高東梅,劉洪泉,金　鵬,于姝媛,王　蘋,杜　波

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科,吉林 長春130021)

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30例大前庭水管綜合征患者SLC26A4基因診斷與聽性腦干電位特性分析

高東梅,劉洪泉,金鵬,于姝媛,王蘋,杜波*

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科,吉林 長春130021)

大前庭水管綜合征(Largevestibularaqueductsyndrome,LVAS)是一種臨床常見的先天性內(nèi)耳畸形疾病，屬于常染色體隱性遺傳性非綜合征型聽力障礙性疾病，發(fā)病率占兒童和青少年感音神經(jīng)性聾的1%-12%[1]。主要表現(xiàn)為波動性和進(jìn)行性感音神經(jīng)性聽力下降，發(fā)病年齡可以從出生后至青春期的任何年齡段。目前臨床診斷主要是顳骨高分辨率薄層CT掃描、SLC26A4基因突變篩查和聽性腦干電位檢測。本文收集了我科門診經(jīng)顳骨CT掃描證實為LVAS的患者，通過聽力學(xué)檢測及耳聾基因芯片檢測，比較分析SLC26A4基因突變和腦干電位(ABR)檢測在LVAS臨床診斷過程中的特異性。

1　材料和方法

1.1臨床資料

檢測對象為2012年3月-2014年3月在吉林大學(xué)第一醫(yī)院耳鼻咽喉科就診，經(jīng)顳骨CT掃描證實為LVAS的患者30例，年齡5.5-28歲，不伴有其他臨床癥狀和體征。所有受檢者在進(jìn)行基因檢測前均已簽署知情同意書。

1.2純音測聽和聽覺腦干電位檢測

純音聽閾測試:檢查在隔聲室內(nèi)進(jìn)行,應(yīng)用AC40型純音聽力計測試純音聽閾。ABR檢測使用GSI-Audera聽覺誘發(fā)電位儀，短聲刺激，頻率為20次/秒，疊加1000次。ER-3A型插入式耳機(jī)。紐扣式電極,記錄置于發(fā)際,鼻根為地極,參考分別置于雙側(cè)乳突。記錄ABRI、III和V波潛伏期和V波反應(yīng)閾。聽力損失分級根據(jù)1997年WHO制訂的標(biāo)準(zhǔn)判定。

1.3耳聾易感基因芯片檢測

取患兒外周靜脈血，EDTA-Na2抗凝處理，采用TIANampBloodDNAKit按說明書操作分離全基因組DNA?；蛐酒瑱z測采用遺傳性耳聾基因檢測芯片試劑盒(北京博奧生物工程公司)，按說明書操作。首先針對9個突變位點的9組引物分成兩個反應(yīng)體系分別進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后PCR產(chǎn)物加熱至95℃變性5min，加入到10μl雜交緩沖液，將混合液加到芯片的點樣區(qū)域，加蓋玻片,封閉雜交盒,50℃預(yù)熱雜交箱中保溫1h。雜交結(jié)束后取出芯片，搖床洗滌2min，置入離心機(jī)中以1 200r/min離心2min甩干。使用晶芯LuxScanTM10K/B微陣列芯片掃描儀以90的激光掃描強(qiáng)度和532nm激發(fā)波長進(jìn)行芯片掃描，相應(yīng)軟件系統(tǒng)判讀雜交信號并進(jìn)行結(jié)果分析,對信號不清的樣本，異地雙盲法驗證。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，采用χ2檢驗，McNemar檢測，P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1耳聾基因芯片檢測結(jié)果

采用晶芯耳聾九項，檢測LAVS患者SLA26A4 基因最常見的2個突變位點，IVS7-2A>G和 2168A>G。 30例受檢患兒中，耳聾基因突變陽性的有28例，占93.3%，其中SLC26A4基因純合和復(fù)合突變?yōu)?5例，單雜合13例。見圖1，具體患者基因表型見表1。

