吳迪，祁永華，李艷薇，張春蕾，王業(yè)秋，張寧，李建民

(黑龍江中醫(yī)藥大學 佳木斯學院 中藥部，黑龍江 佳木斯 154007)

歐前胡素治療黃褐斑作用機理研究△

吳迪，祁永華，李艷薇，張春蕾，王業(yè)秋，張寧，李建民*

(黑龍江中醫(yī)藥大學 佳木斯學院 中藥部，黑龍江 佳木斯 154007)

目的研究歐前胡素對人黑素瘤細胞(A375細胞)合成黑素的影響，探討白芷主要成分歐前胡素對黃褐斑治療作用機理。方法試驗分為空白對照組、雌二醇陽性對照組和歐前胡素濃度為1、10、20、40、60、80 μmol·L-1給藥組，用上述各組處理A375細胞，用MTT法、NaOH裂解法、多巴氧化法和RT-PCR法檢測A375細胞活性、黑素含量、酪氨酸酶(TYR)活性、酪氨酸酶相關(guān)蛋白-1、2(TRP-1、TRP-2)、MAPK通路細胞外信號調(diào)節(jié)酶1、2(ERK1、ERK2)以及氨基末端激酶2(JNK2)的信使RNA表達。結(jié)果陽性對照組對A375活性無影響(P>0.05)；歐前胡素濃度在40 μmol·L-1以上時，可導致A375細胞大量凋亡(P<0.01)；濃度在1～20 μmol·L-1時，對A375細胞黑素合成及TYR活性有明顯抑制作用(P<0.05或P<0.01)，濃度為20 μmol·L-1的歐前胡素對A375細胞TYR、TRP-1、TRP-2、ERK1、ERK2及JNK2的mRNA表達具有顯著抑制作用(P<0.05或P<0.01)。結(jié)論歐前胡素可通過抑制A375細胞中TYR活性或阻斷黑素合成信號的傳導，治療或預防黃褐斑。

歐前胡素；黃褐斑；黑素瘤細胞；白芷

隨著生活水平的提高，人們更注重容顏的保養(yǎng)，黃褐斑的出現(xiàn)對于愛美女性來說是不可容忍的“容顏殺手”。黃褐斑是局部皮膚過多沉積色素而產(chǎn)生淡黑色或淡褐色斑點。黃褐斑的產(chǎn)生主要由于患者病變部位黑素細胞中酪氨酸酶(TYR)活性增強，促進黑素合成速度加快，導致病變部位黑素多于正常皮膚，形成色斑[1]，因此抑制酪氨酸酶活性及其遺傳信息的表達是治療黃褐斑最行之有效的途徑。研究發(fā)現(xiàn)，白芷對黃褐斑的治療有較好的效果[2-3]，因其良好的黃褐斑治療效果和美容應用價值[4-5]，很多祛斑美白中藥方劑或化妝品都加入白芷，但現(xiàn)代藥學對其治療機理深入探究的報道較少。歐前胡素是白芷的有效成分[6-7]，本研究以其為目標成分，初步研究白芷對黃褐斑的治療機理。

1 材料

歐前胡素(上海士鋒生物技術(shù)有限公司，批號：20140506)；二甲基亞砜(DMSO，上海鼓臣生物有限公司，批號：14112502)；人黑素瘤細胞(上海拜力生物科技有限公司，批號：#14062513)；雌二醇(上海亦瑞生物技術(shù)有限公司，批號：20150112)；黑色素細胞培養(yǎng)基-2(MelM-2，上海睿安生物科技有限公司，批號：20140807)；JNK抑制劑(美國Selleck公司，批號：S130501)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京智杰方遠科技有限公司，批號：14072610W)；RT-PCR試劑盒(北京義翹神州生物技術(shù)有限公司，批號：A826KA5248)。

2 方法

2.1 分組

分為空白對照組：黑素瘤細胞 + MelM-2完全培養(yǎng)液，正常培養(yǎng)72 h；陽性對照組：黑素瘤細胞+雌二醇+MelM-2完全培養(yǎng)液，培養(yǎng)72 h；給藥組：黑素瘤細胞 + 歐前胡素 + MelM-2完全培養(yǎng)液，培養(yǎng)72 h，歐前胡素濃度設6個質(zhì)量濃度，分別為1、10、20、40、60、80 μmol·L-1。

