；GSTT亞家族中，的表達(dá)量最高，RPKM最大值約為50；DHAR亞家族中，最高，RPKM最大值接近100；而Z型和TCHQD型的RPKM值則相對較低；大部分基因在不同品種和處理之間的表達(dá)量變化較小，相對穩(wěn)定。

2.2 CsGSTs的序列分析及聚類分析

進(jìn)一步對RPKM最高值大于10且包含完整ORF閱讀框的19個(gè)基因進(jìn)行分析表明，（7個(gè)）和（5個(gè)）仍占主導(dǎo)地位（表3）。其中3個(gè)基因與AtGSTU19的序列相似度較高，說明這類基因可能在茶樹芽葉中具有重要作用。

表3CsGSTs基因的RPKM值及BLASTX結(jié)果

基于氨基酸序列對這19個(gè)基因進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析（圖4），結(jié)果與BLASTX分類結(jié)果基本一致。和被聚在相距較遠(yuǎn)的兩個(gè)分支中。除CsGSTT基因外，同屬一個(gè)亞家族的基因都聚在一起，說明不同亞家族基因之間的序列差異較大。

2.3 CsGSTs基因的表達(dá)分析

選取RPKM值較高的8個(gè)基因（CsGST8、、、、、、和），分別測定它們在龍井43不同葉位的表達(dá)量（圖5）。結(jié)果表明，這8個(gè)基因在一芽一葉到第六葉中均有表達(dá)，但表達(dá)量及其變化規(guī)律不同。除和外，其他基因在一芽一葉中的表達(dá)量均小于在其他葉位的表達(dá)量。其中，的表達(dá)量隨葉片成熟度的增加明顯下降，在第四葉中的表達(dá)量只有一芽一葉的1%，第六葉中僅檢測到微量的表達(dá)。而的表達(dá)量變化規(guī)律則完全相反，隨著葉子成熟度的增加，表達(dá)量逐漸上升，第六葉中的表達(dá)量為一芽一葉的15.86倍。其他基因的表達(dá)規(guī)律并不明顯：除在第六葉中表達(dá)量略有下降外，總體有一定的上升趨勢；CsGST8與的表達(dá)量變化相對穩(wěn)定。、、的表達(dá)量變化規(guī)律相似，在第二葉或第四葉的表達(dá)量達(dá)到最高，整體呈波動(dòng)變化。

注：1代表一芽一葉；2代表第二葉；3代表第三葉；4代表第四葉；5代表第五葉；6代表第六葉。

Notes：1 represents a bud with a leaf, 2 represents the second leaf, 3 represents the third leaf, 4 represents the fourth leaf, 5 represents the fifth leaf, 6 represents the sixth leaf.

圖5在龍井43不同葉位的表達(dá)量

Fig. 5 Relative expression ofin different leaf positions of Longjing43

3 小結(jié)與討論

本研究主要通過轉(zhuǎn)錄組測序、生物信息學(xué)分析和實(shí)時(shí)熒光定量PCR等試驗(yàn)對茶樹中基因進(jìn)行了篩選和分析。前期轉(zhuǎn)錄組測序篩選獲得了49個(gè)差異表達(dá)的基因，它們的表達(dá)量變化范圍較大（表2），同一基因在不同品種和處理之間的RPKM值也不盡相同（圖1~圖3）。大部分基因在經(jīng)遮蔭處理后的表達(dá)量有一定程度下降（圖1）；而基因在不同品種中對遮蔭有不同的響應(yīng)：中黃2號大多數(shù)基因的表達(dá)量在遮蔭后略有上升，而龍井43中基因的表達(dá)量在遮蔭后普遍降低（圖2）；其他亞家族成員在不同品種和處理之間的表達(dá)量則相對穩(wěn)定（圖3）。

部分基因的表達(dá)具有明顯的品種差異，尤其是，它在兩個(gè)品種之間的RPKM值相差6倍以上（圖1）；qRT-PCR結(jié)果表明，基因的表達(dá)隨葉子成熟度的增加而顯著上升，一芽一葉與第六葉中的表達(dá)量甚至相差16倍。與擬南芥（）的相似度達(dá)71%，研究表明，與植物抗脅迫能力緊密相關(guān)，如抗旱和抗鹽脅迫[12-14]。一方面，可能作為抗氧化酶直接與活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）反應(yīng)，減少細(xì)胞損傷[15]，提高植物抗性；另一方面，還可能作為脅迫調(diào)控因子，當(dāng)植物受到脅迫時(shí)可激活脅迫響應(yīng)途徑，使相應(yīng)的抗氧化酶活性提高，間接參與植物抗脅迫反應(yīng)[14]?？赡芘c的功能相似，通過減少ROS在植物體內(nèi)的積累，直接或間接參與植物抗逆反應(yīng)。

