馮　莉　范志松　?！§n　韓　晶　王玉棟　左　靜　周欣亮　王貴英

(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，河北　石家莊　050011)

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miRNA-141在老年直腸癌患者中的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系

馮莉范志松常靚韓晶王玉棟左靜周欣亮王貴英1

(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，河北石家莊050011)

目的探討miRNA-141在直腸癌中的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系。方法75例直腸癌患者以及正常體檢者40例納入本次研究，收集受試者直腸癌組織及癌旁正常組織，抽取直腸癌患者及正常體檢者肘靜脈血，應(yīng)用實(shí)時聚合酶鏈法檢測75例直腸癌樣本中miRNA-141的表達(dá)，分析直腸癌和血液miRNA-141表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果①直腸癌患者外周血和直腸癌組織miR-141的表達(dá)水平均較正常體檢者顯著降低(P<0.01)；② 直腸癌組織和外周血miRNA-141表達(dá)與腫瘤分期、腫瘤分化程度和有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.01)。結(jié)論miRNA-141可能參與直腸癌發(fā)生、發(fā)展，其低表達(dá)可能與直腸癌的分化和轉(zhuǎn)移有關(guān)。

微小RNA；直腸癌

腫瘤與細(xì)胞增殖、分化、凋亡調(diào)控異常密切相關(guān)。微小RNA(miRNA)是由20～25個核苷酸組成的非編碼小RNA，可抑制miRNA 的翻譯，并誘導(dǎo)miRNA的切割降解，參與細(xì)胞分裂、增殖、分化等生物學(xué)過程，具有著類似癌基因和抑癌基因的功能，在腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展過程中發(fā)揮著重要作用〔1,2〕。本文對直腸癌患者血清和癌組織miRNA-141的表達(dá)進(jìn)行檢測，旨在研究miRNA-141在直腸癌中的作用。

1　材料與方法

1.1臨床資料2014年1～12月在本院普通外科收治的初診直腸癌患者75例納入本次研究。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡≥60歲；(2)所有患者均經(jīng)過組織病理學(xué)確診；(3)未經(jīng)放療或化療治療。75例患者中男43例(57.33%)、女32例(42.67%)；年齡60～72歲，平均(65.26±6.52)歲；腫瘤直徑2.4～7.3 cm，平均(4.63±1.58)cm；腫瘤TNM分期Ⅰ期13例(17.33%)、Ⅱ期31例(41.33%)、Ⅲ期24例(32.00%)、Ⅳ期7例(9.34%)；黏膜下層浸潤46例(61.33%)、黏膜層浸潤29例(38.67%)；距肛緣距離≥5 cm 40例(53.33%)，距肛緣距離<5 cm 35例(46.67%)；高度分化16例(21.33%)、中度分化23例(30.67%)和低度分化36例(48.00%)；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移31例(41.33%)、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移44例(58.67%)。按照年齡和性別配比選取同期在本院體檢中心健康體檢正常的受試者40例作為對照組，年齡60～75歲，平均(66.45±5.96)歲；男22例(55.00%)、女18例(45.00%)。兩組受試者年齡和性別均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。本研究得到本院倫理委員會批準(zhǔn)，并且所有受試者均簽署知情同意書。

1.2主要試劑mirVanaTMPARISTM miRNA 試劑盒，美國Applied Biosystems提供；FAST1000試劑盒，北京先鋒生物公司提供；Affymetrix 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，由美國Qiagen 公司提供；Micrornas Real-time PCR Assay kit，由北京艾德萊生物科技公司；miRNA-141及內(nèi)參U6引物設(shè)計與合成由北京艾德萊生物科技公司提供，miRNA-141的引物序列5'- CCGGTAACACTGTCTGGTAA-3'，內(nèi)參U6的引物序列為5'- GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'。

1.3主要儀器紫外可見分光光度儀，德國Eppendorf公司提供；ABI step one熒光定量PCR儀，美國ABI公司提供；GeneGenius全自動凝膠成像系統(tǒng)，美國Syngene公司。

1.4方法提取受試者外周血和直腸標(biāo)本的RNA，采用實(shí)時聚合酶鏈法(RT-PCR)測定直腸病理組織。

1.4.1RNA提取抽取受試者空腹肘靜脈血5 ml，室溫下靜置30 min，待血液完全凝固后離心分離血清。取血清采用mirVanaTMPARISTM miRNA試劑盒提取總RNA。直腸組織RNA提取采用FAST1000試劑盒進(jìn)行。稱取100 mg直腸癌組織或癌旁正常組織并加入裂解液，研磨，吸取裂解液后加入氯仿進(jìn)行混勻，離心，加入聚合液并轉(zhuǎn)移至內(nèi)套管，洗脫液洗脫2次，高速離心，將內(nèi)套管移入EP內(nèi)，膜中央加洗脫液RNase-free H2O，靜置，離心，即得。所得RNA 經(jīng)紫外分光光度法測定濃度，吸光度A260 nm/A280 nm為1.8 ～ 2.1的RNA樣品于-80℃保存。

1.4.2RT-PCR采用Affymetrix one-cycle cDNA Synthesis Kit，以總RNA為模板，采用miR-141 特異性逆轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得cDNA。逆轉(zhuǎn)錄條件：16℃ 30 min；42℃ 30 min；85℃ 5 min。將逆轉(zhuǎn)錄所得cDNA純化后應(yīng)用Micrornas Real-time PCR Assay kit在ABI step one熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)總體積為20 μl∶1.5 μl cDNA 模板，1 μl miR-141或U6引物，10 μl miRNA qPCR Mix，7.5 μl H2O。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性3 min，然后94℃ 20 s、60℃ 20 s和72℃ 40 s，40 個循環(huán)。以U6 為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt計算miR-141 的相對定量表達(dá)水平。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理使用SPSS13.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析及χ2檢驗(yàn)。

