趙　偉　郭慧媛　任發(fā)政　陳尚武

(中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院， 北京 100083)

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乳桿菌胞外蛋白提取鑒定與雙向電泳圖譜建立

趙偉郭慧媛任發(fā)政陳尚武

(中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院， 北京 100083)

采用三氯乙酸(TCA)-丙酮沉淀法提取乳桿菌胞外蛋白并進行了優(yōu)化，通過SDS-PAGE分析了該方法用于7株乳桿菌胞外蛋白的提取效果，同時對乳桿菌不同生長期胞外蛋白的分泌特性進行了研究，采用MALDI-TOF/TOF-MS鑒定了胞外蛋白，最后通過雙向電泳(2-DE)分析了L.paracaseiL14的胞外蛋白組。結(jié)果表明：采用終質(zhì)量分數(shù)為6%的TCA提取乳桿菌胞外蛋白效果最好，并且具有通用性；從乳桿菌穩(wěn)定期提取出種類較多的胞外蛋白，成功鑒定出L.paracaseiSW2胞外蛋白中3個蛋白質(zhì)；使用半合成培養(yǎng)基培養(yǎng)乳桿菌，可以提取出符合2-DE樣品純度要求的胞外蛋白，從L.paracaseiL14胞外蛋白組2-DE圖譜上檢測到(130±10)個蛋白質(zhì)點，約占L.paracasei預測分泌蛋白組的46%。

乳桿菌； 胞外蛋白； 提取方法； 蛋白質(zhì)組； 雙向電泳圖譜

引言

乳桿菌(Lactobacillus)是一類低G+C含量的革蘭氏陽性菌，屬于真細菌中梭菌-芽孢桿菌(Clostridium-Bacillus)分支中的硬壁菌門(Firmicutes)[1]，天然存在于乳制品、肉類、發(fā)酵植物食品以及人和動物的口腔、陰道和腸道中[2]，是最為常見的乳酸菌種類之一。乳桿菌傳統(tǒng)上作為發(fā)酵劑廣泛用于食品工業(yè)中，具有延長食品保藏期、改善食品風味和質(zhì)構(gòu)等功能[3]，隨著近年來不斷有研究表明乳桿菌具有很多對人體健康有益的生理功能，如今其作為公認的益生菌被廣泛研究和開發(fā)[4]。

細菌胞外蛋白是在核糖體合成后可以跨越細胞膜轉(zhuǎn)運到細胞外存在于細胞表面或者釋放到胞外基質(zhì)中的一類蛋白質(zhì)[5-6]。乳桿菌胞外蛋白可以直接接觸宿主粘膜細胞如上皮細胞和免疫細胞，在粘附腸道表面、誘導免疫調(diào)節(jié)等益生功能方面發(fā)揮重要作用，是菌體與宿主細胞分子交互感應、進行信號傳導的重要分子基礎(chǔ)[7-9]。有效提取和鑒定乳桿菌胞外蛋白，將為深入研究乳桿菌粘附宿主細胞、誘導免疫調(diào)節(jié)、拮抗病原物等益生作用的分子機制奠定重要基礎(chǔ)。BOEKHORST等[10]對L.plantarumWCFS1的分泌蛋白組預測研究表明，至少有12個蛋白直接參與粘附宿主細胞成分如膠原蛋白和粘蛋白。SANCHEZ等[11]研究了L.plantarumBMCM12 胞外蛋白對腸道內(nèi)常見病原菌的影響，結(jié)果表明胞外蛋白可以顯著減弱大腸桿菌(Escherichiacoli)和沙門氏菌(Salmonellaenterica)對宿主粘膜表層的粘附；SANCHEZ等[12]進一步研究發(fā)現(xiàn)，來源于L.plantarum的一種胞外蛋白可以粘附一些糖基化蛋白，如粘蛋白和存在于上皮細胞表面的蛋白。據(jù)YAN等[13]和BAUERL等[14]的研究，來源于L.rhammnosusGG 和L.caseiBL23 的表面抗原p40和p75均可以激活腸上皮細胞(IEC)的蛋白激酶Akt和抑制腫瘤壞死因子(TNF)誘導的IEC凋亡，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。為此，有效提取、分離和鑒定出乳桿菌胞外蛋白，將為深入研究乳桿菌益生作用的分子機制奠定重要基礎(chǔ)。但是，目前大部分研究都集中在植物乳桿菌細胞蛋白組的研究，如COHEN等[15]首次建立了L.plantarum的細胞質(zhì)蛋白組圖譜并研究了對數(shù)期到穩(wěn)定期蛋白組的變化情況。SIRAGUSA等[16]研究了L.plantarum為適應食品環(huán)境的蛋白質(zhì)組變化。有關(guān)乳桿菌胞外蛋白組的研究很少，僅有ZHU等[17]分析過L.plantarumCMCC-P0002的分泌蛋白組，但是分離出的胞外蛋白數(shù)量較少。

