夏金成 闕彤彤 張文君 趙聰 楊秦

（邵陽醫(yī)學高等?？茖W校 湖南邵陽 422000）

不同營養(yǎng)條件下維羅納氣單胞菌菌毛表達與生物膜形成能力的比較

夏金成 闕彤彤 張文君 趙聰 楊秦*

（邵陽醫(yī)學高等?？茖W校 湖南邵陽 422000）

目的：檢測不同培養(yǎng)基條件下（即不同營養(yǎng)條件下）維羅納氣單胞菌菌毛動力和生物膜生成能力（即致病能力）。方法：半固體培養(yǎng)基穿刺陽培養(yǎng)檢測細菌動力，喉上皮細胞粘附實驗檢測生物膜形成能力，最后統(tǒng)計分析差異性。結果：BHIB培養(yǎng)基比LBA培養(yǎng)基中，野生型都比菌毛缺失的MSHB突變維羅納氣單胞菌有更高的動力和生物膜形成能力，但之間都無顯著差異（P＜0.05）。結論：不同培養(yǎng)基基條件對菌毛動力有影響，而菌毛表達對生物膜致病性有一定關系。

維羅納氣單胞 菌毛 半固體穿刺 粘附

生物膜多細胞結構的形成是一個復雜且高度規(guī)律的動態(tài)過程,包括細菌起始黏附、生物膜黏附期、生長期、成熟和播散期等階段［1］。首先, 游動細胞接受環(huán)境中的營養(yǎng)信號, 通過鞭毛或菌毛等附著結構黏附于表面； 附著于表面后的細菌不斷繁殖并吸引其他細菌繼續(xù)附著, 使該附著位點細菌呈高密度狀態(tài)從而產生抗生素抵抗性［2］。鞭毛、菌毛介導的動力性和黏附性在細菌致病性中發(fā)揮重要作用, 其與細菌的生物膜形成、耐藥性和慢性感染中的相關性日益受到醫(yī)學界的重視［3］。本次實驗通過檢測不同培養(yǎng)基條件下（即高低營養(yǎng)差別條件下）維羅納菌菌毛對動力和有機體細胞粘附的作用,探討細菌菌毛對生物膜形成的起始黏附、生物膜黏附期的意義。為抗菌,制藥做出基礎貢獻。

1 材料和方法

1.1 菌種

本次采用的是兩種維羅納氣單胞菌：MSHB+（野生型有菌毛）和MSHB-（基因突變型無菌毛）。這兩種細菌均來源以前研究工作的保種。它們有鞭毛表達,只在菌毛表達上有差異。

1.2 細菌培養(yǎng)基和生長條件

BHIB和LBA培養(yǎng)基分別是相對高和相對低營養(yǎng)狀態(tài)的培養(yǎng)基。維羅納氣單胞菌被分別放在不同培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng),等到細菌長到對數(shù)生長期后,用于接下來的半固體培養(yǎng)基穿刺和生物膜形成能力實驗。

1.2 免疫印跡

1.2.1 細菌菌毛蛋白的收集

首先將兩種培養(yǎng)細菌用PBS洗滌三次,再將每種細菌懸浮在1mlPBS溶液中。把此PBS溶液吸入皮下注射器,并對著eppendorf管壁反復擠出和吸入。最后在13200轉/分鐘,室溫條件下離心25分鐘,以分離細菌和菌毛蛋白。緊接著加入緩沖溶液,煮沸變性。最后再離心一分鐘,把上層溶液用于跑膠。

1.2.2 SDS-PAGE電泳

按照普通的8%的膠的方法配制凝膠,跑膠。

1.3 半固體培養(yǎng)基穿刺培養(yǎng)實驗

1.3.1 半固體培養(yǎng)基配制

瓊脂4g/l,牛肉膏粉末3 g/l,蛋白胨5g/l,氯化鈉5 g/l,調節(jié)pH=7.4?；靹蛉芙夂?以3厘米為高度分裝于玻璃試管中。將分裝后的玻璃試管用錫箔紙包住封口。高溫高壓滅菌,放涼。

