于福來，吳麗芬，龐玉新*，黃梅，張影波，孫懂華，李偉

(1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 熱帶作物品種資源研究所，海南 儋州 571737；2.海南九芝堂藥業(yè)有限公司，海南 海口 570311)

海南裸花紫珠中毛蕊花糖苷和木犀草苷含量分析

于福來1，吳麗芬1，龐玉新1*，黃梅1，張影波1，孫懂華1，李偉2

(1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 熱帶作物品種資源研究所，海南 儋州 571737；2.海南九芝堂藥業(yè)有限公司，海南 ?？?570311)

目的分析不同來源海南裸花紫珠中毛蕊花糖苷和木犀草苷含量變化，為裸花紫珠藥材質(zhì)量控制提供參考。方法采用HPLC法同時測定毛蕊花糖苷和木犀草苷含量，通過方差分析等方法比較不同產(chǎn)地、采收時間和儲存時間的裸花紫珠成分含量差異。結(jié)果29份不同來源海南裸花紫珠中毛蕊花糖苷和木犀草苷含量差異較大，其中毛蕊花糖苷變異系數(shù)為69.78%，木犀草苷變異系數(shù)為50.38%。毛蕊花糖苷含量受產(chǎn)地和儲存時間影響顯著(P<0.05)，而木犀草苷則受產(chǎn)地因素影響顯著(P<0.05)。9月到翌年1月，儋州裸花紫珠毛蕊花糖苷含量呈增加趨勢，而木犀草苷變化較小。此外，本研究所建立的HPLC測定方法簡便、快速、準(zhǔn)確。結(jié)論海南裸花紫珠藥材成分含量變化較大，產(chǎn)地、采收時間和儲存時間是影響藥材質(zhì)量的重要因素。

裸花紫珠；毛蕊花糖苷；木犀草苷；產(chǎn)地；采收時間；儲存時間

裸花紫珠CallicarpanudifloraHook.et Arn.為馬鞭草科紫珠屬植物，以其干燥葉片入藥，收載于《中華人民共和國藥典》1977年版[1]。具有止血散瘀、抗菌消炎之功效，是“裸花紫珠片、裸花紫珠分散片、裸花紫珠膠囊、裸花紫珠顆粒、裸花紫珠栓”等近20余種中成藥的主要原料。裸花紫珠是海南省的道地藥材之一，傳統(tǒng)以野生來源為主，近5年開始進行野生馴化栽培，藥材種植、采收以及儲存等缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。前期研究表明[2-7]，不同來源裸花紫珠藥材在化學(xué)成分含量上變化較大，同時缺少簡便、有效的測定方法，這使得裸花紫珠藥材質(zhì)量難于控制。

基于此，本研究在參考以往研究結(jié)果基礎(chǔ)上[3-7]，選擇并建立同時測定能夠代表裸花紫珠化學(xué)成分的毛蕊花糖苷和木犀草苷含量的方法，以此分析兩種成分在海南29份不同來源裸花紫珠中的變化，探討產(chǎn)地、采收時間以及儲存時間等因素對裸花紫珠化學(xué)成分影響，以期為今后裸花紫珠藥材質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 植物材料

試驗材料包括2013—2014年海南九芝堂藥業(yè)有限公司在海南省5個產(chǎn)地不同時期收集的19份樣品以及2014年9月后在海南儋州試驗基地動態(tài)采收樣品10份(詳見表1)。以上材料經(jīng)中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所龐玉新副研究員鑒定為裸花紫珠CallicarpanudifloraHook.et Arn.。

表1 不同來源裸花紫珠樣品

注：1～19號為九芝堂公司收集的樣品，20～29為儋州試驗基地同一地塊采收樣品

1.2 儀器與試藥

Waters1525液相色譜儀，Waters2487紫外檢測器，SartariusCPA225D電子分析天平，KQ-500DB型超聲儀，毛蕊花糖苷對照品(上海源葉生物科技有限公司，純度>98%)，木犀草苷對照品(上海源葉生物科技有限公司，純度>98%)，甲醇為色譜純，磷酸為分析純、水為娃哈哈純凈水。

2 方法

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性

Waters HPLC，色譜柱XTerra RP18(3.9 m×150 mm，5 μm)，流動相甲醇(A)-0.3%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫0～10 min，25% A，10～30 min，37% A，30～40 min，37～50% A，40～50 min，50～60% A，流速0.4 mL·min-1，檢測波長350 nm，柱溫30 ℃。毛蕊花糖苷、木犀草苷對照品和裸花紫珠供試品色譜圖見圖1。

