蔣俊青,顧安康

(天津中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院 1.皮膚科;2.病科理，天津300120)

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miRNA-210在尋常型銀屑病皮損中的表達研究

蔣俊青1,顧安康2

(天津中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院 1.皮膚科;2.病科理，天津300120)

目的探討miRNA-210在尋常型銀屑病皮損中的表達情況及影響。方法收集臨床銀屑病患者的皮損組織和健康皮膚組織，經過速凍后提取miRNA。采用Stemp-loop技術反轉錄miRNA，采用RealtimePCR技術檢測miRNA的表達，采用絕對定量方法計算miRNA-210的拷貝濃度。免疫組化法對尋常型銀屑病皮損組織及正常皮膚組織中RUNX3蛋白的表達結果進行對比分析，并分別記錄。結果RealtimePCR顯示miRNA-210在尋常型銀屑病患者組皮損中表達量較健康組皮膚顯著降低(P<0.01)；免疫組化結果顯示RUNX3蛋白表達陽性率，尋常型銀屑病患者皮損中顯著高于健康組皮膚(P<0.05)。結論尋常型銀屑病患者皮損中miRNA-210顯示為低表達，其可能通過調節(jié)靶基RUNX3，參與銀屑病發(fā)病環(huán)節(jié)。

尋常型銀屑??；miRNA-210；基因表達

(Chin J Lab Diagn,2016,20:1466)

銀屑病的發(fā)病機制一直未完全闡明，近年來，表觀遺傳學在其發(fā)病機制中的研究得到重視。有研究發(fā)現(xiàn)某些特定miRNA在銀屑病的發(fā)病中起著重要作用[1]，通過檢測miRNA-210在尋常型銀屑病皮損中的表達，以期探討銀屑病的發(fā)病機制。

1　資料與方法

1.1臨床資料

所取皮損組織標本來自本院皮膚科門診已確診的28例尋常型銀屑病患者，其中男12例，女16例，平均年齡40.5(6-75)歲。對照組皮膚組織來自整形外科手術切除的26例健康皮膚組織，其中男11例，女15例，平均年齡42.5(8-77)歲。將已取皮膚組織凍存于液氮中待用。兩組實驗者除銀屑病之外的其他自身條件差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

1.2儀器與試劑

總RNA抽提試劑Trizol由西安融智生物技術有限公司提供、miRNA-210特異性引物由百奧邁科生物技術有限公司提供、蛋白質抽提試劑盒由上海名勁生物科技有限公司提供、miScriptSYBRGreenPCRkit等試劑及儀器由南京奧多福尼生物科技有限公司提供。

1.3方法

1.3.1檢測miRNA-210的表達將凍存組織碾碎，應用相關試劑提取總RNA后，然后應用上述反轉錄試劑盒將剛提取的RNA反轉錄為cDNA，詳細步驟按照儀器及試劑說明進行操作。用Real-timePCR檢測并對比28例尋常型銀屑病患者和26例健康對照的miRNA-210表達水平。

1.3.2檢測RUNX3蛋白表達采用免疫組化EnVision法檢測尋常型銀屑病皮損組織和健康組織中RUNX3的表達。對兩組組織病理切片進行顯微鏡觀察分析，并對結果進行分級評分，評分標準參考病理指標。計算切片著色程度及著色陽性細胞所占比例得分，并將兩者乘積作為最后的得分，得分≧4分者為陽性，計算陽性率并進行統(tǒng)計學分析。

2　結果

2.1miRNA-210的表達水平

Real-timePCR實驗結果顯示尋常型銀屑病患者皮損與正常組織相比，miRNA-210的表達顯著降低(P<0.01)。見表1。

表1　皮損與正常皮膚組織miRNA-210表達情況

2.2RUNX3蛋白表達水平

免疫組化結果顯示：尋常型銀屑病患者皮膚組織RUNX3蛋白表達水平明顯高于正常皮膚組，差異具有統(tǒng)計學意義(χ2值=24.36，P<0.05)，見表2。

表2　皮損與正常皮膚組織RUNX蛋白3表達情況

3　討論

銀屑病的發(fā)病機制，目前多認為是多種因素相互影響作用導致的，包括感染、代謝、遺傳、免疫和環(huán)境因素[1]。表觀遺傳學在銀屑病的發(fā)病機制中起著重要作用，其中包括非編碼小RNA(如miRNA)的調控等[2]。miRNAs是人體種類最多的調節(jié)基因，占人類基因組的1%-5%，控制約30%的蛋白質編碼基因的表達，目前為止，發(fā)現(xiàn)的miRNA種類就有上千種。miRNA主要是通過與mRNA的3`端非編碼區(qū)結合進而抑制翻譯或引發(fā)mRNA降解，阻遏基因轉錄后的翻譯過程，對細胞代謝等多個環(huán)節(jié)產生影響。有研究表明miRNAs在銀屑病的發(fā)展中起著重要的調節(jié)作用[3]，miRNA-203是銀屑病中第一個被發(fā)現(xiàn)的miRNA，研究證實其表達具有組織特異性，在皮膚中的表達明顯高于其他組織器官，而在在銀屑病患者皮損處表達又顯著高于正常皮膚。miRNA-203靶基因為細胞因子通路抑制因子3(suppressorofcytokinesignaling3,SOCS-3)[4]，SOCS-3對表皮角質形成細胞的增殖分化有重要調節(jié)作用，SOCS-3是信號轉導及轉錄激活因子3(singaltransduserandactivatoroftranscription,STAT3)通路的負性調節(jié)因子，可抑制STAT3的活化，而STAT3信號通路激活是導致銀屑病皮損發(fā)生的重要機制之一，而miRNA-203表達上調使得STAT3信號通路持久性激活，引起皮膚銀屑樣變，但miRNA在銀屑病皮損高表達的機制以及如何調控靶基因表達的機制仍待進一步的研究。有研究[5]通過基因芯片技術篩選出一些銀屑病相關差異性表達的miRNA，如miRNA-21、miRNA-203a、miRNA-146a、miRNA-125b等，這些miRNA已被證實在銀屑病皮損組織中表達，參與調控銀屑病基因調控，進而增加皮損的炎癥反應和角質形成細胞的增生。

