郭泰春，雷新明，李飛云，王國(guó)英，史高峰

（蘭州理工大學(xué)，甘肅　蘭州　730050）

甘草次酸對(duì)自由基清除作用的電化學(xué)研究

郭泰春，雷新明，李飛云，王國(guó)英，史高峰

（蘭州理工大學(xué)，甘肅蘭州730050）

研究了應(yīng)用電化學(xué)分析方法測(cè)定甘草次酸對(duì)自由基的清除作用。用石墨烯修飾玻碳電極，建立了一種應(yīng)用石墨烯修飾玻碳電極的電化學(xué)方法測(cè)定甘草次酸及其對(duì)·OH（羥基），O2·-（超氧），ROOH（脂質(zhì)過氧）自由基的清除作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：甘草次酸的檢出限為2.24×10-3g/L，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為8.94%（n=5）。同時(shí)，甘草次酸對(duì)3種自由基均具有清除作用，清除能力大小為：O2·-＞ROOH＞·OH，清除率與濃度呈良好的線性關(guān)系。該方法具有易于操作、靈敏度好、檢出限低以及價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)。

甘草次酸；自由基；石墨烯；修飾電極；清除能力；線性關(guān)系

在正常的人體生理代謝過程中，人體本身的防御體系可以保持體內(nèi)氧自由基的平衡［1～3］，但在機(jī)體產(chǎn)生病變、紫外線照射、化學(xué)毒物及藥物影響、電離輻射等，此時(shí)自由基的平衡體系受到破壞［4］，從而引發(fā)機(jī)體自由基穩(wěn)衡態(tài)紊亂，產(chǎn)生多余自由基，進(jìn)而引發(fā)心臟病、動(dòng)脈粥樣硬化、癌癥等嚴(yán)重疾病并加速衰老過程［5～7］。由于化學(xué)合成的抗氧化劑存在致癌、毒副作用等安全問題，因而，天然抗氧化劑是減輕細(xì)胞氧化損傷、預(yù)防相關(guān)疾病等最有效措施［8，9］。而甘草次酸是目前較有代表意義的抗衰老中藥活性成分，具有抗心律失常和抗缺氧、抗炎、抗免疫、抗腫瘤和抗氧化等作用。

石墨烯是一種新型碳材料，其碳原子緊密堆積成單層二維蜂窩狀晶格結(jié)構(gòu)，具有高比表面和優(yōu)異的電化學(xué)性能，高化學(xué)物理穩(wěn)定性以及生物相容性等性質(zhì)，被用于超靈敏傳感器和電化學(xué)傳感器等領(lǐng)域［12～13］。

自由基的檢測(cè)方法有：鄰苯三酚自氧化法、化學(xué)發(fā)光測(cè)定、熒光分光光度法、電子自旋共振技術(shù)與自旋捕捉法、氣相色譜法等已有報(bào)道。這些檢測(cè)體系重現(xiàn)性差，儀器復(fù)雜，操作繁瑣，分析時(shí)間長(zhǎng)［14］。因此本文用石墨烯修飾玻碳電極檢測(cè)甘草次酸對(duì)自由基的清除作用的研究未見文獻(xiàn)報(bào)道，該方法具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1實(shí)驗(yàn)材料與儀器

所有實(shí)驗(yàn)均在CHI660B電化學(xué)工作站（上海辰華儀器有限公司）中進(jìn)行，采用三電極系統(tǒng)，其中玻碳電極（Φ=3mm）作為工作電極，甘汞電極為輔助電極，鉑片電極為對(duì)電極。電熱蒸餾水器（北京科偉永興儀器有限公司），超聲波清洗器（KQ5200DE，北京科偉永興儀器有限公司）。微量移液器（上海求精生化試劑儀器有限公司）。鐵氰化鉀（天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司），甘草酸單銨鹽（實(shí)驗(yàn)室自制），石墨烯懸浮液（實(shí)驗(yàn)室自制），氧化鋁粉末（0.05μm，美國(guó)GaossUnion公司）。

1.2電極處理

玻碳電極先后在1500#，2000#金相砂紙上打磨，完后用蒸餾水清洗電極表面。接著在麂皮上撒上少量Al2O3，然后滴加少量的蒸餾水，用玻碳電極上絕緣的部分稍微攪勻。直到電極表面呈鏡面，在鐵氰化鉀溶液中掃描循環(huán)伏安曲線。氧化還原峰電位之差ΔEp在80mV以下，電極方可使用。本實(shí)驗(yàn)所測(cè)ΔEp=79mV。然后在打磨好的電極上滴加一定量的石墨烯懸浮液，在通風(fēng)處風(fēng)干數(shù)小時(shí)后待用。

1.3甘草次酸制備

稱量12g甘草酸單銨鹽，溶于100mL8%的硫酸溶液中，100℃下反應(yīng)12h，得到7.5g灰白色甘草次酸粗品，水洗直至pH不再變化，50℃下干燥后，溶于氯仿中，煮沸10min，趁熱過濾，濃縮，50℃下干燥。將以上甘草次酸粗品溶于80%的乙醇溶液中，80℃下保溫，待懸浮物基本溶解，冰水浴析出沉淀，過濾，干燥，得到0.8g含量為91.59%（HPLC）精制甘草次酸。

1.4自由基的配制

羥基自由基（·OH）：稱取0.3g七水硫酸亞鐵晶體，定容至100mL容量瓶中，標(biāo)為A液。精確稱取0.05g30%的雙氧水，定容至50mL容量瓶中，標(biāo)為B液。A、B液均在0～4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