本文以乳桿菌為研究材料，優(yōu)化三氯乙酸(TCA)-丙酮法提取乳桿菌胞外蛋白的方法，通過SDS-PAGE分析檢驗此方法應用于提取乳桿菌胞外蛋白的通用性，對不同生長期提取乳桿菌胞外蛋白的分泌特性進行研究，采用MALDI-TOF/TOF-MS對提取的胞外蛋白進行鑒定，并對鑒定蛋白進行生物信息學分析。進一步采用雙向電泳(2-DE)分析L.paracaseiL14的胞外蛋白組，確定乳桿菌胞外蛋白組2-D PAGE的體系條件并得到其胞外蛋白組圖譜。

1　材料與方法

1.1試驗材料

(1) 菌株來源

副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)L14、SW2、Z3-11、C，植物乳桿菌(L.plantarum) NL42、PC41，發(fā)酵乳桿菌 (L.fermentum) Z2-11，鼠李糖乳桿菌(L.rhamnosus) NL24，均由本實驗室分離鑒定保藏[18]。

(2) 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基[19]；半合成培養(yǎng)基：以L.casei全合成培養(yǎng)基[20]為基礎(chǔ)加入1% MRS培養(yǎng)基，配制后采用0.22 μm微孔膜過濾器(康寧公司)除菌。

(3) 主要試劑

TCA、DTT、CHAPS、IAA，購自Sigma公司；脫氧膽酸鈉(DOC)、APS、尿素、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、Tris堿、SDS、考馬斯亮藍G-250，購自Amresco公司；牛血清白蛋白(BSA)，購自Takara公司；硫脲、IPG膠條、IPG buffer、Drystrip覆蓋液、蛋白酶抑制劑cocktail，購自GE Healthcare公司；其他常規(guī)生化試劑為國產(chǎn)分析純。

(4) 主要儀器與設(shè)備

CJ-20型超凈工作臺，天津市泰斯特儀器有限公司；TGL-20M型低溫離心機，長沙平凡儀器儀表有限公司；1-14型臺式高速離心機，德國Sigma公司；Sorvall LYNX 4000型高速落地離心機，美國Thermo Scientific公司；Infinite 200 PRO型多功能酶標儀，瑞士Tecan公司；DHP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；UV/VIS 2802PC型紫外分光光度計，美國UNICO公司；DYY-6C型電泳儀，北京市六一儀器廠；UF/NVPL5124型超純水系統(tǒng)，美國Pall公司；Ettan IPGphorII型等電聚焦儀、Ettan DALTsix型垂直電泳儀、Image Scanner II型凝膠掃描儀，GE Healthcare公司。

1.2方法

(1) 菌種活化與培養(yǎng)條件：按照1%接種量將保藏菌種接種至新鮮MRS液體培養(yǎng)基中活化，37℃靜置培養(yǎng)，至對數(shù)生長后期轉(zhuǎn)接菌種擴大培養(yǎng)。

(2) TCA-丙酮沉淀法提取胞外蛋白：參照SANCHEZ等[11,21]的方法，改進如下：將活化菌種接種至50 mL MRS培養(yǎng)液于37℃靜置培養(yǎng)至對數(shù)生長中期或穩(wěn)定期，3 500g離心10 min收集上清液，0.22 μm微孔膜過濾上清液，加入百分之一體積質(zhì)量分數(shù)為2% DOC混合均勻后于4℃靜置30 min，邊攪拌邊加入終質(zhì)量分數(shù)為6%、10% 和15%的TCA于4℃沉淀蛋白4 h，13 000g離心懸濁液15 min收集沉淀，用4倍體積冰丙酮(-20℃保存)充分洗滌沉淀3次(用超聲波清洗器助洗)，13 000g離心15 min收集沉淀后室溫下自然風干丙酮，將蛋白樣品保存在-80℃冰箱中備用。2-DE樣品通過接種至1 000 mL半合成培養(yǎng)基提取胞外蛋白，其他步驟同上。

