江欣倚 劉玲 熊靖飛 趙楚寧

（四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院 四川成都 610041）

限制性末端片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析技術(shù)及其在腸道微生物研究中的應(yīng)用

江欣倚 劉玲 熊靖飛 趙楚寧

（四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院 四川成都 610041）

限制性末端片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析技術(shù)（Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism，T-RFLP）具有高通量，低成本，低勞動(dòng)力等特點(diǎn)，是微生物生態(tài)學(xué)家在探索群落結(jié)構(gòu)，功能及其動(dòng)態(tài)變化中的一項(xiàng)實(shí)用方便的工具。自2012年至今，T-RFLP在腸道微生物領(lǐng)域研究方向不斷拓寬，隨后T-RFLP技術(shù)被更多的應(yīng)用于人體相關(guān)疾病與腸道微生物關(guān)系的研究中。盡管T-RFLP技術(shù)仍存在不足，但隨著16SrRNA基因序列數(shù)據(jù)庫(kù)和引物的改進(jìn)，數(shù)據(jù)生成和分析統(tǒng)計(jì)工具的運(yùn)用，T-RFLP最終將能在各個(gè)領(lǐng)域體現(xiàn)其價(jià)值，為人類(lèi)疾病研究事業(yè)帶來(lái)貢獻(xiàn)。

限制性末端片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析 腸道菌群 動(dòng)態(tài)變化 多樣性

1 T-RFLP技術(shù)簡(jiǎn)介

1.1 T-RFLP技術(shù)原理

T-RFLP分析技術(shù)是一種利用對(duì)細(xì)菌基因組中的保守序列（如16SrDNA）的T-RFs長(zhǎng)度的多態(tài)性分析進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌分型的群落研究技術(shù)。該技術(shù)的基本原理是根據(jù)靶序列的保守區(qū)設(shè)計(jì)通用引物，以熒光標(biāo)記引物的5’末端，并用限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)目標(biāo)片段進(jìn)行酶切，隨后以待分析樣的總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再選用合適的限制性?xún)?nèi)切酶消化擴(kuò)增產(chǎn)物。由于核苷酸序列在不同菌的擴(kuò)增片段中存在差異，酶切位點(diǎn)也不盡相同，據(jù)此得到不同長(zhǎng)度的限制性片段。最后對(duì)消化后的產(chǎn)物進(jìn)行自動(dòng)測(cè)序儀測(cè)定，只有末端帶有熒光性標(biāo)記的片段能被檢測(cè)并可用T-RFs反映了微生物群落的組成情況。因此可用全部帶有熒光的T-RFs的長(zhǎng)度和豐度代表群落結(jié)構(gòu)的多樣性。

1.2 T-RFLP分析腸道微生物的主要步驟

T-RFLP分析腸道微生物的主要步驟包括：（1）DNA的提??；（2）標(biāo)記引物分子PCR擴(kuò)增；（3）擴(kuò)增產(chǎn)物的純化、酶切；（4）結(jié)果測(cè)定及分析。

1.3 T-RFLP技術(shù)評(píng)價(jià)

隨著T-RFLP的廣泛運(yùn)用，T-RFLP技術(shù)在關(guān)鍵環(huán)節(jié)上的不足也被暴露出來(lái)，本部分主要將T-RFLP技術(shù)與另一指紋圖譜技術(shù)DGGE的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行比較（表1）。

2 技術(shù)在腸道微生物研究方面的應(yīng)用

2.1 T-RFLP的實(shí)驗(yàn)對(duì)象的發(fā)展

嚙齒類(lèi)動(dòng)物、哺乳動(dòng)物、環(huán)節(jié)動(dòng)物、魚(yú)類(lèi)、禽類(lèi)和人類(lèi)等均可作為T(mén)-RFLP檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)對(duì)象。T-RFLP早年的實(shí)驗(yàn)對(duì)象多為魚(yú)類(lèi)、禽類(lèi)、嚙齒類(lèi)動(dòng)物、哺乳類(lèi)動(dòng)物等，自2012年至今，T-RFLP研究領(lǐng)域不斷拓寬，從大鼠，小鼠等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物階段到廣泛應(yīng)用于養(yǎng)殖業(yè)以及野生動(dòng)物保護(hù)研究.隨后， T-RFLP技術(shù)被大量運(yùn)用于與人體相關(guān)的飲食因素，疾病研究當(dāng)中。Akira Andoh等［4］通過(guò)將患者與健康受試者腸道的微生物組成進(jìn)行組間及組內(nèi)對(duì)比后發(fā)現(xiàn)患者與受試者，發(fā)現(xiàn)病人腸道內(nèi)含有健康個(gè)體沒(méi)有的胃瘤球菌屬、真細(xì)菌、梭菌、γ-變形菌、非典型的擬桿菌和非典型乳桿菌，得出克萊恩?。–rohn’s disease）與腸道菌群的組成有關(guān)系.Katsuyuki Fukuda等［5］通過(guò)對(duì)患不同類(lèi)型化膿性大腸炎病人的腸道微生物進(jìn)行T-RFLP分析，再對(duì)其結(jié)果進(jìn)行線(xiàn)性判別分析并計(jì)算出判別系數(shù)后發(fā)現(xiàn)，判別系數(shù)與化膿性大腸炎的活動(dòng)性程度有關(guān)，提示可以通過(guò)判別系數(shù)DS對(duì)化膿性大腸炎的活動(dòng)性進(jìn)行預(yù)測(cè)與判斷。