2.2 黑素瘤細胞培養(yǎng)

2.2.1 96孔板培養(yǎng) 取對數(shù)生長期的A375細胞，經(jīng)消化后，接種于96孔板上，按照每孔5×104個細胞，接種100 μL細胞懸浮液，每組設6個復孔，在5% CO2、37 ℃、飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h，進行分組后繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

2.2.2 6孔板培養(yǎng) 取對數(shù)生長期的A375細胞，經(jīng)消化后，接種于6孔板上，按照每孔1×106個細胞，每孔3 mL細胞懸浮液，每組設4個復孔，在5% CO2、37 ℃、飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h，進行分組后繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

2.3 MTT法檢測細胞活性

96孔板在細胞培養(yǎng)結(jié)束前5 h時，各組每孔加入濃度為5 mg·mL-1的MTT 0.02 mL，繼續(xù)培養(yǎng)至設定時間。移去上清液，各孔加入DMSO 150 μL，37 ℃振蕩10 min。在酶標儀490 nm波長測定各孔的吸光度(OD)值，計算歐前胡素對黑素瘤細胞增殖抑制率。

2.4 黑素含量的測定

移去6孔板的培養(yǎng)液，用PBS、0.25%胰酶和MelM-2完全培養(yǎng)液清洗消化細胞，收集細胞懸液，4 ℃、1500 r·min-1離心4 min，去除上清液，加NaOH(1 mol·L-1)充分裂解，重懸96孔板中，每組設6個復孔，用酶標儀在490 nm處檢測吸光度值。

2.5 TYR活性的測定

清理各組96孔板，每孔加入1%的Triton X-100溶液，-80 ℃將細胞充分破碎，加入濃度為0.2%的左旋多巴，水浴37 ℃恒溫反應3 h，用酶標儀在490 nm處檢測吸光度值。

2.6 RT-PCR體外擴增測量TYR、TRP-1、TRP-2、ERK1、ERK2、JNK2 的mRNA 表達

按照Trizol使用說明書對各組6孔板總RNA進行提取，以此RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再以cDNA為模板進行體外擴增，其中以β-actin為內(nèi)參，引物序列見表1。擴增條件：94 ℃條件下預變性2 min、變性30 s，在各自退火溫度下退火40 s，退火溫度見表1，72 ℃延伸40 s，35個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。取10 μL擴增物，加到濃度為1.5%的瓊脂糖凝膠中，在100 V、30 min條件下進行電泳，得到凝膠板放入凝膠成像系統(tǒng)中攝像，觀察呈像結(jié)果，評價歐前胡素對細胞 TYR、TRP-1、TRP-2、ERK1、ERK2、JNK2 m RNA 表達的影響。

表1 PCR引物序列碼

2.7 數(shù)據(jù)處理方法

3 結(jié)果

3.1 歐前胡素對A375細胞活性的影響

雌二醇陽性對照組與空白對照組比較，結(jié)果沒有統(tǒng)計學差異(P>0.05)。6組不同濃度的歐前胡素與空白對照比較，質(zhì)量濃度在1～20 μmol·L-1，結(jié)果無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，提示A375細胞活性不受影響，此濃度范圍對A375細胞增長既沒有促進作用，亦沒有抑制作用；而濃度在40～80 μmol·L-1，結(jié)果有統(tǒng)計學差異(P<0.05或P<0.01)，具有統(tǒng)計學意義，提示此濃度范圍對A375細胞具有較強的毒性作用，致使A375出現(xiàn)凋亡情況，不適宜進行抑制機理研究。因此，接下來的實驗選用濃度為1～20 μmol·L-1。結(jié)果見表2。

表2 歐前胡素對A375細胞活性的影響結(jié)果

注：與空白對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；下同。

3.2 歐前胡素對黑素合成的影響

各實驗組與空白對照組比較，雌二醇陽性對照組結(jié)果具有統(tǒng)計學差異(P<0.01)，對黑素合成具有明顯的促進作用；歐前胡素組給藥濃度在1～20 μmol·L-1時，結(jié)果有統(tǒng)計學差異(P<0.05或P<0.01)，提示在此濃度范圍內(nèi)歐前胡素對黑素合成具有顯著抑制作用，并隨濃度增加抑制作用有增強趨勢。結(jié)果見表3。