(3) 乳桿菌胞外蛋白的SDS-PAGE：將上述制得樣品充分溶解于100 μL 1 × Laemmli buffer[22]中。電泳上樣前將樣品15 000g離心10 min，收集上清。在12%分離膠中進行SDS-PAGE，上樣量20 μL。

(4) 蛋白質(zhì)鑒定：將SDS-PAGE電泳條帶脫色后，手工切取蛋白條帶，按照ROSENFELD等[23]的方法進行膠內(nèi)酶解，按照LIHONG等[24]的方法采用MALDI-TOF/TOF-MS進行蛋白質(zhì)鑒定，將得到的肽段指紋圖譜用MASCOT軟件在NCBInr數(shù)據(jù)庫中檢索。

(5)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)生物信息學分析：利用UniProtKB數(shù)據(jù)庫對鑒定蛋白進行序列比對和功能注釋。利用在線分析軟件PSORTb version 3.0.2 (http:∥www.psort.org/psortb/index.htmL) 對鑒定蛋白進行亞細胞定位預測。參照PETERSEN等[25]的方法，通過在線預測工具SignalP 4.1 Server(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP) 預測是否含有蛋白質(zhì)分泌信號肽。

(6) 乳桿菌胞外蛋白的雙向聚丙烯酰氨凝膠電泳(2-DE)體系建立：將前述TCA-丙酮沉淀法制得的蛋白樣品溶于150 μL樣品制備溶液(7 mol/L尿素, 2 mol/L硫脲, 4% CHAPS, 2% IPG Buffer pH 4～7, 40 mmol/L DTT和蛋白酶抑制劑Cocktail )，超聲波助溶后，15 000g離心15 min 取上清液，采用Bradford法[26]測定蛋白質(zhì)含量。2-DE實驗參照GORG等[27]的方法優(yōu)化改進，詳細過程如下：取600 μg 蛋白質(zhì)樣品用再水化液(7 mol/L尿素, 2 mol/L硫脲, 2% CHAPS, 0.5% IPG Buffer pH值 4～7, 20 mM DTT和0.002% 考馬斯亮藍)稀釋至450 μL，充分混勻后加入水化盤，使用IPG膠條(24 cm，pH值4～7，GE Healthcare)覆蓋到再水化液上水化過夜；水化完成后將IPG膠條轉(zhuǎn)移至Ettan IPGphorII進行第一向等電聚焦電泳，電泳程序設(shè)定為：總聚焦97 kV·h，溫度20℃，最大電流50 μA；等電聚焦結(jié)束后，參照GORG等[28]的方法將IPG膠條放入平衡管進行平衡；采用Ettan DALT six進行第二向SDS-PAGE，連續(xù)凝膠質(zhì)量分數(shù)為12%，電泳程序設(shè)定為：溫度25℃，初始功率為2 W/膠條，膠條中的蛋白質(zhì)樣品遷移至SDS-PAGE連續(xù)凝膠中后功率轉(zhuǎn)換為17 W/膠條，直至溴酚藍條帶前沿接近凝膠底端時停止電泳；采用Blue silver染色法[29]對2-DE膠進行染色和脫色。

(7) 2-DE圖譜分析：用Image Scanner III掃描儀掃描脫色后的凝膠塊，采用透射模式，分辨率300 dpi，以ImageMaster和TIFF格式輸出文件。采用ImageMaster 2D Platinum 7.0 (GE Healthcare)分析2-DE凝膠成像圖，對膠上的蛋白點識別并進行相對豐度分析。