2.2 T-RFLP具體方法的應(yīng)用發(fā)展

T-RFLP的方法分為單熒光T-RFLP和雙熒光T-RFLP，張慧等［6］建立的雙熒光T-RFLP在準(zhǔn)確性和靈敏性方面，與傳統(tǒng)T-RFLP技術(shù)相比基本一致或優(yōu)于。通過(guò)參數(shù)優(yōu)化，可以在保證準(zhǔn)確度的前提下，獲得較高的靈敏度。由于單熒光T-RFLP成本低廉，檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和靈敏度可以滿(mǎn)足大多數(shù)實(shí)驗(yàn)要求，近些年，大部分研究使用的均為單熒光T-RFLP。

表一T-RFLP與DGGE技術(shù)優(yōu)缺點(diǎn)分析

T-RFLP檢測(cè)過(guò)程涉及引物、酶、熒光素等。常見(jiàn)的真菌引物為ITS1F、ITS4R，古生菌引物為Ar3f、Ar927r，常用的細(xì)菌引物為27F、8F、63F、7F、1492R、1510R等，熒光一般標(biāo)記27F、8F、63F引物的5'端，其中27F和8F最為常用。目前常用的熒光物質(zhì)有6-羧基熒光素、NED、Cy5、D4熒光素等。T-RFLP技術(shù)一般用引物擴(kuò)增細(xì)菌片段16SrRNA和16SrDNA，真菌的擴(kuò)增片段是ITS序列，古生菌為16SrRNA。用于酶切PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的限制性?xún)?nèi)切酶較多，其中MspI、HhaI、HaeIII、RsaI比較常用；隨著T-RFLP技術(shù)的發(fā)展，限制性?xún)?nèi)切酶種類(lèi)也越來(lái)越多，近兩年相繼出現(xiàn)了實(shí)驗(yàn)使用限制性?xún)?nèi)切酶BfaI和AluI。

2.3 腸道菌群數(shù)據(jù)分析方法進(jìn)展

可用于T-RFLP數(shù)據(jù)分析的方法較多。原始T-RFLP數(shù)據(jù)可以利用TAP-T-RFLP和T-RFPred等在線(xiàn)工具，用一些抑制酶和其相關(guān)的“T-RFs”模式的預(yù)測(cè)對(duì)16SrRNA基因（庫(kù)）進(jìn)行電子消化后分析。最近，一些應(yīng)用如系統(tǒng)賦值工具（PAT），T-對(duì)齊（T-Align），ARB集成軟件工具，TRF-CUT，TRiFLe和T-RFLP統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析軟件［7］等被運(yùn)用的較多，其可用于完成剖面對(duì)比、樹(shù)狀圖形式等任務(wù)從而對(duì)數(shù)據(jù)和相似性的表達(dá)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。在眾多分析方法中，一般而言，PCA，MDS，SOM和AMMI推薦用于群落成員之間相似性和差異性的可視化處理；集群分析和貝葉斯分析用于分群鑒定；CCA和RDA用于將微生物群落變化與環(huán)境的變化聯(lián)系起來(lái)［8］。

3 技術(shù)前景展望

T-RFLP技術(shù)盡管還存在不足，但毋庸置疑，其仍然是現(xiàn)今最好的分析微生物群落結(jié)構(gòu)的工具之一。將來(lái)，隨著16SrRNA基因序列數(shù)據(jù)庫(kù)和引物的改進(jìn)，數(shù)據(jù)生成和分析過(guò)程中精制協(xié)議和統(tǒng)計(jì)工具的運(yùn)用以及分析方法的分辨率和分析技術(shù)的不斷提高，T-RFLP最終將能在腸道微生物群落結(jié)構(gòu)，微生物與環(huán)境、宿主之間的關(guān)系等方面將發(fā)揮更大的作用。隨著時(shí)間的推移，我們有理由相信TRFLP技術(shù)將會(huì)越來(lái)越成熟，也將在人腸道菌群與人類(lèi)健康的研究領(lǐng)域中發(fā)揮重要的作用。

［1］Osborn AM， Moore ERB， Timmis KN （1999） An evaluation of terminal restriction fragment length polymorphism （T-RFLP） analysis for the study of microbial community dynamics. Environ Microbiol，2000（1）：39-50.

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［3］Osborn AM， Moore ERB， Timmis KN （1999） An evaluation of terminal restriction fragment length polymorphism （T-RFLP）analysis for the study of microbial community dynamics. Environ Microbiol，2000（1）：39-50.

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［5］Katsuyuki Fukuda，Yoshiyuki Fujita；Determination of the discriminant score of intestinal microbiota as a biomarker of disease activity in patients with ulcerative colitis；BMC Gastroenterology 2014（14）：49.

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