黃繼義　鐘鴻斌　彭永挑　朱戉述

(廈門市第五醫(yī)院腎內(nèi)科，福建　廈門　361000)

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轉(zhuǎn)化生長因子-β1/Smad3信號(hào)通路在腎間質(zhì)纖維化大鼠腎臟組織中的表達(dá)和作用

黃繼義鐘鴻斌彭永挑朱戉述

(廈門市第五醫(yī)院腎內(nèi)科，福建廈門361000)

目的探討轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1/Smad3信號(hào)通路在腎間質(zhì)纖維化(RIF)大鼠腎臟組織中的表達(dá)和作用。方法80只SD雄性大鼠編號(hào)，隨機(jī)平均分為單側(cè)輸尿管結(jié)扎(UUO)模型組和假手術(shù)組，UUO模型組行大鼠左側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù)，假手術(shù)組游離左側(cè)輸尿管但不予結(jié)扎，術(shù)后第3、7、10、14、21天時(shí)每組分別處死8只，留取大鼠左側(cè)腎臟用于病理以及蛋白測(cè)定,HE、Masson染色光鏡觀察腎臟組織形態(tài)學(xué)的改變，應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡法(Western印跡)和免疫組化法(SP)檢測(cè)TGF-β1、Smad3蛋白表達(dá)，PCR檢測(cè)TGF-β1、Smad3 mRNA的表達(dá)。結(jié)果電鏡觀察結(jié)果顯示RIF大鼠建模成功，隨著結(jié)扎時(shí)間延長，UUO模型組RIF指數(shù)、Smad3與TGF-β1蛋白及mRNA表達(dá)均逐漸升高(P<0.05)，同一時(shí)間UUO模型組各指標(biāo)均高于假手術(shù)組(P<0.05)。Smad3、TGF-β1與RIF指數(shù)呈正相關(guān)(r=0.564，0.735，P<0.05)，TGF-β1與Smad3間呈正相關(guān)(r=0.673，P<0.05)。結(jié)論通過檢測(cè)腎臟組織中Smad3、TGF-β1的表達(dá)可判斷RIF病情，對(duì)疾病的早期發(fā)現(xiàn)有重要意義。

腎間質(zhì)纖維化；轉(zhuǎn)化生長因子-β1/Smad3信號(hào)通路

腎間質(zhì)纖維化(RIF)是慢性腎臟疾病的共同特征，以小管基底膜成分、間質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)發(fā)生定性和定量改變、腎小管萎縮和肌纖維母細(xì)胞積聚為特征〔1〕；腎小管上皮細(xì)胞-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化是RIF的重要發(fā)病機(jī)制之一〔2〕。轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1是一組新近發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和分化的TGF-β超家族，是目前發(fā)現(xiàn)最強(qiáng)的促腎纖維化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，可通過Smad蛋白表達(dá)實(shí)現(xiàn)傳導(dǎo)〔3〕。本文研究TGF-β1/Smad3信號(hào)通路在腎臟組織中的表達(dá)和作用。

1　資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購自廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心健康SD雄性大鼠80只(4～5周齡)，體重150～200 g，室溫喂養(yǎng)、正常飲水，飼養(yǎng)3 d，備用。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器和試劑石蠟切片機(jī)(德國SLEE)、PCR儀(DTC-3G型，西安天隆科技有限公司)，臺(tái)式低溫高速離心機(jī)(TGL20M-湖南湘立科學(xué)儀器有限公司)，酶標(biāo)儀(Thermo熱電 Scienti)、NanoQuant PlateTM微量檢測(cè)板。-80℃冰箱、光學(xué)顯微鏡以及常見微量移液槍、槍頭等。