2　結(jié)果與分析

2.1不同質(zhì)量分數(shù)TCA提取乳桿菌胞外蛋白結(jié)果

分別采用終質(zhì)量分數(shù)為6%、10%和15%的TCA對2株乳桿菌菌株SW2和Z3-11提取胞外蛋白，通過SDS-PAGE分析蛋白樣品，結(jié)果如圖1所示。圖中1為菌株SW2全細胞蛋白；2為菌株SW2胞外蛋白；3為菌株Z3-11全細胞蛋白；4為菌株Z3-11胞外蛋白；M為蛋白質(zhì)相對分子量Marker。由15% TCA 提取的胞外蛋白條帶(見圖1c)顏色最深，表明沉淀蛋白含量最高，但是條帶背景較深，難以明顯辨別蛋白條帶數(shù)量，這是由于MRS培養(yǎng)基本身成分復雜，含有多種有機提取物成分，會影響TCA沉淀蛋白效果，高濃度的TCA沉淀出了更多的MRS培養(yǎng)基中的雜質(zhì)導致。由6%和10% TCA質(zhì)量分數(shù)提取出的胞外蛋白(分別見圖1a和1b)通過SDS-PAGE均可見清晰的蛋白條帶，但是10% TCA 提取的胞外蛋白SDS-PAGE圖譜仍有部分區(qū)域背景較深，蛋白條帶難以區(qū)分。6% TCA提取胞外蛋白所有條帶均清晰可見，背景干凈，易于后續(xù)鑒定及分析，而且相較10% TCA提取的蛋白條帶數(shù)量并未減少，而是有更多顏色較淺的蛋白條帶得以分離。因此，確定后續(xù)實驗采用終質(zhì)量分數(shù)為6%的TCA 提取乳桿菌胞外蛋白。

圖1　3種不同質(zhì)量分數(shù)TCA提取乳桿菌胞外蛋白SDS-PAGE圖譜對比Fig.1　Representative SDS-PAGE gels showing Lactobacillus extracellular proteins extracted with three TCA concentrations

為了檢驗采用終質(zhì)量分數(shù)為6%的TCA 提取乳桿菌胞外蛋白是否具有通用性，采用此方法對本實驗室保藏的7株乳桿菌菌株的胞外蛋白進行提取實驗，通過SDS-PAGE分析蛋白樣品，結(jié)果如圖2所示。圖中0為MRS培養(yǎng)基提取物；1為菌株Z2-11；2為菌株C；3為菌株P(guān)C41；4為菌株NL42；5為菌株NL24；6為菌株Z3-11；7為菌株SW2；M為蛋白質(zhì)相對分子量Marker。由圖可見，僅有4號菌株NL42蛋白樣品條帶模糊，難以明顯區(qū)分蛋白條帶，這可能與其胞外蛋白組成有一定特異性有關(guān)，一種或幾種分子量較為接近的胞外蛋白含量較高，或者是胞外蛋白發(fā)生了化學修飾，又同時或因蛋白質(zhì)濃度過高而導致在SDS-PAGE圖譜上高分子量區(qū)域連成一片，而不是單獨的蛋白條帶。另外6株菌株均可分離得到清晰可見的蛋白條帶。因此，采用6% TCA-丙酮沉淀法可以作為提取乳桿菌胞外蛋白的有效方法，但是為了得到最佳的提取效果，可以此方法為基礎(chǔ)結(jié)合特定乳桿菌菌株及其胞外蛋白特性作適當調(diào)整。

圖2　7株乳桿菌胞外蛋白SDS-PAGE圖譜Fig.2　Representative SDS-PAGE gel showing extracellular proteins of seven Lactobacillus stains