2.2 對照品儲備液的制備

精密稱取對照品毛蕊花糖苷、木犀草苷適量，置10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度定容，制成1.245 mg·mL-1毛蕊花糖苷和0.157 3 mg·mL-1木犀草苷的混合對照品儲備液。

2.3 供試品溶液的制備

將裸花紫珠葉置電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中55～60 ℃干燥至恒重，粉碎過60目篩，稱取約2 g，精密稱定，置100 mL具塞錐形瓶中，精密加入50 mL 70%甲醇，密塞，稱定重量，超聲(頻率40 kHz、功率400 W)30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量。過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.4 線性關(guān)系的考察

精密量取混合對照品儲備液0.5、1、2、2.5、3 mL，分別置5 mL容量瓶中，加甲醇至刻度定容，以各對照品的峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，各對照品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)進行線性回歸?；貧w方程分別為：(1)毛蕊花糖苷：Y=37 000 000X-370 000，r=0.999 8，線性范圍0.12～0.73 mg·mL-1；(2)木犀草苷：Y=98 000 000X-190 000，r=0.999 9，線性范圍0.015～0.093 mg·mL-1。

2.5 精密度試驗

精密量取混合對照品儲備液1 mL，置5 mL容量瓶中，加甲醇至刻度定容，連續(xù)測定6次，計算毛蕊花糖苷、木犀草苷峰面積RSD分別為1.31%和1.28%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗

取同一批裸花紫珠6份，精密稱定，按2.3項下方法制備溶液，在2.1色譜條件下分別進樣測定，計算毛蕊花糖苷、木犀草苷含量RSD分別為0.70%和1.96%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取同一裸花紫珠樣品，精密稱定，按2.3項下方法制備溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h進行測定，計算毛蕊花糖苷、木犀草苷峰面積RSD分別為2.39%和0.17%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗

取已知含量的裸花紫珠樣品0.5 g，6份，精密稱定，分別加入毛蕊花糖苷、木犀草苷，按2.3項下方法制備溶液，依法測定，計算回收率，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率試驗結(jié)果(n=6)

2.9 樣品含量測定

取裸花紫珠樣品1 g，精密稱定，按2.3項下方法制備溶液，依法進樣測定。

注：1.毛蕊花糖苷;2.木犀草苷。A.對照品；B.裸花紫珠供試品圖1 對照品及供試品色譜圖

3 結(jié)果與分析

3.1 不同來源裸花紫珠中毛蕊花糖苷和木犀草苷含量基本統(tǒng)計量

通過對2013—2015年在海南收集的29份裸花紫珠樣品毛蕊花糖苷和木犀草苷含量測定統(tǒng)計結(jié)果如下(表3)。毛蕊花糖苷含量變化范圍在0.28%～5.57%，平均值2.293%，變異系數(shù)為69.78%。而木犀草苷含量變化范圍在0.03%～0.27%，平均值0.133%，變異系數(shù)為50.38%。說明海南裸花紫珠樣品主要成分含量變化較大，而29份樣品包含不同產(chǎn)地和不同采收時間等因素對其成分含量均可能產(chǎn)生影響。

表3 不同來源裸花紫珠主要成分含量基本統(tǒng)計量 (%)

3.2 不同產(chǎn)地、采收時間和儲存時間對毛蕊花糖苷和木犀草苷含量影響

產(chǎn)地和采收時間對藥材化學(xué)成分積累影響較大。通過比較不同產(chǎn)地、采收時間和儲存時間裸花紫珠中毛蕊花糖苷和木犀草苷含量可知(圖2)，不同產(chǎn)地間(4產(chǎn)地28份樣品)，毛蕊花糖苷和木犀草苷含量差異顯著(P<0.05)，其中對于毛蕊花糖苷含量，產(chǎn)地海口最高，白沙最低。對于木犀草苷含量，產(chǎn)地儋州最高，?？谧畹停徊煌瑑Υ鏁r間(2年27份樣品)，2014年采收樣品成分含量均高于2013年樣品，其中毛蕊花糖苷含量在兩個年份間差異極顯著(P<0.01)，說明毛蕊花糖苷量會隨著儲存時間的增加而降低；不同采收月份間(12個月29份樣品)，毛蕊花糖苷和木犀草苷含量變化相近，呈“降低-升高-降低-平緩”的趨勢，但月份間差異不顯著(2、3、6、7、8五個月份缺少重復(fù))。其中，6～9四個月份兩種成分含量均較低，可能與這段時間裸花紫珠處于花期有關(guān)。

由于產(chǎn)地儋州是對同一地塊的材料進行動態(tài)取樣(每半月一次)，所以單獨對儋州樣品月份間變化分析可知(圖3)，毛蕊花糖苷含量從9月到翌年1月間呈增加趨勢，而木犀草苷變化不大。從兩類成分含量的角度分析，在儋州裸花紫珠1月份采收較適宜。