RIRA蛋白裂解液、BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒、蛋白上清緩沖液及DAB顯色試劑盒均購自南京建成生物工程研究所、Smad3一抗(小鼠抗大鼠)和二抗(兔抗大鼠)均購自圣克魯斯生物技術(shù)公司、β-actin多克隆抗體購自南京生興生物技術(shù)有限公司，TGF-β1多抗購自Santa Cruz Biotech、SP免疫組化試劑盒(通用)購自北京北瑞達(dá)醫(yī)藥科技有限公司、磷酸鹽緩沖液(PBS)、總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3動(dòng)物分組和建模80只SD雄性大鼠進(jìn)行編號(hào)，按照隨機(jī)數(shù)字表法將其分為單側(cè)輸尿管結(jié)扎(UUO)模型組和假手術(shù)組，各40只。UUO模型組行大鼠左側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù)，假手術(shù)組游離左側(cè)輸尿管但不予結(jié)扎，其余手術(shù)步驟與模型組相同。

建模具體步驟：按照35 mg/kg劑量將大鼠用1%戊巴比妥鈉腹腔內(nèi)注射麻醉，將大鼠仰臥四肢固定鼠板上，常規(guī)手術(shù)部位備皮和消毒，取大鼠左肋下0.5 cm為切口，依次切開皮膚、肌肉、組織直到腹膜，游離輸尿管，大約在輸尿管中部夾閉結(jié)扎，完成后逐層縫合，關(guān)閉切口。術(shù)后兩組大鼠常規(guī)喂養(yǎng)，分別于術(shù)后第3、7、10、14、21天時(shí)每組各處死8只，留取大鼠左側(cè)腎臟用于病理以及蛋白測(cè)定，根據(jù)電鏡觀察病理纖維化程度(RIF指數(shù))判斷建模成功與否，RIF指數(shù)>14為建模成功。

1.4腎臟組織形態(tài)學(xué)的改變?nèi)∵m量腎組織，常規(guī)石蠟包埋，甲醛固定，脫水，制厚切片4 μm，行HE、Masson染色，光鏡下觀察腎臟病理改變，×400倍下觀察每張切片，選擇5個(gè)不同的視野，將染色呈綠色的區(qū)域定位為纖維化陽性區(qū)域，以陽性面積/整個(gè)視野面積比值(RIF指數(shù)，取平均值作為每張切片的RIF指數(shù))作為評(píng)價(jià)腎組織纖維化程度指標(biāo)，同時(shí)觀察腎小管解離、“無腎小管的腎小球”等特征。

1.5腎組織Smad3與TGF-β1蛋白和mRNA表達(dá)腎組織Smad3蛋白：采用蛋白質(zhì)印跡法(Western印跡)檢測(cè)腎組織蛋白質(zhì)表達(dá)水平，取30 mg腎組織(液氮保存)，加入適量RIPA裂解液，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行，應(yīng)用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒定量檢測(cè)蛋白總濃度，測(cè)定總蛋白濃度是否符合要求，樣品加入蛋白上樣緩沖液，取30 μg等量蛋白上樣，同時(shí)取2.5 μl Marker標(biāo)志物上樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳2 h，正常轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉1 h，TBST緩沖液清洗4次，加入Smad3一抗，冰上過夜，繼續(xù)TBST緩沖液清洗4次，加入Smad3二抗，常溫孵育1h洗滌，暗箱中檢測(cè)電泳條帶灰度值，計(jì)算蛋白表達(dá)水平。

腎組織TGF-β1蛋白：采用免疫組化法檢測(cè)TGF-β1蛋白表達(dá)，將石蠟切片脫蠟，置于3%H2O2中室溫孵育5～10 min，蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min，滴加PBS代替一抗，37℃孵育1～2 h，PBS沖洗3次，每次5 min，滴加適量生物素標(biāo)記二抗工作液，37℃孵育10～30 min，PBS沖洗，滴加適量辣根酶或堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，37℃孵育10～30 min，DAB顯色，自來水充分沖洗，復(fù)染，脫水，封片。采用高倍鏡觀察切片，以棕色為陽性。腎組織Smad3和TGF-β1 mRNA：取30 mg腎臟組織，嚴(yán)格按照總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒要求步驟進(jìn)行操作，提取的總RNA吸取2 μl于NanoQuant PlateTM微量檢測(cè)板上，于酶標(biāo)儀波長260 nm和280 nm處檢測(cè)吸光度值(OD)，OD260/OD280在1.8～2.0為合格。引物設(shè)計(jì)(β-actin為內(nèi)參)：基因β-actin，GenBank:EF095208.1，長度214 bp，引物序列正義5'GGTGGGAATGGGTCAGAAGG3'，反義5'GTTGGCCTTAGGGTTCAGGG3'；基因Smad3，GenBank:AF016189.1，長度548 bp，引物序列：正義5'AAGGCGACACATTGGGAGAG3'，反義5'ACAGGCTGGTGCCTTAGTTG3'，基因TGF-β1，GenBank:NM_011577.1，長度344 bp，引物序列正義5'GCTGAACCAAGGAGACGGAA3'，反義5'AGAAGTTGGCATGGTAGCCC3'。PCR擴(kuò)增按照兩步法，95℃預(yù)變性3 min，95℃變性20 s，65℃退火20 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS13.0軟件，計(jì)量資料符合正態(tài)分布方差齊性的行組間t檢驗(yàn)，不同天數(shù)比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析，采用Pearson相關(guān)或者Spearman秩相關(guān)。