圖1　SLA26A4基因IVS 7-2 A>G 和 2168 A>G突變雜交圖表1　30例PDS患者ASNR和基因突變分析

編號發(fā)病年齡聽力損失(L/R)ASNR(L/R)PDS基因型CT掃描(L/R)12345678910111213141516171819202122232425262728293023出生出生342312371224511出生出生67433541122重度/重度重度/重度重度/重度重度/重度中度/中度中度/重度中度/重度重度/中度中度/重度中度/重度中度/中度重度/重度重度/中度重度/中度重度/中度中度/重度中度/中度重度/重度重度/重度重度/重度重度/中度重度/中度重度/中度重度/重度重度/重度重度/重度重度/中度重度/重度重度/重度輕度/輕度+/++/+-/--/+-/-+/++/++/-+/++/++/+-/--/--/+-/+-/-+/++/++/++/+-/+-/--/+-/--/--/-+/++/++/+-/-IVS7-2A>GIVS7-2A>G/wtIVS7-2A>G/wtIVS7-2A>G/wtIVS7-2A>GIVS7-2A>GIVS7-2A>GIVS7-2A>G/wtIVS7-2A>G/wt2168A>G/IVS7-2A>GIVS7-2A>G/wtIVS7-2A>G/wt2168A>G/IVS7-2A>G2168A>G/IVS7-2A>GIVS7-2A>G/wtIVS7-2A>GwtIVS7-2A>GIVS7-2A>GIVS7-2A>G/wtIVS7-2A>GIVS7-2A>GIVS7-2A>GIVS7-2A>GIVS7-2A>GwtIVS7-2A>G/wtIVS7-2A>G/wtIVS7-2A>G/wt2168A>G/wt+/++/++/++/++/++/++/++/++/++/++/++/++/++/++/++/++/++/++/++/++/++/++/++/++/++/++/++/++/++/+

2.2聽覺腦干電位檢測聲誘發(fā)短潛伏期負(fù)反應(yīng)(ASNR)結(jié)果

聽性腦干反應(yīng)(ABR)在90dB聲強(qiáng)誘導(dǎo)出電位反應(yīng)波，根據(jù)潛伏期和振幅變化判斷負(fù)波相位置，確認(rèn)ASNR，見圖2箭頭所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，30例中20例患者，有34耳出現(xiàn)ASNR，見圖1，26耳陰性，ASNR陽性率為66.6%。

2.3SLC26A4基因突變與ASNR的相關(guān)性

對30例患者經(jīng)顳骨CT掃描證實為LVAS的患者行ABR和基因芯片檢測，耳聾基因芯片檢測的檢出率要高于ABR的ASNR特性。結(jié)果對比分析見表1， 30例患者，13例PDS基因呈雜合狀態(tài)，15例純合或復(fù)合雜合。2例PDS基因呈野生型。對2例PDS基因呈野生型患者進(jìn)行SLC26A4全基因測序分析結(jié)果顯示,1例1279T>C和2027T>A復(fù)合雜合,1例未見SLC26A4基因異常。20例ABR檢測引出ASNR，檢出率為66.6%。比較聽力損失程度和SLC26A4基因突變常見位點與ASNR引出的相關(guān)性，結(jié)果未見統(tǒng)計學(xué)差異。

A：正常人ABR檢測圖，B：LVAS患者的ABR檢測圖圖2　ABR檢測結(jié)果為ASNR

3　討論

大前庭水管綜合征在出生時多數(shù)患者聽力正常，在很長的一段時間內(nèi)以漸進(jìn)性出現(xiàn)聽力下降，誘因常與輕微顱外傷或氣壓性創(chuàng)傷有關(guān)，聽力學(xué)改變以感音神經(jīng)性耳聾和混合性聾為主。診斷前庭水管擴(kuò)大的金標(biāo)準(zhǔn)是影像學(xué)，顳骨高分辨CT顯示前庭水管外口寬度超過1.5mm即可診斷為大前庭水管綜合征。結(jié)合遺傳咨詢、聽力損失臨床特征和影像學(xué)結(jié)果，Everett等[2]提出大前庭水管綜合征是常染色體隱性遺傳病，SLC26A4基因突變是導(dǎo)致大前庭水管綜合征的遺傳學(xué)基礎(chǔ)。國內(nèi)外學(xué)者[3-5]的研究發(fā)現(xiàn)，SLC26A4基因具有突變熱點，且具有種族特異性，在亞洲人群IVS7-2A>G和2168A>G是常見突變熱點。我們通過分析30例患者基因芯片耳聾九項篩查的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SLC26A4基因突變陽性檢出28例，其中純合和復(fù)合突變?yōu)?5例，單雜合13例，根據(jù)隱性遺傳規(guī)律，致病基因純合和復(fù)合雜合突變可以確診，而單雜合突變不能進(jìn)行診斷，推測可能存在IVS7-2A>G和2168A>G突變位點以外的突變位點，表明SLC26A4基因是引起大前庭水管綜合征的常見基因。SLC26A4基因編碼的蛋白Pendrin是780個氨基酸構(gòu)成的跨膜蛋白，開放閱讀框架2 343bp，由21個外顯子組成。朱發(fā)梅等采用基因芯片聯(lián)合PCR產(chǎn)物直接測序的方法，在30例大前庭水管綜合征患者中，共檢出28例有SLC26A4基因突變(93.33%)。發(fā)現(xiàn)16種突變類型，其中ⅣS7-2A>G突變的發(fā)生率最高，其次為2168A>G。16種突變中有5種剪接點突變，9種錯義突變和2種無義突變，這些突變分布于SLC26A4基因的大多數(shù)外顯子和部分內(nèi)含子上[6]。另外大前庭水管綜合征可能存在其他的基因異常。Yang等[7]報道l例LVAS患者為SLC26A4和FOXI1復(fù)合雜合突變，說明了LVAS雙基因調(diào)控遺傳方式，F(xiàn)OXIl基因可能參與SLC26A4的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，導(dǎo)致LVAS疾病的發(fā)生。SLC26A4基因IVS7-2A>G和2168A>G是常見突變熱點，利用基因芯片可對LVAS進(jìn)行快速篩查，發(fā)現(xiàn)致病原因，但無法發(fā)現(xiàn)其它的突變位點，因此對基因芯片檢測發(fā)現(xiàn)SLC26A4基因突變單雜合的患者還需要進(jìn)行DNA測序和影像學(xué)檢查。