2　結(jié)　果

2.1miR-141的表達(dá)直腸癌患者直腸癌組織miR-141表達(dá)水平(5.13±0.62)較癌旁正常組織(8.67±0.95)顯著降低(t=27.025，P=0.000)；直腸癌患者外周血miR-141水平(3.54±0.44)較正常體檢者(6.24±0.76)顯著降低(t=20.409，P=0.000)。

2.2miR-141表達(dá)與直腸癌臨床病理關(guān)系的單因素分析直腸癌組織和血液miR-141表達(dá)與年齡、性別、腫瘤直徑、浸潤程度、距肛緣距離無明顯相關(guān)性(P>0.05)；但是隨著患者腫瘤分期增大，直腸癌組織和血液miR-141表達(dá)降低(P<0.01)；隨著患者腫瘤分化程度降低，直腸癌組織和血液miR-141表達(dá)降低(P<0.01)；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者較無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者直腸癌組織和血液miR-141表達(dá)降低(P<0.01)。見表1。

表1　miR-141表達(dá)與直腸癌臨床病理特征的關(guān)系±s)

3　討　論

miRNA是一系列廣泛存在于動、植物中與基因表達(dá)調(diào)控相關(guān)的非編碼小分子單鏈RNA〔3〕。miRNA為單股、長20～24 個核苷酸短序列，3′端可以有1～2個堿基的長度變化。近年來研究表明，在人類基因組中大約有900 多種獨(dú)特的miRNA，并且1/3的基因由miRNAs 調(diào)控〔4〕。miRNA使mRNA的3'UTR區(qū)域完全或不完全配對來執(zhí)行對靶基因的切割或者翻譯的抑制功能，從而調(diào)節(jié)基因的表達(dá)〔5,6〕。miRNAs 在人類及動物的各種生理及病理過程中起重要作用，它們可以參與控制一些生物過程，包括細(xì)胞生長、凋亡、發(fā)育、新陳代謝、壓力調(diào)適、激素信號通路和分化等〔7〕。miRNAs 可以根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)及不同的靶基因來決定作為癌基因或者抑癌基因，其可在多種癌癥的診斷、預(yù)后及治療中發(fā)揮重要作用〔8〕。miRNA-141是miRNA家族的成員，通過調(diào)節(jié)不同的信號通路，在生理狀態(tài)和疾病發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。miR-141 與子宮癌、前列腺癌、肝細(xì)胞肝癌、腎透明細(xì)胞癌及子宮內(nèi)膜癌等的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)〔9,10〕。但是關(guān)于miR-141在直腸癌發(fā)病中的作用尚不完全明確。

本研究結(jié)果提示miR-141與直腸癌的發(fā)生有一定關(guān)系，血漿miR-141水平與患者短期生存率密切相關(guān)，并且可獨(dú)立作為結(jié)直腸癌預(yù)后的指標(biāo)〔11〕。

1Lam TK，Shao S，Zhao Y，etal.Influence of quercetin-rich food intake on microRNA expression in lung cancer tissues〔J〕.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2012;21(12)：2176-84.

2Kroh EM，Parkin RK，Mitchell PS，etal.Analysis of circulating microRNA biomarkers in plasma and serum using quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR)〔J〕.Methods，2010;50(4)：298-301.

3Small EM，F(xiàn)rost RJ，Olson EN，etal.MicroRNAs and new dimension to cardiovascular diseases〔J〕.Circulation，2010;121(18)：1022-121.

4Kim VH，Han J，Siomi MC.The Biogenesis of small RNAs in animals〔J〕.Nat Rev Mol Cell Biol，2009;10(2)：126-39.

5Davalos V，Esteller M.MicroRNAs and cancer epigenetics：a macroevolution〔J〕.Curr Opin Oncol，2010;22(1)：35-45.

6Lin PY，Yu SL，Yang PC.MicroRNA in lung cancer〔J〕.Br J Cancer，2010;103(8)：1144-8.

7Gangaraju VK，Lin H.MicroRNAs：key regulators of stem cells〔J〕.Nat Rev Mol Cell Biol，2009;10(2)：116-25.

8Iorio MV，Croce CM.MicroRNAs in cancer:small molecules with a Huge impact〔J〕.J Clin Oncol，2009;27(34):5848.

9Lee TS，Jeon HW，Kim YB，etal.Aberrant mircroRNA expression in endometrial carcinoma using formalin-fixed paraffin-embedded(FFPE)tissues〔J〕.PLoS One，2013;8(12)：e81421.

10Gonzales JC，F(xiàn)ink LM，Goodman Jr OB，etal.Comparison of circulating MicroRNA 141 to circulating tumor cells，lactate dehydrogenase，and prostate- specific antigen for determining treatment,the response in patients with metastatic prostate cancer〔J〕.J Clin Genitourin Cancer，2011;9 (1)：39-45.

11Cheng H，Zhang L，Cogdell DE，etal.Circulating plasma MiR-141 is a novel biomarker for metastatic colon cancer and predicts poor prognosis〔J〕.PLoS One，2011;6(3)：e17745.

〔2015-11-13修回〕

(編輯李相軍)

河北省衛(wèi)生廳醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題(No.20150769)

王貴英(1969-)，女，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事消化道腫瘤研究。

馮莉(1982-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事消化道腫瘤研究。

R735.2

A

1005-9202(2016)18-4498-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.18.046

1河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院外二科