伊力亞爾·尼加提 王珊珊 王俊坡 商瑜 何大澄

（北京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院細(xì)胞增殖與調(diào)控生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100875）

ICF45單克隆抗體的制備及其鑒定

伊力亞爾·尼加提 王珊珊 王俊坡 商瑜 何大澄

（北京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院細(xì)胞增殖與調(diào)控生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100875）

本研究利用RT-PCR的方法擴(kuò)增出人ICF45基因片段并將其構(gòu)建至原核表達(dá)載體pET-30a，隨后將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，用IPTG誘導(dǎo)大量表達(dá)ICF45蛋白。利用純化的ICF45蛋白免疫BALB/c小鼠后，取其脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行融合，采用間接酶聯(lián)免疫ELISA篩選陽(yáng)性克隆，最終獲得了2株分泌ICF45抗體的雜交瘤細(xì)胞。Western Blot、免疫熒光和免疫組化結(jié)果均顯示其分泌的抗體能特異性識(shí)別ICF45蛋白，并且該抗體靈敏度高、特異性強(qiáng)。本研究獲得的ICF45單克隆抗體，為深入闡明ICF45在人類(lèi)細(xì)胞周期調(diào)控和腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制提供了重要的工具。

ICF45 蛋白純化 單克隆抗體； ELISA

ICF45（Interphase cytoplasmic foci protein 45）蛋白是本實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新的胞質(zhì)蛋白。研究表明，ICF45不僅參與到細(xì)胞正常的生理過(guò)程，而且在疾病、腫瘤和變態(tài)反應(yīng)中也具有重要作用，揭示其具有重要的生物學(xué)功能和意義［1-5］。我們前期研究結(jié)果顯示，ICF45的表達(dá)具有高度細(xì)胞周期時(shí)相特異性，其在細(xì)胞間期定位于細(xì)胞質(zhì)，在核膜附近形成1-2個(gè)特異性的點(diǎn)狀聚焦，與中心體有共定位；而在細(xì)胞有絲分裂期則消失［6］。但是，就其與中心體共定位及在核膜附近聚集等的生物學(xué)意義仍未明確。為了更有效的研究ICF45蛋白的生物學(xué)功能，本研究首次制備ICF45單克隆抗體，并對(duì)純化的抗體進(jìn)行了一系列鑒定，以期為研究ICF45亞細(xì)胞定位以及相互作用蛋白提供工具，進(jìn)而能深入闡述ICF45在腫瘤發(fā)生及細(xì)胞周期調(diào)控中的生物學(xué)功能。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、細(xì)胞、菌株及質(zhì)粒

BALB/c小鼠，雌性，6-8周齡（由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院蛋白質(zhì)組學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供）；小鼠骨髓瘤細(xì)胞系SP2/0（由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院蛋白質(zhì)組學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供）；大腸桿菌DH5α和BL-21（購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)公司）；HeLa細(xì)胞、293T細(xì)胞（本實(shí)驗(yàn)室保存）；質(zhì)粒pGEX-2T（購(gòu)于GE公司，目錄號(hào)：28-9546-53）、質(zhì)粒pET-30a（購(gòu)于Novagen公司，目錄號(hào)：69909-3）；正常人胃粘膜組織石蠟包埋切片（由中國(guó)人民解放軍第二炮兵總醫(yī)院病理科提供）。

1.2主要試劑

實(shí)驗(yàn)所用分子克隆相關(guān)酶和配套溶液購(gòu)自TaKaRa公司。Trizol，DNA Marker，PAGE膠蛋白微量回收試劑盒，弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑，RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基粉末和DMEM培養(yǎng)基粉末，胎牛血清，50%聚乙二醇PEG4000、青鏈霉素溶液、HAT培養(yǎng)基、HT培養(yǎng)基、辣根酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG，化學(xué)發(fā)光顯色液試劑盒，Protein G IgG 結(jié)合緩沖液/洗脫緩沖液，抗體亞型鑒定試劑盒。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1pET-30a/ICF45質(zhì)粒構(gòu)建