2.2不同生長期提取乳桿菌胞外蛋白結(jié)果

為了研究不同生長期乳桿菌分泌胞外蛋白生理特性，對L.paracaseiSW2在對數(shù)生長中期(600 nm波長吸光度OD600 nm約為0.8)和穩(wěn)定期(OD600 nm約為1.8)的MRS培養(yǎng)液中胞外蛋白分別進行了提取，通過SDS-PAGE分析蛋白樣品，結(jié)果如圖3所示，圖中1號泳道培養(yǎng)基初始pH值為5.5；2號泳道培養(yǎng)基初始pH值為6.8。由圖可知，從穩(wěn)定期(圖3a)培養(yǎng)液中提取的胞外蛋白樣品通過SDS-PAGE分離出約14條蛋白條帶，而對數(shù)生長中期(圖3b)僅分離出約8條蛋白條帶，表明乳桿菌在對數(shù)期還沒有將全部胞外蛋白分泌到胞外，從對數(shù)期到穩(wěn)定期胞外蛋白在持續(xù)分泌。而穩(wěn)定后期至衰亡期，微生物細胞逐漸老化并出現(xiàn)自溶現(xiàn)象，會將胞內(nèi)蛋白釋放到培養(yǎng)液中，干擾胞外蛋白的提取。因此，為了能提取出更多種類的乳桿菌胞外蛋白，穩(wěn)定期為提取的最佳生長時期。另外，經(jīng)對L.paracaseiSW2生長在不同初始pH值的培養(yǎng)液中的胞外蛋白進行提取，SDS-PAGE分析蛋白樣品，發(fā)現(xiàn)無論是在穩(wěn)定期還是對數(shù)生長中期，初始pH值分別為5.5(見圖3中1號泳道)和6.8(見圖3中2號泳道)的培養(yǎng)液中提取的胞外蛋白條帶并無明顯差異。這可能是由于乳桿菌本身代謝產(chǎn)酸，對較低濃度的酸環(huán)境有較好的耐受性，并未影響到其蛋白分泌生理功能所致。

圖3　副干酪乳桿菌菌株SW2不同生長期提取胞外蛋白SDS-PAGE圖譜Fig.3　Representative SDS-PAGE gels showing extracellular proteins of the L. paracasei stain SW2 in different growth phases

2.3蛋白質(zhì)譜鑒定及生物信息學分析結(jié)果

采用MALDI-TOF/TOF-MS對L.paracaseiSW2穩(wěn)定期提取的胞外蛋白進行鑒定，選取圖3a中較為清晰的6條蛋白條帶(S1～S6)進行鑒定，成功鑒定出3個蛋白質(zhì)(見表1)，通過NCBI數(shù)據(jù)庫搜索3個蛋白質(zhì)的基本生物信息表明：3個蛋白質(zhì)的基因注釋均來源于副干酪乳桿菌菌株，與本實驗菌株是相同種屬；其中，條帶S1和S6均為細胞壁水解酶，為常見乳桿菌胞外蛋白，主要功能為分解培養(yǎng)基營養(yǎng)成分供給菌體[10]；條帶S5為表面抗原，與L.rhamnosusGG 表面抗原p40具有86%同源性。通過PSORTb分析鑒定蛋白的亞細胞定位表明：條帶S1和S5均為胞外蛋白，條帶S6未知。進一步通過SignalP分析鑒定蛋白序列是否含有蛋白質(zhì)分泌信號肽，結(jié)果表明：條帶S1和S5均具有信號肽，并預測出S1的信號肽剪切位點在32和33位之間，S1的信號肽剪切位點在28與29位之間；S6蛋白序列沒有信號肽，經(jīng)分析，S6蛋白分子較小，可能是通過非典型的分泌途徑轉(zhuǎn)運到胞外。由此可以驗證，本實驗方法提取的確為乳桿菌胞外蛋白。

表1　L. paracasei SW2胞外蛋白質(zhì)譜鑒定結(jié)果Tab.1　Identification of extracellular proteins of L. paracasei SW2

注：a, 條帶編號對應圖3中的蛋白質(zhì)條帶編號；b、c、d、e、f依次為 NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索得到的蛋白質(zhì)名稱、物種來源、登錄號、分子量、等電點；g為基于質(zhì)譜峰圖利用MASCOT軟件搜索得到的蛋白質(zhì)得分；h為通過PSORTb分析得到的蛋白質(zhì)亞細胞定位； i為通過SignalP分析是否含有蛋白分泌信號肽。

另外3條條帶未鑒定出結(jié)果，可能是由于數(shù)據(jù)庫中沒有搜索到與其相匹配的同源序列，還有可能是受限于SDS-PAGE分離蛋白的分辨率，一條蛋白條帶可能混雜有1種以上蛋白質(zhì)，而質(zhì)譜只能鑒定單一組分蛋白質(zhì)，不能鑒定蛋白混合物而導致難以得出確切結(jié)果。因此，為了能夠更為全面、深入地研究乳桿菌胞外蛋白信息，有必要對其進行2-DE分析。

