路　明，劉恒昌，李艷麗

(1.吉林市中心醫(yī)院 基本外科，吉林 吉林132000； 2.吉林大學(xué)白求恩第一醫(yī)院 胃結(jié)直腸肛門外科；3.吉林省疾病預(yù)防控制中心)

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Lgr-5的表達(dá)與Ⅲ期直腸癌患者新輔助放化療結(jié)合直腸癌根治術(shù)與預(yù)后的關(guān)系

路明1，劉恒昌2，李艷麗3*

(1.吉林市中心醫(yī)院 基本外科，吉林 吉林132000； 2.吉林大學(xué)白求恩第一醫(yī)院 胃結(jié)直腸肛門外科；3.吉林省疾病預(yù)防控制中心)

近年來我國直腸癌的發(fā)病率顯著上升，其病死率在所有惡性腫瘤中位居第三，且發(fā)病呈年輕化趨勢(shì)。目前對(duì)于直腸癌的治療，仍以手術(shù)切除為主，但由于直腸癌發(fā)病部位較深，且周圍解剖結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜，不易徹底切除，而新輔助放化療可以將手術(shù)切除困難，或無法行手術(shù)切除的病灶變?yōu)榭汕谐齕1]。但在臨床工作中發(fā)現(xiàn)不同患者對(duì)于新輔助放化療后行直腸癌根治術(shù)的效果不盡相同。近年來，有文獻(xiàn)報(bào)道富含亮氨酸重復(fù)單位的G蛋白偶聯(lián)受體5(Lgr-5)的高表達(dá)可能會(huì)影響新輔助放化療并行直腸癌根治術(shù)的療效[2]。本次研究著重探討Lgr-5的表達(dá)與Ⅲ期直腸癌患者新輔助放化療結(jié)合直腸癌根治術(shù)預(yù)后的關(guān)系，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1　材料與方法

1.1一般資料隨機(jī)選取2007年至2009年，吉林市中心醫(yī)院基本外科收治的中、下段直腸癌Ⅲ期的患者103例，其中男64例，女39例，年齡45-73歲，平均年齡(51.4±7.7)歲，中段直腸癌(腫瘤下緣距肛緣大于8 cm且小于11 cm)49例，下段直腸癌(腫瘤下緣距肛緣≤8 cm)54例，行腹部會(huì)陰直腸癌切除術(shù)(Miles術(shù))者58例，行經(jīng)腹部直腸切除吻合術(shù)(Dixon術(shù))者45例。病理分型：高分化38例，中分化42例，低分化23例。組織類型：非粘液癌82例，粘液癌21例。解剖形態(tài)：浸潤型11例，潰瘍型34例，隆起型58例。所有患者均經(jīng)直腸鏡取病灶組織做病理組織活檢確診為直腸癌；所有患者均按照2010年美國癌癥聯(lián)合委員會(huì)(AJCC)和國際抗癌聯(lián)盟(UICC)制定的結(jié)直腸癌TNM分期進(jìn)行分期，其中Ⅲa期16例，Ⅲb期69例，Ⅲc期18例。排除標(biāo)準(zhǔn)：① 其它器官伴發(fā)腫瘤者；② 曾接受過放化療治療者；③ 重要器官(如肝、腎等)功能不全者；④ 曾使用過Notch抑制劑者；⑤ 發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者。所有患者均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1免疫組織化學(xué)法(S-P法) Lgr-5抗體選用兔抗人Lgr-5多克隆抗體(PAB2591，亞諾法生技股份有限公司)，SP試劑盒購自上海寶曼生物科技有限公司，按試劑盒說明書操作。

1.2.2結(jié)果判定方法[3]選取400倍鏡下4個(gè)互不重疊的視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，并數(shù)出染色的細(xì)胞數(shù)量，計(jì)算染色細(xì)胞所占比例。Lgr-5主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，為黃色或棕黃色顆粒。每例標(biāo)本由三位專家獨(dú)立審閱，并以兩位或兩位以上專家一致意見為最終結(jié)果。根據(jù)細(xì)胞染色比例，將結(jié)果分為：陰性(-)：<5%；弱陽性(+)：5%-50%；強(qiáng)陽性(++)：>50%。規(guī)定此次研究Lgr-5低表達(dá)為染色細(xì)胞比例≤50%，高表達(dá)為染色細(xì)胞比例>50%。

1.2.3治療方法所有患者術(shù)前均對(duì)骨盆野前后2野垂直照射，每次劑量1.8Gy，每周5次，治療5周，共50Gy。與此同時(shí)行化療，化療可選方案：① 奧沙利鉑聯(lián)合希羅達(dá)方案(即XELOX)；② 伊立替康聯(lián)合5-FU/CF方案(即FOLFIRI)； ③ 奧沙利鉑聯(lián)合5-FU/CF(即FOLFOX)，治療8周。完成新輔助放化療后，休息8周，根據(jù)病情選擇Miles術(shù)或Dixon術(shù)。