ICF45全長(zhǎng)基因序列在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（NCBI）上的登錄號(hào)為：AY463216。引物設(shè)計(jì)按照此基因片段為模板，在兩端加入了雙酶切位點(diǎn)。

從子宮頸癌細(xì)胞系（HeLa）細(xì)胞中提取總RNA，用反轉(zhuǎn)錄酶合成互補(bǔ)的雙鏈 cDNA，利用之前合成的引物將ICF45基因片段從cDNA中擴(kuò)增。ICF45片段和質(zhì)粒載體pGEX-2T采用Nde I和Xho I雙酶切后，用T4連接酶16℃連接過(guò)夜。連接產(chǎn)物導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)菌E.coli中，涂布在含有抗生素（卡那霉素）的瓊脂平板上，倒置于37℃培養(yǎng)16h，挑取單克隆菌落培養(yǎng)過(guò)夜。

1.3.2蛋白表達(dá)與包涵體純化

將重組載體pET-30a/ICF45轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)大腸桿菌，得到重組菌BL21/pET-30a/ICF45。

小量培養(yǎng)BL21/ pET-30a/ICF45表達(dá)菌，取適量轉(zhuǎn)移到大量培養(yǎng)基中至OD600約0.6，加IPTG（終濃度0.2mM）30℃誘導(dǎo)5h，離心集菌，用洗滌液洗兩次，超聲破碎，13000 rpm 4℃離心10min，再用洗滌液洗三次，最后用dd H2O重懸，加等體積loading buffer，100℃ 10 min，12000g 5 min，收集上清液SDS-PAGE電泳純化。

包涵體蛋白經(jīng)12% SDS-PAGE電泳，1% KCl浸泡膠15 min，用刀片切下白色目的條帶，用膠回收試劑盒對(duì)包涵體蛋白進(jìn)行回收。用緩沖液稀釋至1mg/ml，最終得到ICF45胞外純化蛋白，-80℃凍存。

1.3.3動(dòng)物免疫與雜交瘤細(xì)胞株的建立

選2只8周齡BALB/c小鼠進(jìn)行腹腔內(nèi)免疫，初次免疫用80ug ICF45胞外純化蛋白加弗氏完全佐劑，兩周后，用40ug ICF45加弗氏不完全佐劑強(qiáng)化免疫2次，每次間隔2周，最后一次用ICF45采用靜脈注射強(qiáng)化免疫（不含佐劑），3天后尾部采血鑒定免疫情況。

融合前4天強(qiáng)化免疫小鼠，取出小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/ 0比例為10：1用PEG4000融合，選擇培養(yǎng)基為含HAT的RPMI1640培養(yǎng)基。經(jīng)過(guò)10天培養(yǎng)，采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）進(jìn)行三輪亞克隆篩選，同時(shí)輔以免疫印跡法（Western Blot）的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，挑選并擴(kuò)大培養(yǎng)分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞，細(xì)胞株留存于液氮中。

1.3.4單克隆抗體的制備

注射滅菌石臘于BALB/c小鼠，7天后腹腔注射建系成功的雜交瘤細(xì)胞約1×106個(gè)。7天后觀(guān)察小鼠腹水生產(chǎn)情況，如腹部明顯膨大，即可抽取腹水。腹水采集后13000 rpm離心10min除去油脂和沉淀，收集上清液，即為腹水單克隆抗體。

1.3.5單克隆抗體濃度、分子量和效價(jià)的測(cè)定

圖1　ICF45蛋白基因的PCR擴(kuò)增（a）與雙酶切驗(yàn)證（b）

圖2　SDS-PAGE分析pET-30a/ICF45的表達(dá)

圖3　Western Blot及ELISA檢測(cè)免疫后小鼠的多抗血清

圖4　ICF45融合后亞克隆篩選24孔檢測(cè)

單抗?jié)舛葴y(cè)定：通過(guò)Bradford法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)作為定量的標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)單抗樣品在595nm處測(cè)吸光度值，最終得到其濃度。

單抗分子量測(cè)定：電泳濃縮膠5%，分離膠濃度12%，電場(chǎng)強(qiáng)度10伏/厘米，電泳時(shí)間2-3 h。取下凝膠染色及脫色，通過(guò)蛋白分子標(biāo)準(zhǔn)確定單克隆抗體分子量，重復(fù)3次。