2　結(jié)　果

2.1腎臟組織形態(tài)學(xué)改變電鏡下觀察，術(shù)后1 w腎臟上皮細(xì)胞出現(xiàn)了空泡，有輕微間質(zhì)水腫，術(shù)后21 d出現(xiàn)彌漫性炎癥細(xì)胞浸潤，各觀察時(shí)間點(diǎn)的RIF指數(shù)>14，說明建模均取得成功。隨著結(jié)扎時(shí)間延長，UUO模型組RIF指數(shù)逐漸升高(P<0.05)，假手術(shù)組各時(shí)間點(diǎn)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；同一時(shí)間UUO模型組RIF指數(shù)均高于假手術(shù)組(P<0.05)。見表1。

2.2腎組織Smad3與TGF-β1蛋白表達(dá) 隨著結(jié)扎時(shí)間延長，UUO模型組Smad3與TGF-β1蛋白表達(dá)逐漸升高(P<0.05)，假手術(shù)組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；同一時(shí)間UUO模型組蛋白表達(dá)水平均高于假手術(shù)組(P<0.05)。見表2。

2.3腎組織Smad3與TGF-β1 mRNA表達(dá)隨著結(jié)扎時(shí)間延長，UUO模型組Smad3與TGF-β1 mRNA表達(dá)逐漸升高(P<0.05)，假手術(shù)組各時(shí)間點(diǎn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；同一時(shí)間UUO模型組Smad3、TGF-β1 mRNA表達(dá)率均高于假手術(shù)組(P<0.05)。見表3。

2.4Smad3、TGF-β1與RIF指數(shù)相關(guān)性分析UUO模型組Smad3、TGF-β1與RIF指數(shù)呈正相關(guān)(r=0.564，0.735；P<0.05)，TGF-β1與Smad3呈正相關(guān)(r=0.673，P<0.05)。

表1　兩組不同時(shí)間RIF指數(shù)

表2　兩組不同時(shí)間腎組織Smad3及TGF-β1蛋白表達(dá)比較

表3　兩組不同時(shí)間腎組織Smad3、TGF-β1 mRNA表達(dá)比較

3　討　論

RIF的發(fā)病機(jī)制是正常腎間質(zhì)和腎小管結(jié)構(gòu)被大量聚集的細(xì)胞外基質(zhì)所代替而造成，如Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原、纖維連接蛋白、層黏連蛋白等，細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)由成纖維細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞等細(xì)胞合成和分泌,其中成纖維細(xì)胞是沉積ECM的主要來源，在RIF中發(fā)揮著重要作用。RIF可導(dǎo)致腎功能損害，其治療方法主要是抑制纖維細(xì)胞活性及ECM合成，刺激ECM降解〔4〕。腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化與腎臟纖維化的關(guān)系密切〔5〕，但從腎小管上皮細(xì)胞線粒體氧化損傷介導(dǎo)細(xì)胞死亡方面探討腎小管解離參與RIF進(jìn)展機(jī)制研究較少。