1.2.4隨訪方法所有患者術(shù)后隨訪，前2年每3個(gè)月進(jìn)行電話隨訪一次，后3年每6個(gè)月進(jìn)行電話隨訪一次，隨訪終點(diǎn)為患者死亡或隨訪結(jié)束(2014年12月31日)。

2　結(jié)果

2.1Lgr-5在直腸癌組織中的表達(dá)情況103例直腸癌患者中，Lgr-5陰性(-)有32例(31.07%)，弱陽性(+)有43例(41.75%)，強(qiáng)陽性(++)有28例(27.18%)，即Lgr-5低表達(dá)有75例(72.82%)，高表達(dá)有28例(27.18%)。Lgr-5在直腸癌組織中的染色情況見圖1。

圖1　Lgr-5在直腸癌組織中的表達(dá)(×400)

2.2Lgr-5的表達(dá)與臨床資料的關(guān)系直腸癌組織中Lgr-5的表達(dá)與年齡、性別、腫瘤部位、病理類型、組織學(xué)類型以及解剖類型均不存在顯著差異(P>0.05)。見表1。

表1　Lgr-5的表達(dá)與臨床資料的關(guān)系

2.3Lgr-5的表達(dá)與直腸癌復(fù)發(fā)的關(guān)系在隨訪過程中75例Lgr-5高表達(dá)患者中，有14例(18.67%)發(fā)生復(fù)發(fā)，28例Lgr-5低表達(dá)患者中，有5例(17.86%)發(fā)生復(fù)發(fā)，兩者不存在顯著差異(P>0.05)；但是Lgr-5高表達(dá)患者的復(fù)發(fā)時(shí)間要顯著短于Lgr-5低表達(dá)患者的復(fù)發(fā)時(shí)間(P<0.05)。見表2。

表2　Lgr-5的表達(dá)與直腸癌復(fù)發(fā)的關(guān)系[n,(%)]

2.4Lgr-5的表達(dá)與生存分析本次隨訪103例患者，中途失訪或因其他原因死亡者17例，全部未完成至少5年隨訪，隨訪成功率為83.50%，其中11例為Lgr-5低表達(dá)患者，6例為Lgr-5高表達(dá)患者，失訪者不計(jì)入最終結(jié)果。本次隨訪的平均隨訪時(shí)間為56.8個(gè)月，中位時(shí)間為66.0個(gè)月(3-110個(gè)月)。64例Lgr-5低表達(dá)患者的五年生存率為89.06%(57/64)，22例Lgr-5高表達(dá)患者的五年生存率為59.09%(13/22)。Lgr-5低表達(dá)患者的五年生存率顯著高于Lgr-5高表達(dá)患者的五年生存率(P<0.05)。見圖2。

圖2　Lgr-5的表達(dá)與生存分析

3　討論

本次研究發(fā)現(xiàn)，直腸癌患者中，Lgr-5低表達(dá)的患者居多(72.82%)，但Lgr-5陽性表達(dá)率較高(68.93%)，這與Liu等人的研究結(jié)果相似[4]。這提示直腸癌的發(fā)生可能與腫瘤干細(xì)胞有關(guān)，因?yàn)長gr-5已經(jīng)被證實(shí)是腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)志物，而Carmon的研究結(jié)果表明，結(jié)腸癌組織中Lgr-5的表達(dá)顯著高于正常黏膜組織[5]。說明Lgr-5參與了直腸癌早期的改變，這可能與Lgr-5導(dǎo)致腸黏膜的快速更新，促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞形成有關(guān)[6]。本次研究發(fā)現(xiàn)直腸癌組織中Lgr-5的表達(dá)差異與年齡、性別、腫瘤部位、病理類型、組織學(xué)類型以及解剖類型均不存在顯著差異，這與Shen的研究結(jié)果一致[7]。這提示Lgr-5可能是獨(dú)立于各項(xiàng)臨床資料和病理學(xué)資料的。但Ramanathan在腸息肉中發(fā)現(xiàn)了Lgr-5的表達(dá)，說明Lgr-5與直腸癌的發(fā)病有關(guān)，并且可以早期觀察直腸癌進(jìn)展的指標(biāo)[8]。本次研究將Lgr-5免疫組化染色>50%規(guī)定為Lgr-5高表達(dá)，≤50%為低表達(dá)，對(duì)兩組患者的復(fù)發(fā)情況進(jìn)行了跟蹤，發(fā)現(xiàn)兩組患者的總復(fù)發(fā)率不存在顯著差異(P=1.000)，但Lgr-5高表達(dá)復(fù)發(fā)的患者有約85%在24個(gè)月內(nèi)復(fù)發(fā)，顯著高于Lgr-5低表達(dá)復(fù)發(fā)的患者(20%)。這提示Lgr-5的表達(dá)可以作為預(yù)測(cè)Ⅲ期直腸癌新輔助化療聯(lián)合手術(shù)治療患者預(yù)后的標(biāo)志。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是腸干細(xì)胞(intestinal stem cells，ISCs)的迅速增殖造成的。ISCs位于結(jié)腸隱窩基底部的潘氏細(xì)胞之間，控制結(jié)腸黏膜上皮的再生，而Takahashi等人在研究中發(fā)現(xiàn)ISCs中Lgr-5呈現(xiàn)高表達(dá)，并且對(duì)于Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)尤其敏感[9]。而Kano發(fā)現(xiàn)Lgr-5高表達(dá)的ISCs壽命顯著長于Lgr-5低表達(dá)的ISCs，并且呈持續(xù)增殖狀態(tài)，并分化成為不同的上皮細(xì)胞類型[10]。這可能是造成Lgr-5高表達(dá)患者復(fù)發(fā)時(shí)間較短的原因。本次研究對(duì)所有患者進(jìn)行了生存情況的隨訪調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Lgr-5低表達(dá)患者的五年生存率為89.06%(57/64)，Lgr-5高表達(dá)患者的五年生存率為59.09%(13/22)，Lgr-5低表達(dá)患者的五年生存率顯著高于Lgr-5高表達(dá)患者的五年生存率(P<0.05)。這提示新輔助放化療聯(lián)合手術(shù)治療對(duì)于Lgr-5低表達(dá)的Ⅲ期直腸癌患者的療效較為顯著，而對(duì)于Lgr-5高表達(dá)的患者則不是十分理想[11]。說明Lgr-5是一個(gè)影響Ⅲ期直腸癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素。而Daniela利用RT-PCR檢測(cè)新輔助放化療后患者直腸癌組織中Lgr-5基因的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)Lgr-5基因高表達(dá)的患者，其無病生存率較短[12]，與本次研究結(jié)果相似。