單抗效價(jià)測(cè)定：用2ug/ml ICF45蛋白包被96孔板，4 ℃過(guò)夜后洗滌3次，加封閉液 150ul/孔放置37℃封閉2h，洗滌3次。加入單抗，第一孔1：400稀釋?zhuān)蟮目?：4的梯度倍比稀釋?zhuān)?50nm單波長(zhǎng)測(cè)定各孔OD值，并用陰性對(duì)照孔PBS。OD值的比值大于為陽(yáng)性。

2　結(jié)果

2.1ICF45蛋白基因的擴(kuò)增與序列測(cè)定

HeLa細(xì)胞提取總RNA并逆轉(zhuǎn)錄，對(duì)得到的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果與預(yù)期的ICF45全長(zhǎng)基因序列896bp吻合（圖1a）。將ICF45克隆進(jìn)pET-30a質(zhì)粒并雙酶切得到大小相對(duì)應(yīng)的片段（圖1b）。測(cè)序結(jié)果亦顯示構(gòu)建的重組載體成功。

2.2ICF45重組蛋白表達(dá)和純化

將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒pET-30a/ICF45轉(zhuǎn)入原核表達(dá)系統(tǒng)大腸桿菌BL-21感受態(tài)，IPTG誘導(dǎo)外源蛋白表達(dá)。與未經(jīng)誘導(dǎo)的菌株（如圖2，泳道2）相比較，0.2mM IPTG誘導(dǎo)后可以獲得ICF45蛋白的高效表達(dá)。其蛋白分子量約為34kD，與預(yù)期值一致，但主要以不溶的包涵體形式存在。因此我們采用膠回收的方式，富集ICF45蛋白用來(lái)免疫動(dòng)物。

2.3雜交瘤細(xì)胞株建立

利用兩只免疫后的BAL B/c小鼠血清對(duì)HeLa細(xì)胞提取物進(jìn)行Western Blot檢測(cè)，結(jié)果顯示，在34kD左右的位置有明顯的一條特異條帶（圖3a），依此可以判斷兩只小鼠均免疫成功。選取其中一只小鼠的血清做ELISA效價(jià)測(cè)定（圖3b），測(cè)試結(jié)果顯示，血清效價(jià)為1：102400。符合后續(xù)試驗(yàn)要求，故選取該小鼠進(jìn)行后續(xù)的細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)。

對(duì)融合細(xì)胞培養(yǎng)上清經(jīng)過(guò)間接ELISA鑒定陰性和陽(yáng)性，并通過(guò)三輪的細(xì)胞亞克隆篩選（圖4），最終得到2株穩(wěn)定分泌單抗的雜交瘤細(xì)胞系，分別是F6E4C12F11和F5H1D1H2。圖4a為第二輪24孔篩選，用PBS作為陰性對(duì)照；圖4b為第三輪24孔篩選，同樣是PBS作為陰性對(duì)照。

2.4單克隆抗體特異性分析

2.4.1單克隆抗體分子量和效價(jià)鑒定

對(duì)所得純化之后的腹水進(jìn)行SDS-PAGE分析，電泳結(jié)果見(jiàn)圖5a，兩株抗體F6E4C12F11和F5H1D1H2分別在1，2泳道。從圖可見(jiàn)，兩條泳道均有兩條明顯的電泳條帶，分子量約為55KD和26KD，和小鼠IgG的重鏈和輕鏈的理論值一致，可見(jiàn)二株單克隆抗體的均一性較好。與此同時(shí)檢測(cè)該抗體濃度，為5mg/ml。

而ELISA檢測(cè)梯度稀釋后的單抗，其效價(jià)達(dá)到1：240000（圖5b）。

2.4.2單克隆抗體Western Blot檢測(cè)