1.3.2 細菌接種

在超凈工作臺中,用接種針將不同的細菌分別接種在滅菌后的半固體培養(yǎng)基中。穿刺深度以試管中瓊脂高度的1/2-3/4為宜。穿刺軌跡你應循原路退出,刺入及拔出時要接種針不向穿刺線外擺動。穿刺后封口,37℃培養(yǎng),72小時觀察結果。如有細菌沿著穿刺線擴散,那么細菌就有動力。每種菌株重復50次。

1.4 喉上皮細胞粘附實驗（生物膜形成能力檢測）

將兩種不同細菌接種在兩種不同培養(yǎng)基中。喉上皮細胞粘附實驗的方法與之前報道的方法一致［4］。

1.5 SPSS統(tǒng)計分析。

使用SPSS19.0軟件進行相關統(tǒng)計分析。

2 結果

結果表明野生型（MSHB+）有菌毛而突變型（MSHB-）沒有。βactin是內參。

表1 半固體培養(yǎng)基穿刺實驗

圖1 菌毛蛋白表達的免疫印跡

圖2 喉上皮細胞粘附實驗

結果表明野生型（MSHB+）比突變型（MSHB-）維羅納氣單胞菌有更強動力,但之間并無顯著區(qū)別（p＜0.05）。

結果表明在兩種不同培養(yǎng)基中（相對高營養(yǎng)的BHIB和相對低營養(yǎng)的LBA）,野生型（MSHB+）比突變型（MSHB-）維羅納氣單胞菌都具有更強粘附能力,但無論哪一種之間并無顯著區(qū)別（p＜0.05）。

3 討論

生物膜是細菌在表面生活時采取的一種生長方式, 它是細菌的一種本能, 尤其適合細菌在不利環(huán)境中生存,對細菌產生保護作用； 生物膜最重要的特性是對抗生素的高度耐藥性［5］,它能夠有效地阻擋藥物作用于膜內的細菌。生物膜與臨床中、西藥耐藥性是目前研究的熱點。本次實驗結果（表1）證明,有菌毛表達的維羅納氣單胞菌有更強的動力,而更強動力的細菌更能粘附宿主細胞（圖2）。基于菌毛、粘附和生物膜形成之間的關系。通過本次研究,我們揭示了維羅納菌菌毛部分的致病能力,為藥物開發(fā)等研究奠定一定基礎。

［1］Butler M T，Wang Q，Harshey R M.Cell density and mobility protect swarming bacteria against antibiotics.J Proc Natl Acad Sci U S A，2010，107（8）：3776-81.

［2］Merino S，Shaw J G，Tomas J M.Bacterial lateral flagella： an inducible flagella system.J FEMS Microbiol Lett， 2006， 263（2）：127-35.

［3］ Giron J A，Levine M M，Kaper J B.Longus： a long pilus ultrastructure produced by human enterotoxigenic Escherichia coli.J Mol Microbiol，1994，12（1）：71-82.

［4］Thornley，J.P.，Shaw，J.G.，Gryllos，I.A.& Eley，A. （1997）Virulence properties of clinically significant Aeromonas species：evidence for pathogenicity.Review in Medical Microbiology，8，61-72.

［5］Van Houdt R，Michiels C W.Role of bacterial cell surface structures in Escherichia coli biofilm formation.J Res Microbiol，2005，156（5-6）：626-33.

Q2

A

1674-2060（2016）03-0005-01

課題來源： 2015年度湖南省大學生研究性學習和創(chuàng)新性實驗計劃項目（653）；2015年度湖南省教育廳科研項目（15C1255）。

夏金成， 闕彤彤， 張文君， 趙聰，邵陽醫(yī)學高等?？茖W校2014級檢驗專業(yè)學生。

楊秦（1981—），男，講師，主要研究方向為生物化學與分子生物學。