我們通過real-timePCR技術，證實了miRNA-210在尋常型銀屑病患者皮損中相對于健康皮膚組織顯著表達下調。對miRNA-210靶基因查找發(fā)現(xiàn)，RUNX3可能是其潛在靶基因?，F(xiàn)已在銀屑病發(fā)病的免疫分子學中發(fā)現(xiàn)Th1細胞異?；罨纱龠M炎性因子的釋放和炎癥放大，使得炎癥反應持續(xù)發(fā)生和角質形成細胞異常增殖分化，最終導致銀屑病的皮損出現(xiàn)。有研究[6]發(fā)現(xiàn)由Th1細胞分泌的細胞因子IL-2、INF-γ均高表達于銀屑病患者血清及皮損，而WongWF等[7]發(fā)現(xiàn)RUNX3可促使CD4+T細胞向Th1細胞分化，并將促進上述細胞因子分泌。綜上，RUNX3參與銀屑病皮損的發(fā)生，并在其中起到一定的作用。另外，我們比較了尋常型銀屑病患者皮損組織中的RUNX3蛋白表達陽性率，結果顯著高于健康皮損組，且發(fā)現(xiàn)miRNA-210的表達水平和RUNX3蛋白水平呈負相關，證實miRNA-210 可以作用于RUNX3基因，通過對基因的調節(jié)在轉錄后水平上抑制RUNX3的蛋白表達，而具體的調節(jié)機制需要進一步深入研究。

[1]陳春麗,劉新梅,普雄明，等.微RNA在銀屑病中差異表達的研究進展[J].醫(yī)學綜述,2016,(3):443.

[2]KooistraSM,HelinK.Molecularmechanismsandpotentialfunctionsofhistonedemethylases[J].NatRevMolCellBiol,2012,13(5):297.

[3]禹歡歡,王曉華,蔡碧珊,等.銀屑病相關miRNAs表達的研究進展[J].皮膚性病診療學雜志,2015,(3):258.

[4]XiaJ,JoyceCE,BowcockAM,etal.NoncanonicalmicroRNAsandendogenoussiRNAsinnormalandpsoriatichumanskin[J].HumMolGenet，2013,22(4):737.

[5]楊志波,唐雪勇.銀屑病差異表達microRNA與靶基因及基因功能調控網絡的研究[J].中國中西醫(yī)結合皮膚性病學雜志,2012,11(2):69.

[6]HeJ,WuJ,XuN,etal.MiR-210disturbsmitoticprogressionthroughregulatingagroupofmitosis-relatedgenes[J].NucleicAcidsRes,2013,41(1):498.

[7]WongWF,KohuK,ChibaT,SatoT,SatakeM.InterplayoftranscriptionfactorsinT-celldifferentiationandfunction:theroleofRunx[J].Immunology,2011,132(2):157.

StudyontheexpressionofmiRNA-210intheskinlesionsofpsoriasisvulgaris

JIANG Jun-qing,GU An-kang.

(Department of Dermatology,the Affiliated Hospital of Tianjin Traditional Chinese Medicine Research Institute,Tianjin 300120,China)

ObjectiveToexploretheexpressionofmiRNA-210inthelesionsofpsoriasisandtheinfluenceofthedisease.MethodsTheskintissueofclinicalpatientswithpsoriasisandthehealthywerecollected.ThemiRNAwasextractedbyusafterquick-frozen.TheStemp-looptechnologywasusedtoreversetranscriptionofmiRNAandRealtimePCRtevhniquewasappliedtoidentitytheexpressionofmiRNA.ThestandardcurveshouldbemadeandthemiRNA-210copiesofconcentrationbecalculatedbyabsolutequantitativemethod.Thet-testwasusedtocomparethedifferencebetweenpsoriaticskinlesionstissuesandthenormalskintissues,andAp-valuelessthan0.05wasconsideredstatisticallysignificant.TheexpressionofRUNX3inthetwotissuegroupsweredeterminedwithimmunohistochemicalmethod.ResultsRealtimePCRshowedthattheexpressionofmiRNAinpatientswithpsoriasisvulgarisgroupsdecreasedsignificantlycomparedwiththenormalgroups(P<0.05).TheresultsofimmunohistochemistrydemonstratedthattheexpressionofRUNX3proteininskinlesionsofpatientswithpsoriasisvulgarisweresignificantlyhigherthanthatnormalskin(P<0.05).ConclusionLowerexpressionofmiRNA-210wasdetectedinthelesionsofpatientswithpsoriasisvulgaris.ThemiRNA-210mayeffectonitstargetgenesRUNX3andthenplayaroleintheonsetofpsoriasis.

psoriasisvulgaris;microRNA-210;geneexpression

1007-4287(2016)09-1466-03

R758.63

A

2015-09-08)