陳顏嫣 張振強(qiáng)

（河南中醫(yī)學(xué)院 河南鄭州 450002）

線(xiàn)栓法制備大鼠腦缺血模型的要點(diǎn)和體會(huì)

陳顏嫣 張振強(qiáng)*

（河南中醫(yī)學(xué)院 河南鄭州 450002）

目的：提高線(xiàn)栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈腦缺血模型的成功率。方法：從鼠種、鼠齡、性別、側(cè)別方面選擇大鼠，分離頸總、頸內(nèi)動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈，結(jié)扎頸總、頸外動(dòng)脈，用魚(yú)線(xiàn)和指甲油的改良線(xiàn)栓法制備線(xiàn)栓，經(jīng)由頸總動(dòng)脈剪一小口，將制備好的栓線(xiàn)插入頸總動(dòng)脈，并推送入頸內(nèi)動(dòng)脈。根據(jù)大鼠體重和施術(shù)者手感選擇合適的進(jìn)線(xiàn)深度，阻斷大腦中動(dòng)脈，制備模型，并觀(guān)察大鼠腦組織的病理改變。結(jié)果：造模成功率明顯提高，模型符合腦梗死的病理過(guò)程。結(jié)論：改良后的方法模型成功率提高，可復(fù)制性強(qiáng)。

大鼠 腦缺血 魚(yú)線(xiàn)線(xiàn)栓

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)造模是關(guān)鍵。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外報(bào)道了很多制備局灶性腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ偷姆椒ā?989年Longa開(kāi)創(chuàng)了尼龍線(xiàn)栓法插入頸內(nèi)動(dòng)脈制成大腦中動(dòng)脈腦缺血模型。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合臨床實(shí)際制備永久性腦缺血模型，在經(jīng)典的線(xiàn)栓法基礎(chǔ)上改進(jìn)取得了滿(mǎn)意的效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 大鼠的選擇

1.1.1.1鼠種的選擇 SD大鼠解剖結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，分離血管難度小造模時(shí)出血量少。腦梗死體積穩(wěn)定，易飼養(yǎng)繁殖，對(duì)損傷及外界刺激耐受性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)作為腦梗塞大鼠的首要選擇。［1］此外大鼠分布于左側(cè)頸部的迷走神經(jīng)直接分布與心臟，分離血管時(shí)易損傷神經(jīng)，對(duì)鼠的生命安全帶來(lái)威脅。所以盡量選擇右側(cè)入路。［2］此法較正中切口，易行肌肉分離，視野暴露好。降低解剖難度和危險(xiǎn)系數(shù)。［3］

1.1.1.2鼠性別的選擇

鼠行為的不對(duì)稱(chēng)性和性別有關(guān)。ROSS［4］等觀(guān)察剛出生的雌性大鼠鼠尾偏向右側(cè)，而雄性鼠則無(wú)此差異。雌性激素對(duì)腦損傷也有保護(hù)作用，對(duì)鼠機(jī)體耐受性，行為不定性有一定的干擾。為避免雌性鼠的尾偏性和雌激素對(duì)腦梗塞后神經(jīng)功能評(píng)分影響，腦梗塞模型選擇雄性大鼠。［5］

1.1.1.3鼠齡、體重的選擇

因腦梗塞多發(fā)于老年人群，但老齡大鼠的MCA發(fā)生了不同程度的迂曲，血管壁變脆，內(nèi)膜的基底膜增厚、斷裂或分層，對(duì)手術(shù)的耐受性也明顯降低［6］。所以鼠齡選擇仍以青年健壯的為宜。大鼠的體重與MCA的粗細(xì)及長(zhǎng)度呈正相關(guān)，體重大于350g，顱內(nèi)血管增粗，難以充分阻斷MCA血流［7］；體重小于240g，血管纖細(xì)線(xiàn)栓難以插入。理想體重大鼠以240-300g之間為宜［8］。

1.1.2 線(xiàn)栓的準(zhǔn)備

剪下5cm長(zhǎng)一段魚(yú)線(xiàn)，在1.8-2.0cm的地方做標(biāo)記，把距標(biāo)記1. 8-2.0cm的頭端插入指甲油中制作一個(gè)光滑的栓子，晾干備用。260-300g體重大鼠選擇直徑0.28mm的魚(yú)線(xiàn)，240-260g體重大鼠選擇0.265mm的魚(yú)線(xiàn)。