圖6所示，a為抗體F6E4C12F11，b為抗體F5H1D1H2，泳道1為HeLa WT細(xì)胞提取物，泳道2為293T細(xì)胞過(guò)量表達(dá)ICF45細(xì)胞提取物，泳道3為體外純化的ICF45蛋白。用體外純化的ICF45蛋白作為陽(yáng)性對(duì)照，在野生型細(xì)胞和過(guò)量表達(dá)ICF45的細(xì)胞中均檢測(cè)到特異性條帶，約在34KD左右，和ICF45的分子量一致。

圖5　腹水純化后SDS-PAGE分子量檢測(cè)（a）和ELISA效價(jià)檢測(cè)（b）

圖6　Western Blot檢測(cè)兩株抗體特異性

3　討論

親和層析配體、免疫抑制劑、，甚至還能在腫瘤個(gè)性化治療中起到導(dǎo)向作用，而且單克隆抗體。在本研究中，我們成功制備了高靈敏度的ICF45的單克隆抗體，這為后期ICF45相互作用蛋白的篩選和鑒定、ICF45亞細(xì)胞精確定位等方面提供優(yōu)良的工具。單克隆抗體可作為研究的探針，與細(xì)胞提取物或組織發(fā)生免疫識(shí)別，可對(duì)研究目標(biāo)進(jìn)行定性、定量的精準(zhǔn)檢測(cè)，是目前研究蛋白功能的重要的工具。

本課題在前期的研究中，都是使用標(biāo)簽抗體或者兔多克隆抗體。標(biāo)簽抗體只能識(shí)別通過(guò)轉(zhuǎn)染過(guò)量表達(dá)的ICF45，眾所周知過(guò)表達(dá)的細(xì)胞狀態(tài)無(wú)法和自然生長(zhǎng)的細(xì)胞相提并論，并且過(guò)量表達(dá)的蛋白也不能真實(shí)的反應(yīng)該蛋白的功能。兔多抗能夠識(shí)別抗原多個(gè)表位，雖然能放大低表達(dá)水平的信號(hào)，但問(wèn)題在于不同批次之間的抗體識(shí)別位點(diǎn)不可能一致，不適用于探測(cè)抗原的特定結(jié)構(gòu)域，且后期實(shí)驗(yàn)容易出現(xiàn)重復(fù)性不佳的現(xiàn)象。而單克隆抗體的成功制備解決了以上問(wèn)題，它既是對(duì)內(nèi)源ICF45表達(dá)情況的一個(gè)真實(shí)反映，也能通過(guò)雜交瘤細(xì)胞源源不斷的制備高效、均一的抗體，為課題的持續(xù)可比性提供了保障。

我們的前期研究結(jié)果顯示，穩(wěn)定沉默ICF45可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞HeLa的中心體復(fù)制異常，出現(xiàn)多極紡錘體，微絲和微管變得相當(dāng)發(fā)達(dá)和不規(guī)則，導(dǎo)致胞質(zhì)分裂受阻，出現(xiàn)大量多核細(xì)胞或大核細(xì)胞［6］，并且還會(huì)降低腫瘤細(xì)胞的增殖能力（研究結(jié)果未發(fā)表）。這提示我們ICF45在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中可能起著重要的作用。ICF45特異性抗體的制備，對(duì)于檢測(cè)內(nèi)源ICF45在不同正常或者病變組織中蛋白水平的分布提供了重要而有效的手段和工具，有助于進(jìn)一步揭示ICF45在腫瘤細(xì)胞周期調(diào)控及腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制。

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Q28

A

1674-2060（2016）05-0005-03

高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專(zhuān)項(xiàng)科研基金資助項(xiàng)目（20120003120025）；國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（2011CB915504）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)資金資助項(xiàng)目（2013NT31）。

伊力亞爾·尼加提（1986—），碩士研究生學(xué)歷，新疆醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室實(shí)習(xí)研究員，主要研究方向?yàn)槟[瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和增殖調(diào)控。

商瑜，講師，主要研究方向?yàn)榧?xì)胞增殖調(diào)控和腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)制。

通信作者：何大澄，教授，主要研究方向?yàn)榧?xì)胞周期動(dòng)態(tài)蛋白質(zhì)組學(xué)研究、腫瘤標(biāo)志蛋白的篩選及其在細(xì)胞周期異常中的作用研究。