圖2 不同產(chǎn)地、采收時間和儲存時間裸花紫珠主要成分對比

圖3 不同采收時間裸花紫珠主要成分含量變化(儋州)

4 討論

4.1 裸花紫珠藥材質(zhì)量控制指標(biāo)的選擇

裸花紫珠化學(xué)成分主要包括黃酮類、萜類、揮發(fā)油類及酚類等。近幾年關(guān)于裸花紫珠藥材或制劑質(zhì)控中常以總黃酮、毛蕊花糖苷、木犀草素、木犀草苷、連翹酯苷、熊果酸等一個或多個成分為指標(biāo)或是HPLC指紋圖譜[1-7]。但對于裸花紫珠藥材(入藥部位葉片)，其毛蕊花糖苷和木犀草苷的含量相對較高[4-5]，且能代表藥材中類黃酮類有效成分，所以同時測定這兩個成分對裸花紫珠藥材質(zhì)量方便有效控制十分必要。因此，本研究通過HPLC方法同時測定毛蕊花糖苷和木犀草苷兩個成分，所建立的方法簡便、快速、準(zhǔn)確。

4.2 海南裸花紫珠中毛蕊花糖苷和木犀草苷差異分析

本研究發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地間裸花紫珠毛蕊花糖苷和木犀草苷差異顯著，同時樣品儲存時間對毛蕊花糖苷影響顯著。不同月份間裸花紫珠成分變化較大，但由于部分月份的樣品缺少重復(fù)且變異較大，使得月份間差異不顯著。但從各月份平均值看，上半年(1～5月)成分含量平均高于下半年(6～12月)，這與劉幼嫻等[6]研究結(jié)果相似，分析可能由于上半年采收樣品為至少2年生植株，而下半年為1年生植株所致。所以研究采收期的同時，深入研究植株年齡與化學(xué)成分積累關(guān)系十分必要。

中藥化學(xué)成分積累受產(chǎn)地、采收時間等多種因素影響[8-9]。本研究僅對海南29份裸花紫珠不同采收時間和產(chǎn)地間的毛蕊花糖苷和木犀草苷進行了初步比較分析，樣品包含儲存時間、月份和產(chǎn)地等多個影響因素，而重復(fù)數(shù)量較少，致使某些平均值差異較大的組間差異不顯著(如不同月份間)。因此，如要全面了解采收時間和產(chǎn)地等因素對裸花紫珠藥材的影響，應(yīng)通過多年多地點栽培對比試驗，系統(tǒng)分析裸花紫珠化學(xué)成分和生物量積累規(guī)律，以便為裸花紫珠資源合理利用提供更全面的依據(jù)。

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SimultaneousDeterminationofActeosideandLuteolosideinCallicarpanudiflorafromHainanProvince

YUFulai1，WULifen1，PANGYuxin1*，HUANGMei1，ZHANGYingbo1，SUNDonghua1，LIWei2

(1.TropicalCropsGeneticResourcesInstitute，ChineseAcademyofTropicalAgriculturalSciences，Danzhou571737，China；2.HainanJiuzhitangPharmaceuticalCo，Ltd.,Haikou570311，China)

Objective：This study aims at analysing content variation of acteoside and luteoloside inCallicarpanudiflora from Hainan province，which provides a reference for theC.nudiflora quantity control.MethodThe content of acteoside and luteoloside were simultaneously determined by HPLC，and the ANOVA was used to analyze the content variance of 29 samplesC.nudiflora from Hainan province in different origins，harvest time and storage time.ResultThere were large differences between acteoside and luteoloside among the total 29 samples.The coefficients of variation(CVs)of acteoside and luteoloside content were 69.78% and 50.38%，respectively.The acteoside content was affected significantly by origin and storage time，and the luteoloside content was affected by origin significantly.The acteoside content presented a trend of increase from September to the following January in Danzhou，whereas the luteoloside content showed minor change.Moreover，the HPLC simultaneous determination method was simple，rapid and accurate.ConclusionThere were great variations of acteoside and luteoloside content inC.nudiflora from Hainan province，and origin.The harvest time and storage time were important factors for theC.nudiflora quantity.

Callicarpanudiflora；acteoside；luteoloside；origin；harvest time；storage time

2015-08-01)

海南省科技合作專項資金項目(KJHZ2015-15)；企業(yè)合作項目(PZS-JZT01)

*

龐玉新，副研究員，研究方向：中藥資源；Tel：(0898)23300268，E-mail：pyxmarx@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.8.012