3.3 歐前胡素對TYR活性的影響

各實驗組與空白對照組比較，陽性對照組結(jié)果具有統(tǒng)計學差異(P<0.01)，提示對TYR活性具有明顯的增強作用；歐前胡素組給藥濃度在1 ～20 μmol·L-1時，結(jié)果有統(tǒng)計學差異(P<0.05或P<0.01)，提示在此濃度范圍內(nèi)歐前胡素對TYR活性具有顯著抑制作用，并隨濃度增加抑制作用有增強趨勢。結(jié)果見表4。

表3 歐前胡素對黑素合成的影響結(jié)果

表4 歐前胡素對黑素瘤細胞TYR活性的影響結(jié)果

3.4 歐前胡素對細胞 TYR、TRP-1、TRP-2 mRNA表達的影響

在細胞 TYR、TRP-1、TRP-2 的信使RNA 表達中，比較歐前胡素組與陽性對照組和空白對照組對此信息傳遞的影響，歐前胡素明顯降低mRNA信息的表達(P<0.05或P<0.01)，具有很強的阻斷作用；陽性對照組明顯增強mRNA的表達(P<0.01)。結(jié)果提示質(zhì)量濃度為20 μmol·L-1的歐前胡素具有阻斷黑素瘤細胞的TYR、TRP-1、TRP-2mRNA 的表達作用。結(jié)果見表5。

表5 歐前胡素組對A375細胞 TYR、TRP-1、TRP-2 m RNA 表達影響的結(jié)果

3.5 歐前胡素對細胞 ERK1、ERK2、JNK2 mRNA表達的影響

在A375細胞TYR、TRP-1、TRP-2 mRNA表達中，比較歐前胡素組與陽性對照組和空白對照組對此信息傳遞的影響，歐前胡素組明顯降低這3種mRNA的表達(P<0.05或P<0.01)，具有較強的阻斷作用；陽性對照組對這3種mRNA的表達具有明顯的增強作用(P<0.01)。結(jié)果見表6。

表6 歐前胡素對A375細胞 ERK1、ERK2、JNK2 mRNA表達影響的結(jié)果

4 討論

黃褐斑主要是由于黑素增多集聚在皮膚表面，多分布在面部，表現(xiàn)為棕色或淺棕色斑點或斑片，女性多于男性，尤其妊娠后的女性。其發(fā)病原因尚不能完全確定，研究認為日光照射、家族遺傳史、內(nèi)分泌失調(diào)、服用避孕藥等都可能是誘發(fā)或加重黃褐斑的原因[8-10]。黃褐斑在皮膚內(nèi)部形成過程中，黑素細胞扮演著至關(guān)重要的角色，其主要功能是在多步酶的催化作用下合成黑素，黑素聚集最終形成斑點。其中最關(guān)鍵的酶為酪氨酸酶(TYR)，酪氨酸酶催化酪氨酸掌控黑素合成的起始步驟(或稱之為上游)，因此酪氨酸酶的活性和量決定了合成黑素的速度。在合成黑素時，與酪氨酸酶相關(guān)的蛋白有酪氨酸酶相關(guān)蛋白-1、2(TRP-1、TRP-2)，這兩種酶主要控制合成黑素途徑的下游[11-13]，決定黑素合成最終完成程度與速度。

黑素的合成不僅取決于TYR及其相關(guān)蛋白的含量和活性，還受雌性激素受體(ER)信號通路以及ER-MAPKs信號通路調(diào)節(jié)控制[14-15]，在MAPK 5個通路中，信號通路作用是細胞生長和分化調(diào)控，p38MAPK信號通路主要作用是調(diào)節(jié)炎癥與細胞凋亡等應激反應。因此，篩選藥物時，必須考慮TYR及其相關(guān)的蛋白和MAPK信號通路調(diào)節(jié)機理。本研究通過ERK1、ERK2和JNK等信號通路，進一步探討歐前胡素治療黃褐斑作用機理。