2.4乳桿菌胞外蛋白含量測定結(jié)果

采用Bradford法測定培養(yǎng)于半合成培養(yǎng)基的L.paracasei菌株L14胞外蛋白含量，以BSA為蛋白標準品制作標準曲線見圖4，得到回歸方程：y=0.018x+0.014,R2=0.988。將提取的胞外蛋白樣品作適當稀釋，使其595 nm吸光度落在標準曲線線性范圍內(nèi)。根據(jù)回歸方程，將所檢測樣品的吸光度換算得到菌株L14胞外蛋白含量為0.896 g/L?？梢?，相較芽孢桿菌(Bacillus)蛋白分泌量(大于等于20 g/L)[30]，乳桿菌蛋白分泌能力處于較低水平。

圖4　蛋白含量測定標準曲線Fig.4　Standard curve of protein quantitation

2.5乳桿菌胞外蛋白2-DE結(jié)果

鑒于乳桿菌蛋白分泌能力不足，培養(yǎng)液中胞外蛋白濃度較低，為了能夠提取足夠的蛋白量以達到2-DE對樣品上樣量的要求，本實驗首先將L.paracasei菌株L14培養(yǎng)于1 000 mL MRS培養(yǎng)液中提取胞外蛋白。但是，采用TCA-丙酮沉淀法在大體量MRS培養(yǎng)液中提取胞外蛋白時，同時將培養(yǎng)液中含有的多肽、有機提取物以及色素等復雜組分大量沉淀下來，嚴重降低了胞外蛋白純度，導致提取的蛋白樣品純度難以達到2-DE對樣品純度的要求，不能順利進行等電聚焦。

圖5　L. paracasei L14胞外蛋白組2-DE圖譜Fig.5　Representative 2-DE image showing extracellular proteome of L. paracasei L14

參考SAVIJOKI等[31]的研究，結(jié)合乳桿菌自身的營養(yǎng)需求特點，將L.paracaseiL14培養(yǎng)于含有1% MRS的半合成培養(yǎng)基中，結(jié)果表明：菌株L14在半合成培養(yǎng)基中生長良好，從中提取的胞外蛋白樣品純度可以達到2-DE要求，L14胞外蛋白組2-DE圖譜見圖5。經(jīng)過軟件分析，檢測到圖譜中有(130±10)個蛋白質(zhì)點?？紤]到部分蛋白質(zhì)分子會進行翻譯后改造，引起蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)(Protein turnover)[32]而導致蛋白質(zhì)的分子量和等電點發(fā)生改變，2-DE膠上部分不同的蛋白點可能會屬于同一種蛋白質(zhì)。參考GILAD等[33]對Bifidobacteriumanimalissubsp.lactisBB-12胞外蛋白組的2-DE分析，鑒定成功的96個蛋白點可歸為76種蛋白質(zhì)，推算本實驗檢測到蛋白點約為100種蛋白質(zhì)。根據(jù)ZHOU等[34]的研究，通過比較基因組學預測L.paracaseiATCC 334 分泌蛋白組共有219個蛋白質(zhì)。經(jīng)計算，本實驗檢測到的蛋白質(zhì)約占L.paracasei所有分泌蛋白的46%。另外，相較ZHU等[17]通過2-DE分析L.plantarumCMCC-P0002的分泌蛋白僅檢測到28個蛋白質(zhì)點，本研究所檢測到的蛋白數(shù)量為其4倍之多。這可能是由于提取方法不同導致，ZHU等單獨采用冰丙酮沉淀分泌蛋白，雖然提取樣品不受TCA沉淀MRS中雜質(zhì)的干擾，但是蛋白沉淀效率下降，同時由于乳桿菌本身蛋白分泌水平較低，可能導致很多低豐度的分泌蛋白難以通過2-DE檢測到。由上可見，本研究采用TCA-丙酮沉淀法在半合成培養(yǎng)液中提取乳桿菌胞外蛋白用于2-DE分析，效果更好，比較理想。