綜上，Lgr-5高表達(dá)是影響新輔助放化療聯(lián)合手術(shù)治療的Ⅲ期直腸癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素，Lgr-5高表達(dá)的Ⅲ期直腸癌患者復(fù)發(fā)時(shí)間較短，五年生存率較低。

[1]Saigusa S,Inoue Y,Tanaka K,et al.Significant correlation between LKB1 and LGR5 gene expression and the association with poor recurrence-free survival in rectal cancer after preoperative chemoradiotherapy[J].Journal of Cancer Research and Clinical Oncology,2013,139(1):131.

[2]Saigusa S,Inoue Y,Tanaka K,et al.Clinical significance of LGR5 and CD44 expression in locally advanced rectal cancer after preoperative chemoradiotherapy[J].International journal of oncology,2012,41(5):1643.

[3]Deng Y,Zhou J,Fang L,et al.ALDH1 is an independent prognostic factor for patients with stages II-III rectal cancer after receiving radiochemotherapy[J].The British journal of cancer,2014,110(2):430.

[4]Liu Z,Dai W,Jiang L,et al.Over-expression of LGR5 correlates with poor survival of colon cancer in mice as well as in patients[J].Neoplasma:Journal of Experimental and Clinical Oncology,2014,61(2):177.

[5]Carmon KS,Gong X,Lin Q.et al.R-spondins function as ligands of the orphan receptors LGR4 and LGR5 to regulate Wnt/β-catenin signaling[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2011,108(28):11452.

[6]Kobayashi S,Yamada-Okabe H,Suzuki M,et al.LGR5-positive colon cancer stem cells interconvert with drug-resistant LGR5-negative cells and are capable of tumor reconstitution[J].Stem Cells,2012,30(12):2631.

[7]Shen WW,Zeng Z,Zhu WX.MiR-142-3p functions as a tumor suppressor by targeting CD133,ABCG2,and Lgr5 in colon cancer cells[J].J Mol Med(Berl),2013,91(8):989.

[8]Ramanathan V,Jin G,Westphalen C B,et al.P53 gene mutation increases progastrin dependent colonic proliferation and colon cancer formation in mice[J].Cancer investigation,2012,30(4):275.

[9]Takahashi H,Ishii H,Nishida N,et al.Significance of Lgr5(+ve) cancer stem cells in the colon and rectum.[J].Annals of surgical oncology,2011,18(4):1166.

[10]Kano Y,Tsuchiya K,Zheng X,et al.The acquisition of malignant potential in colon cancer is regulated by the stabilization of Atonal homolog 1 protein[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,2013,432(1):175.

[11]Fan YY,Davidso LA,Callaway ES,et al.Differential effects of 2- and 3-series E-prostaglandins on in vitro expansion of Lgr5+ colonic stem cells.[J].Carcinogenesis,2014,35(3):606.

[12]Hirsch D,Barker N,McNeil N,et al.LGR5 positivity defines stem-like cells in colorectal cancer.[J].Carcinogenesis,2014,35(4):849.

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2015-04-10)