1.2 方法

1.2.1 線(xiàn)拴法制備大鼠腦缺血模型

術(shù)前12h須禁食，可自由攝水。高血糖條件下，腦缺血再灌注后腦組織梗塞面積及神經(jīng)功能缺損癥狀會(huì)顯著加重，死亡率明顯增加。［9］

大鼠根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求隨機(jī)分組稱(chēng)重后，麻醉后，仰臥位固定于鼠板上，消毒手術(shù)區(qū)。第一；分離血管。在頸部剪一5mm左右豎形切口，用眼科鑷子小心分離組織，仔細(xì)鈍性分離頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈。第二；打三個(gè)結(jié)。頸外動(dòng)脈打死結(jié)。在頸總動(dòng)脈上距y型分叉1. 5cm處、打死結(jié)阻斷血流。在頸總動(dòng)脈Y型分叉0.5cm處打一個(gè)活結(jié)。頸內(nèi)動(dòng)脈暫用血管夾夾畢閉。第三；剪口。在頸總動(dòng)脈的兩根結(jié)扎線(xiàn)間，手術(shù)剪與血管成45度角剪一楔形小口，口越小越好。此時(shí)會(huì)有少許血液流出是正?，F(xiàn)象。第四；插線(xiàn)。迅速把魚(yú)線(xiàn)帶栓子一頭弧度方向朝上插入剪口處，左手把頸外動(dòng)脈的結(jié)扎線(xiàn)向外拉使頸內(nèi)動(dòng)脈、頸總動(dòng)脈處于一條直線(xiàn)上，右手用眼科鑷把魚(yú)線(xiàn)順著血管走行方向插入頸內(nèi)動(dòng)脈。第五；控制進(jìn)線(xiàn)深度。當(dāng)至頸內(nèi)動(dòng)脈時(shí)，頸總動(dòng)脈上活結(jié)打成死結(jié)。松開(kāi)夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈的血管夾，推動(dòng)標(biāo)記點(diǎn)到達(dá)y型分叉處。此時(shí)要特別注意手感，若有落空感，即表明線(xiàn)栓頭端已插入大腦中動(dòng)脈。

造模后傷口撒青霉素粉，層層縫合。仰臥位于干凈鼠籠中，60w白熾燈距30cm照射，保證大鼠蘇醒溫度。過(guò)夜應(yīng)將溫度保持在25度左右。［10］線(xiàn)栓入分叉約1cm左右時(shí)，經(jīng)常會(huì)感覺(jué)阻力，是線(xiàn)栓穿顱時(shí)遇到狹窄所致，強(qiáng)行推入易損傷血管，應(yīng)將線(xiàn)栓退至切口處，調(diào)整方向重新插入.［11］盲目多次進(jìn)退，損傷或刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞引起某些活性物質(zhì)釋放激發(fā)血栓，造成動(dòng)物存活率下降。

1.2.2 造模成功的評(píng)價(jià)

動(dòng)物蘇醒后兩小時(shí)評(píng)分，評(píng)分參照Longa 5級(jí)評(píng)分法進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分［12］

0分：無(wú)體征；1分：動(dòng)物左側(cè)前肢不能完全伸展；2分：左前膚癱瘓，出現(xiàn)追尾現(xiàn)象；3分：肢體癱瘓，不能站立；4分：動(dòng)物昏迷，無(wú)自主性活動(dòng)。

按照實(shí)驗(yàn)要求1-2分的動(dòng)物表示造模成功。

腦梗塞的金標(biāo)準(zhǔn)是TTC染色法，四氮唑紅（2，3，5-trephenylte trazolium chloride，TTC）是一種水溶性鹽，與活細(xì)胞線(xiàn)粒體內(nèi)脫氫酶反應(yīng)，生成深紅色脂溶性物質(zhì)。正常組織染成均勻的深紅色，而梗死組織不著色，為蒼白色。

圖1 大鼠腦組織TTC染色

2 結(jié)果

經(jīng)過(guò)我們多次試驗(yàn)反復(fù)摸索，舍棄了文獻(xiàn)中的用玻璃膠和火燒法制造魚(yú)線(xiàn)栓子。［13］探索出了用指甲油做栓子，指甲油價(jià)格低廉，性能穩(wěn)定，短時(shí)間內(nèi)不易脫落；我們總結(jié)了三結(jié)一夾的方法，頸外動(dòng)脈死結(jié)，頸總動(dòng)脈先近心端死結(jié)遠(yuǎn)心端活結(jié)，頸內(nèi)動(dòng)脈血管夾，然后魚(yú)線(xiàn)從活結(jié)和死結(jié)間剪口進(jìn)頸總后，活結(jié)變死結(jié)，最后魚(yú)線(xiàn)進(jìn)頸內(nèi)動(dòng)脈時(shí)，松開(kāi)血管夾。從頸總動(dòng)脈直線(xiàn)進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈，操作難度也大大降低。改良后大鼠造模成功率明顯提高，腦梗死面積穩(wěn)定。TTC染色見(jiàn)圖1。