Smads家族蛋白在將TGF-β信號(hào)從細(xì)胞表面受體傳導(dǎo)至細(xì)胞核的過程中起到關(guān)鍵性作用，不同Smad介導(dǎo)不同TGF-β家族成員的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)〔6～8〕。TGF-β作為配體形成的受體復(fù)合物〔9〕，通過激活Smads進(jìn)入核內(nèi)，共同激活或抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄〔7〕，本研究結(jié)果說明隨著結(jié)扎時(shí)間的延長，腎臟纖維化程度逐漸加重。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，隨著梗阻時(shí)間延長，TGF-β1與Smad3表達(dá)異常，推測(cè)TGF-β1與Smad3的高表達(dá)與RIF的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。TGF-β1與Smad3間存在協(xié)同作用，說明TGF-β1/Smad3信號(hào)通路在RIF的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，這與任韞卓等〔10〕的研究結(jié)果類似。

1蘇麗娜,覃遠(yuǎn)漢,周添標(biāo),等.轉(zhuǎn)化生長因子-β1/Smad3信號(hào)通路在腎間質(zhì)纖維化大鼠腎臟組織中的表達(dá)和作用〔J〕.實(shí)用兒科臨床雜志,2011;26(5):325-8.

2崔曉影.烏司他丁對(duì)大鼠腎間質(zhì)纖維化中TGF-β/Smads信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的干預(yù)作用〔D〕.哈爾濱：哈爾濱醫(yī)科大學(xué),2011.

3雷強(qiáng).田七注射液對(duì)阿霉素腎纖維化大鼠的CTGF/TGF-β1/Smads信號(hào)通路的影響〔D〕.桂林：廣西中醫(yī)藥大學(xué),2012.

4劉俊英.Smad2/3在大鼠腎間質(zhì)纖維化中的表達(dá)及促紅細(xì)胞生成素的保護(hù)作用〔D〕.哈爾濱：哈爾濱醫(yī)科大學(xué),2010.

5李素仙.活性維生素D3對(duì)UUO大鼠腎間質(zhì)TGF-β1/Smads信號(hào)軸核酸表達(dá)的影響〔D〕.太原：山西醫(yī)科大學(xué),2013.

6王文文.溫莪術(shù)對(duì)腎間質(zhì)纖維化大鼠腎臟TGF-β1/Smad信號(hào)通路及結(jié)締組織生長因子的影響〔D〕.上海：上海中醫(yī)藥大學(xué),2013.

5Wang Y,Lin C,Ren Q,etal.Astragaloside effect on TGF-β1,SMAD2/3,and SMA expression in the kidney tissues of diabetic KKAy mice〔J〕.Int J Clin Exp Pathol,2015;8(6):6828-34.

6Wang Y,Wang B,Du F,etal.Epigallocatechin-3-gallate attenuates unilateral ureteral obstruction-induced renal interstitialfibrosis inmice〔J〕.J Histochem Cytochem,2015;63(4):270-9.

7Hamzeh MT,Sridhara R,Alexander LD.Cyclic stretch-induced TGF-β1 and fibronectin expression is mediated by β1-integrin through c-Src-and STAT3-dependent pathways in renal epithelial cells〔J〕.Am J Physiol Renal Physiol,2015;308(5):F425-36.

8Samarakoon R,Helo S,Dobberfuhl AD,etal.Loss of tumour suppressor PTEN expression in renal injury initiates SMAD3-and p53-dependent fibrotic responses〔J〕.J Pathol,2015;236(4):421-32.

9Overstreet JM,Samarakoon R,Cardona-Grau D,etal.Tumor suppressor ataxia telangiectasia mutated functions downstream of TGF-β1 in orchestrating profibrotic responses〔J〕.FASEB J,2015;29(4):1258-68.

10任韞卓,郝軍,史永紅,等.TGF-β1激活smad信號(hào)通路影響人腎小管上皮細(xì)胞增殖與凋亡〔J〕.重慶醫(yī)學(xué),2007;36(20):2079-2081,封2,插1.

〔2015-10-23修回〕

(編輯郭菁)

廈門市科技局科技計(jì)劃惠民項(xiàng)目(No.3502Z20144068)

黃繼義(1963-)，男，主任醫(yī)師，主要從事腎內(nèi)科疾病研究。

R693.4

A

1005-9202(2016)18-4433-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.18.013