白芷為傘形科植物，性溫味辛，主要成分為香豆素類的歐前胡素、異歐前胡素和揮發(fā)油類。白芷提取物具有消炎鎮(zhèn)痛、抗菌、抗氧化、活血化瘀、保肝、抗光敏、除濕散風、美容的功能。近年來，人們重新深入地探索其在皮膚病方面的藥用價值，用其治療色素性疾病，如黃褐斑和白癜風等。有研究用復方白芷酊聯(lián)合鹵米松軟膏治療白癜風獲得了較好的效果[16-18]。研究發(fā)現(xiàn)，白芷能夠調(diào)節(jié)人體的微循環(huán)使之得到改善，促進皮膚新陳代謝速度，從而延緩皮膚衰老，同時可以減少色素組織中聚集過多的色素，淡化或消除面部色斑，對美白祛斑有較好的療效[19-21]。有研究表明[2，22-23]，白芷治療黃褐斑的作用機理是通過抑制酪氨酸酶活性和表達，阻斷酪氨酸合成黑素的通路，降低酪氨酸酶催化酪氨酸合成黑素的量。但所有研究成果并未指出白芷中具體哪種成分有此功效，有待進一步研究。歐前胡素是白芷提取物中最重要的成分之一，于靜等[24]發(fā)現(xiàn)，在紫外線照射下，能增強歐前胡素與蛋白質(zhì)中的酸性物質(zhì)反應，導致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，表明歐前胡素具有調(diào)控酪氨酸酶活性和表達的可能性。

本文以歐前胡素為目標成分，進一步探討白芷對黃褐斑的治療作用。本研究結(jié)果提示，歐前胡素在高劑量下直接導致黑素瘤細胞凋亡，低劑量時可以抑制TYR的活性和表達，降低黑素合成。抑制機理可能是歐前胡素抑制TYR、TRP-1、TRP-2 mRNA信息的表達，同時可能抑制MAPK信號通路中蛋白激酶ERK1、ERK2、JNK mRNA信息的表達，基因信息表達受阻，從而降低黑素的合成。因此，本研究從歐前胡素抑制TYR活性和表達探討白芷單一有效成分歐前胡素應用價值，為進一步研究如何應用白芷治療黃褐斑和白癜風提供了參考。

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ResearchonMechanismFunctionofImperatorinTreatingChloasma

WUDi，QIYonghua，LIYanwei，ZHANGChunlei，WANGYeqiu，ZHANGNing，LIJianmin*

(TraditionalChineseMedicineDepartment，JiamusiCollegeHeilongjiangUniversityofChineseMedicine，Jiamusi154007，China)

Objective：The study is aimed to research the influence of imperatorin on melanoma cell (A375 cells)，and explore mechanism function of the roots ofAngelicadahuricafor treatment of chloasma.MethodsIn experiment，control，estradiol and positive control，and experimental groups (concentration of imperatorin is 1，10，20，40，60，80 μmol·L-1) were divided to operate A375 cells.MTT method，NaOH pyrolysis，dopamine oxidation，and RT-PCR method were applied to test A375 cells activity，melanin content，tyrosine (TYR) enzyme activity，and RNA expression of tyrosinase related protein-1、2(TRP-1、TRP-2)，mark pathway extracellular signal regulating enzymes 1、2(ERK1、ERK2)and Jun N-Terminal Kinase 2(JNK2).ResultsThere existed no significance of A375 cells in positive control group(P>0.05).The concentration of imperatorin was above 40 μmol·L-1，a lots of A375 cells died(P<0.01).The concentration of imperatorin was 1-20 μmol·L-1，there was significant inhibiting effect on A375 cells melanoma cells synthesis and TYR activity.The concentration of imperatorin was 20 μmol·L-1，there was significant inhibiting effect on TYR、TRP-1、TRP-2、ERK1、ERK2 and mRNA of JNK2 in A375 cells(P<0.05 orP<0.01).ConclusionImperatorin can treat and prevent chloasma by inhibiting TYR activity in 375 cells or blocking melanin synthesis signal conduction

Imperatorin；chloasma；melanoma cells；Angelicadahurica

2016-04-18)

國家自然科學基金面上項目(81274035)；黑龍江省應用技術(shù)研究與開發(fā)計劃項目(PC13S15)

*

李建民，教授，研究方向：中藥藥效物質(zhì)基礎；Tel：(0454)6050395，E-mail：13258119@qq.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.8.009