通過軟件對2-DE圖譜上蛋白點進行了豐度分析，發(fā)現(xiàn)位于pH值4～5與分子量80～100 kDa之間區(qū)域存在有豐度極高的蛋白片，其相對豐度占到整個圖譜所有蛋白點的62%?？梢?，L.paracaseiL14 胞外蛋白中含有顯著的高豐度蛋白，這些高豐度蛋白的存在會嚴重干擾低豐度蛋白檢測。因此，在以后的研究中，可以采用分子篩先去除這些大分子量的高豐度蛋白再進行2-DE分析，將有助于更好地檢測、鑒定其他蛋白。

3　結(jié)束語

TCA-丙酮沉淀法是提取乳桿菌胞外蛋白的有效方法，采用終質(zhì)量分數(shù)為 6%的TCA提取效果最為理想，可以作為提取乳桿菌胞外蛋白的基本方法。從穩(wěn)定期提取出的乳桿菌胞外蛋白種類更為豐富，是提取乳桿菌胞外蛋白的最佳生長期。通過鑒定胞外蛋白表明：水解酶和表面抗原為乳桿菌常見胞外蛋白。乳桿菌蛋白分泌能力較弱，胞外蛋白分泌量不足1 g/L。將乳桿菌培養(yǎng)于半合成培養(yǎng)基中，生長良好且可以提取出符合2-DE樣品要求的胞外蛋白，通過乳桿菌胞外蛋白組2-DE圖譜分析，所檢出胞外蛋白數(shù)量約占預測分泌蛋白數(shù)量的近一半，大大提高了乳桿菌胞外蛋白的實驗檢出率。本文初步建立了乳桿菌胞外蛋白的提取、分離及2-DE分析體系，為深入開展乳桿菌胞外蛋白相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。

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兩者測光系統(tǒng)帶來了不同的結(jié)果，E-M1 II傾向于追求整個畫面的明快感，通常會在這種場景中提高曝光，而G9傾向于保留高光細節(jié)，通常會減少曝光。

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Extraction and Identification of Extracellular Proteins from Lactobacilli and a Reference Extracellular Proteomic Map ofLactobacillusparacaseiL14

Zhao WeiGuo HuiyuanRen FazhengChen Shangwu

(CollegeofFoodScienceandNutritionalEngineering,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100083,China)

Lactobacillusextracellular proteins are key molecular factors in promoting the probiotic-host crosstalk and signal transduction. Their extractions and identifications could contribute to unravelling the probiotic molecular mechanisms such as adhesion to intestinal surfaces, modulating immune response and enhancing antagonism towards pathogens. A protocol based on trichloroacetic acid (TCA)-acetone precipitation of proteins was presented and optimized. The method was tested on sevenLactobacillusstrains after sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). The extracellular proteins secretion capacity ofL.paracaseiSW2 in different growth phases was studied and some protein bands were selected for identification by tandem MS. The extracellular proteome ofL.paracaseiL14 were analyzed by 2-D electrophoresis (2-DE). The results showed that the final concentration of 6% TCA was the most suitable for extracting extracellular proteins from lactobacilli. More extracellular proteins could be extracted in the stationary phase than mid-exponential growth phase. Three of extracellular proteins extracted fromL.paracaseiSW2 were successfully identified. The extracellular samples extracted from semi-defined medium (SDM) could be analyzed by 2-DE. 130±10 spots, corresponding to about 46% coverage of the predicted secretome ofL.paracasei, were detected in the 2-DE map ofL.paracaseiL14 extracellular proteome. In conclusion, this study preliminarily established the extraction method and 2-DE analysis system of extracellular proteins from lactobacilli and paved the way for a more comprehensive insight into relevant research.

Lactobacillus; extracellular proteins; extraction method; proteome; 2-D electrophoresis

10.6041/j.issn.1000-1298.2016.09.033

2016-03-18

2016-04-11

“十二五”國家科技支撐計劃項目(2011AA100903)

趙偉(1981—)，男，博士生，主要從事乳品科學及加工工程研究，E-mail： wayjow@cau.edu.cn

陳尚武(1958—)，男，教授，博士生導師，主要從事乳品科學與代謝工程研究，E-mail： Swchen@cau.edu.cn

TS252.1

A

1000-1298(2016)09-0234-07