而則對遮蔭處理較為敏感，與龍井43對照組相比，遮蔭組的RPKM值明顯下降（圖2）。qRT-PCR結(jié)果表明，基因的表達(dá)量隨葉子成熟度的增加而急劇下降，在第六葉中僅有微量表達(dá)。與擬南芥中的相似度最高，諸多研究表明，作為轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可將花青素和原花青素從合成部位（主要是細(xì)胞質(zhì)）運(yùn)至液泡并累積[16-18]，這樣不僅能減少產(chǎn)物對反應(yīng)的抑制作用，促進(jìn)花青素和原花青素的合成，還可以減少類黃酮等次級代謝產(chǎn)物對細(xì)胞的毒害作用[19]。Hu等[20]發(fā)現(xiàn)荔枝（）中（F型）也與花青素累積相關(guān)。茶樹體內(nèi)的多酚類主要集中分布在新梢生長旺盛的部分，也隨著葉子成熟度的增加而逐漸減少[21-23]，這與的表達(dá)量變化規(guī)律也相對一致。此外，Wang等人的研究表明中黃2號中類黃酮如花青素和兒茶素的含量顯著低于龍井43[24]，且經(jīng)遮蔭處理后，會(huì)促進(jìn)茶樹氮代謝，碳代謝相應(yīng)減弱，導(dǎo)致類黃酮途徑中多酚類含量降低[21]，這與轉(zhuǎn)錄組測序中的RPKM值變化規(guī)律也相對一致。因此與功能相似，也可能作為轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與類黃酮物質(zhì)從細(xì)胞質(zhì)到液泡中的轉(zhuǎn)運(yùn)和累積，從而影響茶樹體內(nèi)花青素等類黃酮物質(zhì)的代謝。

是僅有的MAPEG型的GST，表達(dá)量相對穩(wěn)定。目前，植物中的MAPEG蛋白大部分都具有谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的活性[25]，但難溶于水，與其他幾類可溶性GST蛋白相比，它在大部分植物中的酶活性相對較低[26]。因此，Basantani等[3]認(rèn)為在正常生長環(huán)境條件下，此類基因可能無明顯功能，但經(jīng)一定條件誘導(dǎo)后可發(fā)揮重要作用；的表達(dá)量變化也較小，與擬南芥AtGSTU17的序列相似度較高。AtGSTU17可通過影響谷胱甘肽庫的平衡來參與調(diào)節(jié)光信號傳導(dǎo)和植物生長發(fā)育等過程[27]；Chen等[28]還發(fā)現(xiàn)在干旱和鹽脅迫中，AtGSTU17還可作為負(fù)調(diào)節(jié)因子，低表達(dá)量或基因缺失有利于提高植物抗性。與擬南芥中AtGSTF8的相似度最高。研究表明，在多種生物和非生物脅迫條件下，包括H2O2[29]、水楊酸[30]、生長素、除草劑和微生物侵染[31]等，AtGSTF8均可被誘導(dǎo)表達(dá)，還可作為早期氧化脅迫反應(yīng)信號[32]，參與植物抗氧化脅迫反應(yīng)。而、、雖然分別屬于DHAR型、Z型、T型，但表達(dá)規(guī)律相似，在第二葉和第四葉的表達(dá)量較高。植物中的DHAR型GST具有巰基轉(zhuǎn)移酶活性，可作為氧化還原酶參與抗壞血酸循環(huán)[33]，水稻[34]和蝴蝶蘭[35]中的DHAR還與植物抗高溫脅迫有關(guān)；Z型GST主要是作為馬來酰乙酰乙酸異構(gòu)酶，參與植物體內(nèi)酪氨酸代謝[36-37]，此外，水稻中還可被茉莉酸誘導(dǎo)，可能參與抗脅迫反應(yīng)[38]；T型具有谷胱甘肽過氧化物酶活性，在植物抗氧化脅迫反應(yīng)中，可減少有機(jī)過氧化物的生成，減少細(xì)胞損傷[39]。

由于是由眾多基因組成的龐大而復(fù)雜的家族，其編碼產(chǎn)物也具有多種功能。雖然家族成員之間存在著功能冗余的現(xiàn)象，但每一個(gè)基因在不同物種中可能都具有一定的特異性和特定的表達(dá)模式[40]。結(jié)合以上轉(zhuǎn)錄組測序和實(shí)時(shí)熒光定量PCR的結(jié)果，推測茶樹中的成員亦是如此：在不同茶樹品種、組織部位或不同處理下，即使同屬一個(gè)亞家族，不同基因之間的表達(dá)模式和功能也可能不盡相同。因此在茶樹中是否具有轉(zhuǎn)運(yùn)花青素或抗脅迫等類似功能，仍需進(jìn)一步研究。

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Analysis ofGenes in Tea Plant () Based on Transcriptome Analysis

ZHANG Yazhen, WEI Kang*, WANG Liyuan, CHENG Hao

Tea Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences; National Center for Tea Improvement; Key Laboratory of Tea Biology and Resources Utilization, Ministry of Agriculture, Hangzhou 310008, China

Glutathione-transferases (GSTs) belong to a superfamily of multifunctional enzymes and are ubiquitous in plants. Forty ninegenes were identified by transcriptome analysis of Zhonghuang2 and Longjing43 under control and shading treatment. Nineteenwith relatively high expression levels in buds were used for sequence and phylogenetic tree analysis. Real-time fluorescence quantitative PCR (qRT-PCR) was performed to analyze the expression patterns of 8 candidate genes in different leaf positions of Longjing43. The results showed thatwere expressed in all tested leaves, but exhibited different expression patterns.showed an increasing expression from a bud with a leaf to the sixth leaf, suggesting a potential role in stress resistance. On the other hand, the expression level ofdropped significantly, suggesting thatmight participate in anthocyanin accumulation in tea plants.

tea plant (), transcriptome analysis, GST, expression analysis

S571.1；Q51

A

1000-369X（2016）05-513-10

2016-04-14

2016-05-20

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（茶葉）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-23）、國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31470396）、浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（LY14C020001）。

張亞真，女，碩士研究生，主要從事茶樹分子生物學(xué)研究。

weikang@tricaas.com