脂質(zhì)過氧自由基（ROOH）：：稱取0.3g卵磷脂溶于30mL磷酸鹽緩沖溶液（G，50mm/mol，pH7.4）中，冰水浴2h，標(biāo)為C液。取0.01g氯化鐵，定容至50mL容量瓶中，0.01g抗壞血酸，定容至50mL容量瓶中，分別標(biāo)記為D、E液，0～4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

超氧自由基（O2·-）：稱取0.01g核黃素，用70%甲醇溶解定容至10mL容量瓶中，標(biāo)為F液。稱取0.02g甲硫氨酸，定容至50mL容量瓶中標(biāo)為H液。0～4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5自由基清除實(shí)驗(yàn)

自由基產(chǎn)生體系和產(chǎn)生條件見表1，分別設(shè)置對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。反應(yīng)原理如下：

羥基自由基（·OH）：雙氧水與亞鐵離子反應(yīng)生成·OH，即H2O2+Fe2+→·OH+H2O+Fe3+，由于·OH活性高［15］，存活時(shí)間太短，用儀器很難檢測(cè)到，因此在反應(yīng)體系中加入抗氧化劑（捕捉劑）能有效捕捉· OH，起到一定的清除作用。

脂質(zhì)過氧自由基（ROOH）：Fe3+與抗壞血酸誘導(dǎo)脂質(zhì)體過氧化，即ROOH+Fe3+→ROO·+H++Fe2+。

超氧自由基（O2·-）：參照Beauchamp的光化學(xué)方法［16］，即在還原劑甲硫氨酸存在下，核黃素分子吸收一個(gè)光子被還原，在O2條件下，自氧化產(chǎn)生O2·-。

表1　自由基反應(yīng)體系

2　結(jié)果與討論

2.1甘草次酸的電化學(xué)行為

在50mmol/LPBS（磷酸鹽緩沖溶液pH7.4），掃描速率為100mV/s，電勢(shì)范圍為-0.4～0.8V，富集時(shí)間為30s的條件下，加入一定量的甘草次酸溶液，記錄氧化峰電流和氧化峰電位。如圖1所示為修飾電極和裸電極分別測(cè)定甘草次酸的線性掃描伏安行為。結(jié)果表明：甘草次酸在裸玻碳電極上（圖1a）出現(xiàn)了1個(gè)弱的氧化峰，Epa為0.33V，而在相同緩沖液和測(cè)定條件下樣品在石墨烯修飾玻碳電極上（圖1b）的氧化峰電流明顯增大，說明石墨烯修飾玻碳電極對(duì)甘草次酸產(chǎn)生了電催化氧化作用。

圖1　甘草次酸在裸玻碳電極（a），修飾電極（b）上的線性掃描伏安圖

2.2線性范圍、檢出限

在上述緩沖溶液和測(cè)定條件下，用石墨烯修飾電極測(cè)定了不同濃度的甘草次酸的線性掃描伏安行為，濃度范圍為0.016-0.08g/L。如圖2所示（上）表示不同濃度下甘草次酸的電化學(xué)行為，由圖可知隨著濃度的不斷增加，甘草次酸的峰電流不斷增加，在濃度為0.016-0.08g/L（a-f）的范圍內(nèi)呈良好的線性范圍，如圖2（下）所示，線性回歸方程為：Ip（μA）=2c（g/L）+6.08，R2=0.995，檢出限為2.24×10-3g/L，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為8.94%（n=5）。見表2為甘草次酸的含量測(cè)定結(jié)果與加樣回收率。

圖2　（上）表示不同濃度下甘草次酸的線性掃描伏安曲線，（下）表示甘草次酸濃度與峰電流的線性關(guān)系

表2　甘草次酸樣品的測(cè)定結(jié)果

2.3甘草次酸對(duì)自由基的清除作用

甘草次酸對(duì)·OH，O2·-，ROOH自由基的清除效果，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組線性掃描伏安曲線如圖3所示，在甘草次酸的出峰位置Ep=0.33V處實(shí)驗(yàn)組峰電流小于對(duì)照組峰電流，說明實(shí)驗(yàn)組的一部分甘草次酸用于清除自由基，證明甘草次酸對(duì)自由基具有清除作用。其清除效果見表3。由表3數(shù)據(jù)可知，甘草次酸對(duì)3種自由基的清除效果為O2·-＞ROOH＞· OH。清除率計(jì)算公式如下：

圖3　甘草次酸對(duì)自由基清除作用的線性掃描伏安曲線，b表示對(duì)照組，a表示實(shí)驗(yàn)組

配制2、4、6、8、10ug/mL的甘草次酸樣品，測(cè)定其對(duì)自由基清除效果的線性伏安行為。圖4為甘草次酸對(duì)自由基清除率與濃度的關(guān)系，由圖可知甘草次酸對(duì)O2·-自由基的清除能力最強(qiáng)，對(duì)ROOH和· OH的清除能力次之。

圖4　甘草次酸對(duì)3種自由基的清除作用與濃度關(guān)系

表3　甘草次酸對(duì)自由基的清除率數(shù)據(jù)表

3　結(jié)語

皮膚的衰老和色斑的沉積都與自由基有著密切的關(guān)系，而大多數(shù)合成類藥物具有毒性且具有副作用，因此有必要尋找合適的天然抗氧劑來對(duì)抗和清除自由基。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，具有清除氧自由基的作用的中藥有效成分甘草次酸，將作為抗皺、美白等化妝品的主要成分，具有發(fā)展?jié)摿?。本文建立了石墨烯修飾電極的電化學(xué)分析方法測(cè)定了甘草次酸對(duì)·OH、ROOH、O2·-自由基的電化學(xué)行為，這種方法具有成本低、靈敏度高、且易于操作等優(yōu)點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果滿意。

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