3 討論

缺血性腦血管病是神經(jīng)科的常見(jiàn)病，多發(fā)病。［14］在腦血管病中，缺血性腦血管病占70%，而大腦中動(dòng)脈梗阻型又占其中的百分之六十。所以，MCAO的研究在腦病的研究中占有重要地位。用大鼠復(fù)制腦缺血模型有成本低，種系內(nèi)純和性好，腦血管的解剖特點(diǎn)與人類(lèi)相似等優(yōu)點(diǎn)。［15］

纏于塑料圓圈模上的魚(yú)線(xiàn)曲屈度符合顱內(nèi)血管的走向，白色魚(yú)線(xiàn)標(biāo)記后入血管容易看見(jiàn)標(biāo)記從而控制魚(yú)線(xiàn)插入的長(zhǎng)度。魚(yú)線(xiàn)有一定的彈性質(zhì)感，不像尼龍線(xiàn)線(xiàn)太過(guò)柔軟而隨意改變方向。魚(yú)線(xiàn)遇水后變直而失去其原有的曲度。

多次實(shí)驗(yàn)表明，根據(jù)體重選擇線(xiàn)栓直徑至關(guān)重要。260-300g體重大鼠選擇直徑0.28mm的魚(yú)線(xiàn)，240-260g體重的大鼠選擇0. 265mm的魚(yú)線(xiàn)。梗塞面積穩(wěn)定，可復(fù)制性強(qiáng)。通過(guò)頸外動(dòng)脈進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈即從Y形分叉的兩個(gè)分叉的一支進(jìn)入另一支有很大的難度，實(shí)驗(yàn)操作可行性更差。而從頸總?cè)腩i內(nèi)總體上呈直線(xiàn)進(jìn)入，操作簡(jiǎn)單，可復(fù)制性強(qiáng)。1.8-2.0cm的進(jìn)線(xiàn)深度和小于1.8cm大于2.2cm的進(jìn)線(xiàn)深度比在提高成功率和減小損傷度方面是最合適的。小于1.8cm的進(jìn)線(xiàn)深度往往未達(dá)到大腦中動(dòng)脈而沒(méi)有神經(jīng)功能缺損癥狀，大于2. 2cm時(shí)大鼠梗塞癥狀重，死亡率大幅度提升。［16］

［1］包玉龍，朱竟赫，范英蘭，等.線(xiàn)栓法與改良三氯化鐵法致大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞模型的對(duì)比研究［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2014，23（2）：26-27.

［4］田瑩，余化霖.線(xiàn)栓法大鼠局灶性腦缺血模型制作要點(diǎn)及進(jìn)展［J］.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)報(bào)，2011，32（2）：256-258

［5］范瑞娟，羅亞非，孫玉鳳，等.新式線(xiàn)栓法建立大鼠局灶性腦缺血再灌注模型的建立［J］.中國(guó)民族民間醫(yī)學(xué)，2014，23（2）：26-27.

［6］郭曉利，肖偉.線(xiàn)栓法大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ偷挠绊懸蛩靥轿觯跩］.中醫(yī)藥臨床雜志，2012，24（3）：239-241.

［7］楊飛雪，汪寧.淺談缺血性腦血管病的病理生理機(jī)制［J］.黑龍江醫(yī)藥，2014，6（24）：1283-1285

［8］陳曉娟，肖宗宇.改良線(xiàn)栓法大鼠腦缺血再灌注損傷模型的建立［J］.中國(guó)醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2015，12（3）：128-129

［9］何芳雁，韓春妮，李艷，等.制作線(xiàn)栓法大鼠腦缺血再灌注模型的要點(diǎn)和體會(huì)［J］.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)，2013，30（4）：46-48.

［10］陳小睿，孟憲麗，孟寶華，等.線(xiàn)栓法制備大鼠局灶性腦缺血模型的評(píng)價(jià)與思考［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2009，20（2）：424-427.

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1674-2060（2016）02-0308-02

河南省高校人才項(xiàng)目（14204247）不同基礎(chǔ)病變合并腦缺血大鼠模型對(duì)神經(jīng)血管單元的影響

陳顏嫣（1988—），女，漢族，河南省唐河縣人，河南中醫(yī)學(xué)院2013級(jí)碩士研究生，致力于中西醫(yī)結(jié)合防治腦血管疾病的相關(guān)研究。

張振強(qiáng)（1971—），男，漢族，河南省伊川人，河南中醫(yī)學(xué)院科研處教授，致力于中西醫(yī)結(jié)合防止腦病的基礎(chǔ)和臨床研究。