近年來國內(nèi)外研究者發(fā)現(xiàn)在聽性腦干反應(yīng)檢測中LVAS具有特征性表現(xiàn)。即在高刺激強(qiáng)度(≥90dBnHL)時出現(xiàn)負(fù)相波，潛伏期為3.26±0.57ms。Nong等[8]將此反應(yīng)稱為聲誘發(fā)短潛伏期負(fù)反應(yīng)。國內(nèi)郝劍萍等通過對大前庭水管綜合征與內(nèi)耳其他畸形的聽性腦干反應(yīng)特性進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LVAS組的ASNR檢出率為54%，而其他內(nèi)耳畸形未出現(xiàn)ASNR。王秋菊等觀察到75.7% 的LVAS出現(xiàn)ASNR[9-10]。我們對30例LVAS患者進(jìn)行常規(guī)ABR檢測發(fā)現(xiàn)ASNR陽性率為66.6%。進(jìn)一步證實ASNR是LVAS臨床聽力學(xué)特征性表現(xiàn),而且GJB2基因突變引起的DFNB1遺傳性耳聾未引出ASNR，認(rèn)為通過觀察ASNR是否引出可對LVAS進(jìn)行早期診斷。

我們將30例同時進(jìn)行基因芯片、ABR檢測和顳骨CT掃描的診斷資料匯總分析發(fā)現(xiàn)，50%(15例)患者SLC26A4基因突變呈純合或復(fù)合雜合，43%(13例)SLC26A4基因突變單雜合，推測可能存在IVS7-2A>G和2168A>G以外的其他突變位點。2例野生型，經(jīng)測序分析1例為1279T>C和2027T>A復(fù)合雜合，1例為野生型，可能存在其他的致病機(jī)制。其中1例CT掃描未出現(xiàn)前庭水管外口擴(kuò)大，但基因芯片顯示IVS7-2A>G突變純合，未納入結(jié)果分析，推測CT掃描陰性與掃描位置有關(guān)。30例LVAS病例10例未檢出ASNR，檢出率為66.6%。盡管LAVS病例并不是全部表現(xiàn)出ASNR，但出現(xiàn)ASNR的耳聾患者可高度懷疑為LVAS，迄今尚未在其他內(nèi)耳畸形的病例引出ASNR。

綜上所述，對出現(xiàn)LVAS臨床特征的病人，常規(guī)ABR檢測可以監(jiān)測聽力損失程度變化，判斷耳聾類型，通過是否引出ASNR，可初步判斷LVAS。進(jìn)一步明確病因還需要進(jìn)行SLC26A4基因突變檢測，而基因芯片因只包括常見的IVS7-2A>G和2168A>G突變熱點，可作為基因診斷的初篩手段，對于LVAS患兒，基因芯片診斷為雜合或野生型，父母希望生育第二個孩子，則必須進(jìn)行SLC26A4全基因測序，發(fā)現(xiàn)致病的突變位點，并對胎兒進(jìn)行產(chǎn)前診斷，才能有效避免耳聾出生。

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吉林省衛(wèi)計委科技項目(2014Z048)

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2015-01-19)